Name: El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-25T16:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprende a aislar ribosomas con peptidil-ARNt específicos mediante extracción magnética con mRNAs biotinilados. Este método permite analizar la estructura y función ribosomal con alta pureza.

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LRC-V. desea dedicar este trabajo a la memoria del Dr. Adriel D. Johnson, un profesor maravilloso cuya prioridad fue siempre la educación de los estudiantes. Te echamos de menos, Adriel. Estamos muy agradecidos a Jacqueline Moreno por su ayuda en la realización de los experimentos descritos en este estudio. Este estudio fue apoyado por una subvención concedida a la CIA de la Fundación Nacional de Ciencia, MCB-0615390, y por la puesta en marcha fondos proporcionados a LRC-V. de la Universidad de Alabama en Huntsville.

1. Preparación de células extracto libre. <ol><li> Dos gramos de producto seco Escherichia coli sedimento bacteriano obtenido a partir de mediados de los cultivos en fase de registro se lavan dos veces con medio litro de un buffer que contiene 10 mM Tris-acetato, pH 8,0, 14 mM de acetato de magnesio, 60 mM de acetato de potasio y 50 mg / phenylmethanesulphonylfluoride mL (PMSF) por centrifugación a 5.000 X g por 5 min a 4 ° C. Después del lavado, el sedimento bacteriano se resuspendió en 40 ml de tampón A. </li><li> Las células bacterianas se rompen con una prensa francesa, la aplicación de presión de 6,000 psi. Esta presión corresponde a 600 unidades con un pistón de una pulgada. La suspensión se interrumpe recoger en un tubo de vidrio limpio (50 ml). </li><li> La suspensión se interrumpe tratados con 1 mM ditiotreitol (DTT) y se centrifuga a 30.000 xg durante 30 min. El procedimiento de centrifugación se repite, utilizando el sobrenadante resultante. El sobrenadante final se dispensa (1 ml) en microtubos. Por último, las alícuotas se congelan con un hielo seco-etanol o el nitrógeno líquido y se almacenan a -60 ° C o -80 º C. </li></ol> 2. Preparación de los extractos libres de células de RF2 empobrecido. <ol><li> 4,5 ml de la proteína A sefarosa 4B cuentas de lodo se mezcla con 5 ml de un anti-RF2 anti-suero con una rueda giratoria a temperatura ambiente, durante una hora. La mezcla se centrifuga a 2500 xg para separar las cuentas del antisuero. Tras desechar el sobrenadante, estas cuentas que contiene los anticuerpos anti-RF2 (anti-RF2 cuentas) son lavados después de resuspensión en 1 ml de tampón B que contiene 35 mM Tris-acetato de pH 7,8, 10 mM de acetato de magnesio, 30 mM de acetato de amonio, 60 mM de glutamato de potasio y 5 mg / ml de inhibidor de la proteasa leupeptina. Las bolas anti-RF2 se separan de tampón B por centrifugación utilizando las mismas condiciones indicadas anteriormente. El procedimiento de lavado se repite dos veces. </li><li> Un ml de extracto libre de células se mezclan con 150 ml de anti-RF2 cuentas con una rueda giratoria, a 4 ° C, durante dos horas. La mezcla se centrifuga a 10.000 xg para separar el extracto libre de células de las cuentas. Se elimina el sobrenadante y se trata de nuevo con otro l 150 de anti-RF2 cuentas. Este procedimiento se repite una vez más con la solución de extracto libre de células resultantes. La final de células libres de la solución de se dispensa (100 l) en microtubos. Las alícuotas se congelan con un hielo seco-etanol o el nitrógeno líquido y se almacenan a -60 ° C o -80 º C. </li></ol> 3. Preparación de una plantilla de ADN. <ol><li> Preparar un 1 mL para la reacción PCR mediante la mezcla de 600 femtomoles de la plantilla plásmido que contiene las secuencias que se traduce (Fig. 1), con 0,4 nanomoles de cada uno de los oligodesoxinucleótidos indica en la Figura 1, 0,2 micromoles de cada dNTP y 50 U de Taq- ADN polimerasa en el buffer suministrado por Stratagene