C. elegans de aprendizaje positivo butanona, a corto plazo y largo plazo Ensayos de la memoria asociativa

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la memoria a corto y largo plazo de una asociación positiva aprendida entre alimento y el atrayente químico butano, utilizando C. elegans como modelo. Esto se logra primero mediante el ayuno durante una hora de gusanos adultos jóvenes sincronizados y bien alimentados.

A continuación, los gusanos se entrenan en presencia de alimento y butanona mediante condicionamiento masivo para la memoria asociativa a corto plazo, y mediante condicionamiento espaciado para la memoria asociativa a largo plazo. Después del condicionamiento, se mide la quimiotaxis hacia la butanona y se compara con la quimiotaxis de organismos no entrenados. Para estudiar la retención de la memoria, se obtienen resultados que muestran la duración de la memoria asociativa a corto y largo plazo de la asociación aprendida entre el alimento y la butanona, basándose en cambios en el índice de aprendizaje.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del envejecimiento cognitivo y las enfermedades, como qué vías genéticas son necesarias para la función neuronal durante el envejecimiento normal y en estados de enfermedades neurodegenerativas, y cómo se puede mejorar el aprendizaje y la memoria. Bajo condiciones de deterioro cognitivo, los gusanos se preparan utilizando métodos estándar en placas de medio de crecimiento alto de 100 milímetros, sembradas con un mililitro de E. coli OP50. Utilice adultos jóvenes a una densidad de aproximadamente 5.000 gusanos o menos por placa.

Recolecte los gusanos vertiendo suavemente tampón M nueve sobre la placa y agitando ligeramente para liberar los gusanos. Intente minimizar la agitación, ya que podría desprender bacterias no deseadas. A continuación, incline la placa y aspire la mezcla de tampón y gusanos desde la esquina.

Utilizando una pipeta P1000, transfiera los gusanos a un tubo cónico de 15 mililitros. Tenga cuidado de no pipetear los gusanos contra la pared del tubo si quedan gusanos en la placa.

Repita este paso de una a dos veces. Deje que los gusanos sedimenten en el fondo del tubo por gravedad. No se recomienda la centrifugación para obtener los mejores resultados.

Una vez sedimentados, elimine el sobrenadante por aspiración y lave con al menos tres a cuatro mililitros de tampón M nueve. Trabaje rápidamente para prevenir el ayuno. Repita este procedimiento dos veces para un total de tres lavados.

En este momento, se puede separar un grupo de gusanos para servir como el grupo ingenuo en los ensayos de quimiotaxis que se demostrarán más adelante; para preacondicionar los gusanos antes del entrenamiento, añada tres a cuatro mililitros de tampón M nueve al tubo y deje que los gusanos pasen hambre durante una hora a temperatura ambiente. Prepare las placas de acondicionamiento trazando dos microlitros de butano al 10 % en etanol al 95 % en el interior de las tapas de placas NGM de 60 milímetros que han sido sembradas con 500 microlitros de E. coli OP50. Retire el sobrenadante del tubo de gusanos en ayunas y utilice un pipetador P1000 para transferir entre 100 y 200 microlitros de gusanos a cada placa de acondicionamiento. Incube las placas de acondicionamiento a temperatura ambiente durante una hora tras el acondicionamiento.

Lave los gusanos de las placas con aproximadamente un mililitro de tampón M nueve y transfiera a un tubo cónico de 15 mililitros. Repita los métodos de lavado suave mostrados anteriormente hasta que el tampón parezca claro. Una vez lavados, se puede retirar un subconjunto de gusanos y probar en el ensayo de quimiotaxis para servir como el grupo de tiempo cero para el aprendizaje asociativo de una vez con mast, preparando placas que representen puntos de tiempo adicionales.

Transfiera de 100 a 200 microlitros de gusanos a placas NGM de 60 milímetros sembradas. Incube estas placas post-tratamiento durante 0,51 o dos horas a temperatura ambiente. Después de cada punto temporal, lave suavemente los gusanos de las placas hacia un tubo cónico de 15 mililitros y repita una o dos veces más.

Con tampón M nueve y siguiendo los mismos procedimientos suaves de lavado, se evalúa la memoria asociativa a corto plazo mediante el ensayo de quimiotaxis, el cual será demostrado posteriormente. Prepare las placas de acondicionamiento y los gusanos como se mostró para el entrenamiento a corto plazo, pero permita que los gusanos se incuben a temperatura ambiente durante solo 30 minutos. Después de la incubación, recolecte los gusanos como se indicó previamente.

