Múltiples imágenes del ratón neuroanatómicos de Resonancia Magnética

El objetivo general de este procedimiento es lograr un fenotipado de alto rendimiento con ratones vivos o fijados, utilizando resonancia magnética cerebral de múltiples ratones. Esto se consigue primero anestesiando a cada ratón. A continuación, para la exploración in vivo, coloque a cada ratón sobre un trineo de tamaño adecuado antes de montarlo en una matriz de carga y posicionarlo dentro del orificio del imán.

O para imágenes ex vivo, realice una perfusión transcardíaca, aísle la estructura del cráneo y colóquela en tubos de imagen, los cuales luego se colocan en una matriz de bobinas solenoides de 16 canales posicionada dentro del orificio del imán. Finalmente, se pueden obtener volúmenes tridimensionales de imágenes por resonancia magnética que muestran imágenes cerebrales de alta calidad adecuadas para fenotipado, así como estructuras mayores y menores en el cerebro del ratón. La ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes como la histología es que conserva la anatomía general de los especímenes aún dentro de sus cráneos y permite una cobertura completa del cerebro y un análisis tridimensional.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos biomédicos, como la relación entre los genes y las distinciones anatómicas que representan fenotipos en el modelo de ratón de enfermedad. En general, las personas nuevas en esta técnica encontrarán difícil el desarrollo de arreglos personalizados de carga de ratones y bobinas de radiofrecuencia necesarios para la obtención de imágenes cerebrales de alto rendimiento. Lo más desafiante antes de comenzar este protocolo es obtener la aprobación para todos los procedimientos de manejo masivo por parte del comité institucional de cuidado animal, del comité local de cuidado y uso de animales, o de un organismo equivalente, así como realizar primeros procedimientos como la identificación y la medición del peso.

Las grabaciones de los animales deben realizarse dentro de una cabina de seguridad biológica. A continuación, transfiera los animales a un recipiente plástico autoclaveable para su transporte a la cámara de inducción de RM. Anestesie los animales que serán escaneados en la cámara de inducción precalentada utilizando 4 % de ISO (fluorano) y cuatro litros por minuto de oxígeno.

Los animales están completamente anestesiados una vez que dejan de responder al pellizco en la pata. Si es necesario, se puede eliminar el pelaje del pecho utilizando un removedor de vello como nare, para lograr un mejor contacto con los dispositivos de ECG y de monitoreo de temperatura integrados en el trineo personalizado. Asimismo, aplique ISV, como lágrimas artificiales PMM, sobre los ojos para prevenir el secado y administre aproximadamente 0,3 mililitros de solución salina mediante inyección subcutánea.

Para hidratar a los animales. Ahora coloque los ratones en trineos individuales con sondas integradas de ECG, respiración y temperatura. Tenga cuidado de colocar las extremidades delanteras y traseras en las depresiones que se encuentran en los trineos.

En los casos en que se requiera monitoreo de ECG, asegúrese de que las regiones libres de pelo en la parte inferior del ratón coincidan con las sondas de ECG, inmovilice a cada animal con una correa para la cabeza y una correa para la nariz, y luego deslice cada trineo dentro de un tubo cónico de 50 mililitros de extremo abierto. Hasta siete ratones vivos pueden prepararse para escaneo en una sola sesión de imagen. A continuación, coloque los tubos cónicos en la matriz de carga.

Asegúrese de conectar todas las líneas de monitorización fisiológica una vez que todos los animales estén cargados. Establezca el nivel de isoflurano en el interior del imán en 2% y el nivel de oxígeno en ocho litros por minuto. Ahora transporte el arreglo de carga hacia el imán y colóquelo sobre el sistema de rieles.

Utilice el sistema de rieles para acoplar el conjunto de carga con el colmenar de ratones, que está diseñado para posicionar uniformemente a los ratones dentro de cada bobina de radiofrecuencia colocada en el centro del orificio del imán. Cuando se inserta completamente en el imán, los tubos centrífugos se acoplan al sistema de administración de anestésico dentro de las bobinas de RF, como se observa aquí; el fluoruro ISOF mezclado con oxígeno se suministra desde el colmenar de ratones hasta la muestra a través de un tubo a lo largo del eje de cada bobina individual. Esta mezcla de gas anestésico fluye hacia los tubos, pasando por los ratones, y es recogida por una unidad de extracción activa conectada a la parte trasera del conjunto de carga.