Co. realizar la reacción de amplificación en las condiciones siguientes: 94 ° C durante 2 minutos, (94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 minuto, durante 30 ciclos) y 72 ° C durante 12 min. </li><li> Purificar el PCR-productos de la precipitación del ADN mediante la adición de volumen 1 / 10 de acetato de sodio 3 M, pH 5,2, y 2 volúmenes de etanol helado. Repita el procedimiento de precipitación, una vez más. Resuspender el ADN en 100 L de dietil-pirocarbonato (DEPC) de agua tratada. Normalmente, este procedimiento produce 100 mg de un producto de 600 pb de ADN. </li><li> Verificar la integridad de los productos de PCR por electroforesis en geles de agarosa. </li></ol> 4. Preparación de ARNm biotina etiquetados. <ol><li> Prepare una l 100 en la reacción de transcripción in vitro en el agua tratada DEPC mediante la mezcla de 5 g de los fragmentos de ADN generados por PCR con 0,5 micromoles de ATP, CTP, GTP, 0,3 micromoles de UTP, 50 nanomoles de biotina-16-UTP, y 10 l de la mezcla de la enzima T7 en el buffer suministrado por Promega Co. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 3 horas. Para cuantificar la cantidad de ARNm obtenido, la plantilla de ADN debe ser eliminado mediante la adición de RNasa libre de DNasa. Incubar la reacción a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Purificar los productos de ARNm por la precipitación del ARN mediante la adición de volumen 1 / 10 de acetato de sodio 3 M, pH 5,2, y 2 volúmenes de etanol frío. Repita el procedimiento de precipitación, una vez más. Resuspender el ARNm en 100 L de agua tratada con DEPC. Por lo general, este procedimiento de rendimientos entre 1.2 mg de biotina 600 nt etiquetado de productos de ARNm. </li><li> Verificar la integridad de los productos de ARNm biotina marcada por electroforesis en geles de agarosa. </li></ol> 5. El aislamiento de los ribosomas traducir contiene un peptidil-tRNA. <ol><li> Preparar 500 l de una mezcla de reacción in vitro de traducción en el agua tratada DEPC mediante la mezcla de 10-15 mg de biotina marcado ARNm con 75 nanomoles de cada uno de los amino ácidos diecinueve, todos menos el aminoácido que será reemplazado por un aminoácido radiactivo , 50 Ci de un ácido amino radiactivos (37MBq) y 20-5 0 L de RF2-depleción de células extracto libre, en una mezcla de reacción tamponada que contiene 40 mM Tris-acetato, pH 8,0, 10 mM de acetato de magnesio, 175 mM de acetato de potasio, acetato de amonio 10 mM, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 mM GTP, 30 mM fosfoenolpiruvato (PEP), 0,3 U / ml de piruvato quinasa (PK), el 3,5% de polietilenglicol 8000, 1 mM espermidina, 20 mg / ml de ácido folínico, y 250 mg / ml tRNA de E. coli. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 10 minutos. El orden de adición de los componentes de la reacción es muy importante. El extracto libre de células debe mezclarse primero con la solución tampón que contiene los aminoácidos y la mezcla final se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente para permitir la activación de los ribosomas. Más tarde, el marcado con biotina ARNm se agregan. Para el análisis estructural mediante procedimientos de modificación química, la adición de un aminoácido radiactivo no es necesario. </li><li> Agregar a la mezcla de reacción de traducción - 3 ml de perlas paramagnéticas de estreptavidina (SMB) en suspensión en tampón C que contiene 35 mM Tris-acetato, pH 8,0, 10 mM de acetato de magnesio, 175 mM de acetato de potasio, 10 mM de acetato de amonio y 1 mM DTT. Incubar la nueva suspensión a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Separar las pymes de la mezcla mediante la aplicación de un campo magnético (CM) se encuentra con separación magnética. </li><li> Resuspender las pymes en tampón C y separar las cuentas de nuevo con el MF. Repita este procedimiento de lavado