Trasférjalos a placas NGM de 60 milímetros SIN SEMBRAR. Mantenga los gusanos en las placas sin sembrar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de que los gusanos estén en ayunas, lávelos con tampón M nueve y colóquelos nuevamente en el tubo cónico de 15 mililitros. Repita estos pasos hasta que se hayan completado un total de siete bloques de acondicionamiento y seis bloques de ayuno.

Una vez finalizado el acondicionamiento, lave los gusanos de las placas de acondicionamiento de vuelta a un tubo cónico. Como se mostró previamente, se puede utilizar un grupo de gusanos para probar el aprendizaje asociativo espaciado siete veces inmediatamente después del acondicionamiento. Transfiera la población restante de gusanos a placas HGM de 100 milímetros sembradas con un mililitro de OP50.

Una vez más, aplique de 100 a 200 microlitros de gusanos por placa para asegurar que haya suficientes bacterias que soporten la población. Incube las placas posteriores al acondicionamiento a 20 grados Celsius durante 1624 o 40 horas, representando los puntos de tiempo de memoria asociativa a largo plazo, para evaluar la memoria asociativa a largo plazo de la asociación conocida con el alimento butan. Lave suavemente los gusanos de las placas hacia un tubo cónico de 15 mililitros, y nuevamente, una o dos veces con tampón M nueve después de cada punto de tiempo y evalúe los gusanos en el ensayo de quimiotaxis.

Para preparar las placas para el ensayo de quimiotaxis, marque la parte inferior de placas NGM de 100 milímetros sin sembrar con puntos cerca del borde en tres ubicaciones como se muestra aquí. Aplique un microlitro de azida de sodio uno molar en los puntos de odorante y control. No más de 15 minutos antes de comenzar el ensayo, para minimizar la difusión de los agentes paralizantes.

A continuación, coloque un microlitro de etanol al 95 % y un microlitro de butanona al 10 % en los respectivos lugares marcados en la placa de ensayo. Encima del azida sódico previamente depositado. Retire la mayor cantidad posible del tampón M nueve del tubo con los gusanos sedimentados.

Utilice una pipeta P20 con una punta precortada para aplicar 15 microlitros de gusanos en tres intervalos de cinco microlitros cada uno en el origen de la placa de ensayo. A continuación, enrolle la esquina de una toalla Kim en una punta fina y úsela para absorber el exceso de tampón M nueve, teniendo cuidado de no perforar el agar.

La eliminación del exceso de tampón libera los gusanos en la placa de ensayo. Si se utiliza imagenología para contar los gusanos, una imagen del origen inmediatamente después de esta liberación proporcionará el número total de animales en una placa de ensayo. Incube la placa de ensayo de quimiotaxis durante una hora a temperatura ambiente tras la incubación, y cuente el número de gusanos en los puntos de origen, etanol y butanona, así como el número total de gusanos en la placa de ensayo.

Generalmente, los gusanos paralizados por el azida de sodio estarán dentro de un radio de un centímetro de los puntos y aparecerán completamente rectos. Cuando hay muchos animales apilados unos contra otros, los gusanos pueden contarse manualmente o cuantificarse mediante software de análisis de imágenes. Preferimos este último método por la facilidad y fiabilidad de los resultados.

Una vez cuantificados los gusanos en los puntos de origen de etanol y butanona, calcule el índice KeyAx como se muestra aquí. El índice de quimiotaxis típico para gusanos de tipo silvestre frente a butanona al 10 % es aproximadamente 0,2. El entrenamiento mast o espaciado generalmente aumenta el índice de QUIMIOTAXIS a entre 0,7 y 0,8 en el tiempo cero, lo que proporciona un índice de aprendizaje de alrededor de 0,6.

La quimiotaxis ingenua es altamente sensible al cuidado adecuado de los gusanos. Esta figura demuestra la marcada diferencia en el índice de quimiotaxis entre gusanos ingenuos bien alimentados y aquellos en ayunas, y resalta la importancia de una técnica adecuada. La retención de la memoria se refleja en el tiempo que tarda el índice de quimiotaxis de Texas en regresar a niveles ingenuos cuando el índice de aprendizaje es igual a cero en animales de tipo silvestre.

La memoria asociativa a corto plazo comienza a disminuir a partir de una hora después de un entrenamiento masivo que dura aproximadamente dos horas y es independiente del factor de transcripción kreb en comparación. La memoria asociativa a largo plazo normalmente no comienza a disminuir significativamente hasta 16 horas después de un entrenamiento espacial que puede durar hasta 40 horas y depende de Creb. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los ensayos de quimiotaxis pueden verse influenciados por el ayuno o por olores excesivos en el ambiente, y también que la memoria y los gusanos pueden alterarse por una agitación física excesiva.