Dependiendo de las lecturas fisiológicas de los animales, como la respiración y la temperatura, los niveles de isof debe establecerse entre 0,9 y 2 %. Ahora, escanee los animales utilizando una secuencia eco de adquisición rápida. La duración de cada escaneo tridimensional es de aproximadamente tres horas, con una resolución de imagen resultante de 125 micrómetros. Asegúrese de monitorear las lecturas de ECG, la respiración y la temperatura en cada animal durante todo el proceso de escaneo.

Los animales también deben mantenerse calientes durante la sesión de escaneo con un flujo de aire caliente. Cuando el escaneo esté completo, retire la matriz de carga del imán y colóquela en una cámara de inducción cálida llena con oxígeno al 100 %. Saque a los animales de los tubos y transfiéralos a recipientes plásticos sellados para su transporte a una cabina de seguridad biológica.

Finalmente, coloque los animales en una jaula cálida y libre de corrientes de aire y permita que se recuperen de la anestesia para la obtención de imágenes animales ex vivo. Primero, anestesie completamente a los animales mediante una inyección intraperitoneal de una combinación de ketamina y xilacina. Antes de comenzar la perfusión, evalúe el plano quirúrgico de anestesia mediante la compresión del dedo del pie o de la pata.

Abra la cavidad torácica e inserte una aguja o un conjunto de infusión con ala de seguridad en el ventrículo izquierdo del corazón. Luego corte el átrio derecho para iniciar la perfusión transcardíaca. Primero, lave con 30 mililitros de solución salina tamponada con fosfato 1x a temperatura ambiente, mezclada con una microlitro por mililitro de heparina y dos milimolar de pro hands, utilizando un flujo de aproximadamente 100 mililitros por hora.

Esto debería tardar unos 20 minutos. A continuación, realice un paso de fijación con 30 mililitros de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente mezclado con dos milimoles de pro hands a 100 mililitros por hora. Ahora, decapite el animal y retire la piel, la mandíbula inferior, las orejas y la punta nasal cartilaginosa.

Luego, coloque la estructura ósea restante del cráneo en paraformaldehído al 4% mezclado con dos milimoles de pro hands y déjelo toda la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, transfiera la muestra a una solución de suero salino tamponado con fosfato 1x mezclada con azida sódica al 0,02% y dos milimoles de pro hands para su conservación. El escaneo de resonancia magnética tridimensional de alta resolución a siete Tesla debe realizarse al menos cuatro días, pero no más de dos meses y medio.

Tras la perfusión, coloque los cerebros que se van a imaginar en una matriz de bobinas solenoides de 16 canales y coloque esta dentro del escáner. Ahora escanee los especímenes utilizando una secuencia de eco de spin rápido.

Esta duración de escaneo es de aproximadamente 12 horas, y las imágenes finales tendrán una resolución isotrópica de 32 micrómetros. Una vez finalizado el escaneo, retire los especímenes de la bobina de imagen y coloque cada cráneo en una solución de formalina al 10 % con pro hands de dos milimoles para su preservación representativa in vivo. Aquí se muestran múltiples imágenes cerebrales de ratón obtenidas a partir de un escaneo de tres horas.

Esta figura muestra tres ejes de visualización para cada uno de los siete ratones escaneados. Aquí se muestra una imagen representativa del cerebro ex vivo con una resolución isotrópica de 32 micrones. Y aquí podemos ver una representación tridimensional de un volumen de imagen ex vivo una vez dominado.

Esta técnica in vivo puede realizarse en tres o cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Esta técnica puede ser utilizada por investigadores en muchos campos biomédicos para explorar enfermedades como el lupus, la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Alzheimer en el modelo de ratón. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes de alta calidad del cerebro mediante resonancia magnética, tanto en sujetos vivos como fijados.

Gracias por vernos.