dos veces. Volver a suspender las bolas en 500 l de tampón C, conservar la suspensión en el hielo, y realizar el siguiente procedimiento inmediatamente. </li></ol> 6. El análisis de los ribosomas aislados conteniendo la peptidil-tRNA. Para peptidil-tRNA <ol><li> Se mezclan 10 l de la SMB (suspendido en tampón C) con 10 l de un tampón de carga que contiene 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, el 2,5% (v / v) de glicerol, el 4% dodecil sulfato de sodio, 2 mM de TDT y de 0,2 mg / ml de azul de bromofenol. Resolver los componentes conectados a las cuentas mediante la ejecución de las muestras en el 10% Tris-tricina geles de poliacrilamida. </li><li> Secar el gel usando un vacío de gel de pelo. </li><li> Verificar la integridad y la purificación de la peptidil-tRNA al exponer el gel seco a una película de rayos-X. </li></ol> Para el ARN ribosomal <ol start="4"><li> Añadir 190 l de 2 mM etilendiaminotetraacetato (EDTA) preparada con agua tratada con DEPC, y 200 l de fenol equilibrado con agua a 10 l de una suspensión de bolas. Mezclar la suspensión por agitación vigorosa y separar la fase inorgánica de la fase orgánica por centrifugación a 10.000 xg durante 3 minutos a temperatura ambiente. Recoger la capa superior del agua en un microtubo nuevo. </li><li> Precipitar el ARN de la capa de agua mediante la adición de volumen 1 / 10 de acetato de sodio 3 M, pH 5,2, 1 l de 20 mg / ml de solución de glucógeno, y 2 volúmenes de etanol helado. Resuspender el RNA en 10 l de agua tratada con DEPC. </li><li> Verificar la integridad del ARN ribosomal por electroforesis en geles de agarosa. Por lo general, 50 l de la suspensión de cuentas de los rendimientos de 1 g de ARN ribosomal. </li></ol> 7. Los resultados representativos: La figura 2 presenta los resultados de una serie de análisis para evaluar la calidad y la funcionalidad de los ribosomas traducir aisladas mediante el procedimiento descrito. La observación de una única banda resolvieron en geles de poliacrilamida indica la presencia de polipéptidos unidos a los ARNm marcado con biotina unido a las pymes (Figura 2A). La purificación de ARN ribosomal usando este procedimiento establece la presencia de los ribosomas unidos a estos ARNm marcado con biotina, también (Figura 2B). Además de puromicina, un antibiótico que induce la actividad peptidil-transferasa del ribosoma, los resultados de la división de la naciente peptidil-ARNt 1. Esto se observa como un cambio en el patrón de migración del polipéptido aislado en geles de poliacrilamida (Fig. 2C). En conjunto, estos datos indican que la biotina marcado ARNm unido a las pymes contienen ribosomas funcionales con peptidil-tRNA. El aislamiento de los ribosomas traducir contiene específicos peptidil-ARNt permite el estudio de los efectos de la peptidil-ARNt, antibióticos y otras moléculas, en función de los ribosomas (Figura 3), y en la estructura del ribosoma (Figura 3B). En los ejemplos que aquí se presenta la sparsomycin antibióticos y el aminoácido triptófano (Trp) inhiben la rotura hidrolítica de la naciente tnaC-tRNA peptidil-tRNA inducida por RF2 en los ribosomas aislados (Figura 3). La interacción de sparsomycin o Trp con el ribosoma también induce cambios estructurales en algunos nucleótidos que constituyen el ARNr 23S de los ribosomas traducir (Fig. 3B). En resumen, el material biológico obtenido mediante el procedimiento descrito aquí son útiles para obtener mayor comprensión de los contactos estructurales que participan en la inhibición de la función del ribosoma en su interacción con diferentes factores moleculares. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Procedimiento utilizado para producir y purificar los ribosomas traducir contiene peptidil-tRNA. Fragmentos de ADN ca. 650 pb de longitud, que contiene el gen tnaC y su región adyacente, que se muestra en la figura, se utilizan como plantillas en la preparación de los ARNm que contiene biotina, [(bio) UMP] ARNm. Estos fragmentos de ADN son producidas por los procedimientos de PCR utilizando los oligodesoxinucleótidos indicado en la parte superior de la figura. Las letras subrayadas marcar la ubicación del promotor T7 codificada en el primer nucleótido. Letras en negrita indican la secuencia de Shine-Dalgarno que se utiliza en la traducción de las secuencias de ARNm tnaC. El promotor T7 en el fragmento de ADN es reconocida por la ARN polimerasa T7 que se utiliza para transcribir (flecha) la secuencia de tnaC y la posterior secuencia no codificante. La transcripción se termina cuando llega a la RNA polimerasa del extremo 3 'del fragmento de ADN, después de las secuencias rpoBC terminador (rpoBC "t"). La estructura tallo-bucle de la terminación rpoBC protege al ARNm de la 3'-5 'presentan actividad exoribonuclease en los extractos libres de células utilizadas en la reacción de traducción in vitro. El aislado [(bio) UMP] ARNm se utilizan para generar estancado, los ribosomas traducir, por medio de estudios de traducción in vitro. La secuencia tnaC en el [(bio) UMP] ARNm es traducido por un ribosoma que se atasca cuando el último aminoácido se incorpora, debido a la ausencia del factor de liberación (RF2) de la mezcla de reacción. El ribosoma-[(bio) UMP] complejos de ARNm se aisló de la mezcla total de reacción utilizando estreptavidina-magnético-cuentas (SMB) que se unen a la biotina marcado nucleótidos incorporados en el ARNm. Las pymes vinculados al ribosoma-[(bio) UMP] complejos de ARNm se extraen de la mezcla total de reacción mediante un campo magnético (CM). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Análisis estructural y funcional de los complejos aislados. A) En las reacciones de traducción in vitro se realizaron con [(bio) UMP] mRNAs en que fue sustituido el codón de inicio del gen tnaC por un codón de parada. Los productos finales fueron aislados utilizando streptavidina cuentas, como se indica en la figura 1. Productos de reacción y las moléculas aisladas fueron analizados por electroforesis en geles de poliacrilamida. El tnaC-tRNA y bandas tnaC péptido están marcados. B) El ARN total fue aislado de los complejos estancado con los procedimientos de extracción con fenol. Cada ARN aislado se resolvió por electroforesis en geles de agarosa. ARN ribosomal (ARNr) se indican. C) que contiene los complejos aislados tnaC-tRNAs se incubaron con (+) o sin (-) 0,02 mM puromycin (Puro) a temperatura ambiente durante 10 min. El péptido tnaC se marcaron durante la traducción con [35S]-metionina (A) o [3H]-prolina (B). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Análisis estructural y funcional de los ribosomas que contienen tnaC-tRNA que están vinculados a la sparsomycin antibióticos, o el aminoácido triptófano. A) que contiene los complejos aislados tnaC-tRNAs se incubaron con (+) o sin (-) sparsomycin (Spar) o triptófano (Trp) a temperatura ambiente durante 5 min. Más tarde, las mezclas se mezclaron con RF2 y se incuba a 37 ° C durante 20 min. B) Análisis de los cambios de metilación en el 23S rRNA inducida por moléculas de unión en el ribosoma. Complejos aislados fueron pre-incubadas con (+) o sin (-) 2 mM Trp o Spar durante 5 min a 37 ° C. Entonces, un agente de alquilación, sulfato de dimetilo, y se añadió la mezcla se incubó a temperatura ambiente por 20 min. ARN total fue extraído y ensayos de extensión del cebador se realizaron con un [32P] marcada oligodeoxynucleotide complementaria a los nucleótidos del ARNr 23S, que están separadas 100 nucleótidos río abajo de las secuencias de nucleótidos modificados. Los productos finales de los ensayos de extensión se resolvieron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. El 23S rRNA nucleótidos afectados por la presencia de Trp o Spar se indican.

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</ol>

Este procedimiento de aislamiento descritas en este informe es altamente reproducible. Por desgracia, la presencia de corto peptidil-ARNt producido a partir de las mismas secuencias traducido no puede ser convenientemente evitarse tales peptidil-ARNt puede corresponder a un 15-20% del total del material aislado (Fig. 2C). Estos contaminantes pueden aumentar la concentración en mayores concentraciones de ARNm marcado con biotina se han utilizado o cuando los extractos libres de células utilizadas son viejas o han sido re-usado varias veces. Por lo tanto, es muy importante para controlar la calidad y la concentración de los componentes de las reacciones de traducción in vitro. Por otra parte, una alta eficiencia comercial reconstituido extractos libres de células están disponibles que pueden ser utilizados para los mismos fines (sistema PURE) 18. Usando este método, biotina-16-UMP se incorporó al azar a lo largo del ARNm objetivo. Existe la posibilidad de que algunos ORFs contienen extensiones uridina puede haber incorporado esta modificación de nucleótidos en sus secuencias, que afectan a su traducción. Variable concentraciones relativas de biotin-16-UTP/UTP tienen que ser probados durante la síntesis del ARNm con el fin de obtener la traducción más eficiente. Métodos alternativos de etiquetado biotina se puede utilizar, dirigida al extremo 5 &#39;, el final más estable de los ARNm. (I) La biotina puede ser fijado al extremo 5 &#39;del ARNm con 3&#39;-NH2ATP (3&#39;-amino, 3&#39;-desoxiadenosina trifosfato) y T4 ligasa ARN 19. (Ii) el extremo 5 &#39;marcado con biotina oligonucleótido puede ser fijado al extremo 5&#39; del mRNA usando ARN ligasa de T4 y 20. (Iii) el extremo 3 &#39;marcado con biotina oligodesoxinucleótidos que corresponden a la secuencia complementaria al extremo 5&#39; del ARNm podría utilizarse también para aislar a los complejos de traducir. Estos oligodesoxinucleótidos biotina marcado se podría unir a las pymes antes de su aislamiento. Más tarde, el SMB unido al marcado con biotina oligodesoxinucleótidos se puede mezclar con la mezcla de reacción de traducción para permitir la interacción con sus secuencias de ARNm complementarios. Tras el aislamiento, el híbrido ARN-ADN región - y la región de hibridación entre la oligodeoxynucleotide marcado con biotina y la secuencia del ARNm - puede ser degradado con RNAsa H, la separación de los complejos se estancó a partir de las perlas de estreptavidina. Este método alternativo puede permitir que los complejos para ser empleados en futuros análisis estructural utilizando métodos de resolución más alta.

<table><tbody><tr><td>Base de Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de magnesio</td><td>Fluka</td><td>63049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Fluka</td><td>09688</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Perlas en suspensión de sefarosa A de proteína 4B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor leupeptina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9783</td><td></td></tr><tr><td>Polimerasa Taq de ADN</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>Kit T7 Maxiprep</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>SMB</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-16-UTP</td><td>Roche Group</td><td>1388908</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7002</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7768</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol 8000</td><td>Fluka</td><td>81268</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fólico</td><td>Fluka</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Fluka</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>tRNA de &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tricina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5816</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Soportes magnéticos para separación</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-arnt para el análisis funcional y estructural

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Recientemente, los estudios estructurales y bioquímicos han detallado muchos de los eventos moleculares que ocurren en el ribosoma durante la inhibición de la síntesis de proteínas por los antibióticos y en la síntesis de polipéptidos nacientes. Algunos de estos antibióticos, reguladores y polipéptidos nacientes en su mayoría en forma de peptidil-ARNt, inhibir o formación del enlace peptídico o terminación de la traducción 7.1. Estos eventos inhibitorios pueden detener el movimiento del ribosoma, un fenómeno denominado &quot;La detención de la traducción&quot;. Arresto traducción inducida por un antibiótico o un polipéptido naciente se ha demostrado que regulan la expresión de genes implicados en diversas funciones celulares como el crecimiento celular, resistencia a los antibióticos, la translocación de proteínas y el metabolismo celular 08.13. El conocimiento de cómo los antibióticos y la regulación polipéptidos nacientes alterar la función del ribosoma es esencial si queremos entender el papel completo de los ribosomas en la traducción, en todos los organismos. Aquí se describe una metodología sencilla que puede ser utilizado para purificar, exclusivamente, para su análisis, los ribosomas traducir un ARNm específico y que contienen un determinado peptidil-tRNA 14. Este procedimiento se basa en el aislamiento selectivo de los ribosomas traducir unido a un ARNm marcado con biotina. Estos complejos de traslación están separados de los ribosomas otros en la misma mezcla, usando cuentas estreptavidina paramagnético (SMB) y un campo magnético (CM). ARNm marcado con biotina son sintetizadas por los ensayos de transcripción escorrentía utilizando como fragmentos de plantillas de ADN generadas por la RCP que contienen promotores de la transcripción T7. T7 ARN polimerasa incorpora biotina-16-UMP de biotina-UTP, en nuestras condiciones aproximadamente diez biotina-16-UMP se incorporan moléculas de ARNm en un 600 nt con un 25% de contenido de la UMP. Estas marcado con biotina ARNm se aíslan, y se utiliza en ensayos de traducción in vitro realizados con factor de liberación de 2 (RF2), depleción de células libres de extractos obtenidos a partir de cepas de Escherichia coli que contiene el tipo salvaje o mutante ribosomas. Ribosomas traducir el marcado con biotina secuencias de ARNm se estancó en la región del codón de parada, debido a la ausencia de la proteína RF2, que normalmente se lleva a cabo la traducción de terminación. Estancado ribosomas que contiene la nueva síntesis de peptidil-tRNA son aislados y retirados de las reacciones de traducción mediante SMB y un MF. Estas cuentas sólo sujetarse a la biotina que contienen los mensajes. Los complejos aislados, la traducción, se puede utilizar para analizar las características estructurales y funcionales de tipo salvaje o mutante componentes ribosomal, o secuencias de peptidil-tRNA, así como la determinación de interacción ribosoma con antibióticos u otros factores moleculares 1,14-16. Para examinar la función de estos complejos ribosoma aislado, peptidil-transferasa ensayos pueden ser realizados en presencia del antibiótico puromicina 1. Para estudiar los cambios estructurales en los complejos de traslación, los procedimientos bien establecidos pueden ser utilizados, tales como i) la reticulación de 14 aminoácidos específicos y / o ii) ensayos de protección de alquilación 1,14,17.

Un obstáculo importante para los análisis bioquímicos de los ribosomas que contienen naciente peptidil-ARNt ha sido la presencia de los ribosomas otros en las mismas muestras, los ribosomas no participan en la traducción de la secuencia del ARNm específico que se analiza. Hemos desarrollado una metodología sencilla para purificar, exclusivamente, los ribosomas que contiene la naciente peptidil-tRNA de interés.

El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

Recientemente, estudios estructurales y bioquímicos han detallado muchos de los eventos moleculares que ocurren en el ribosoma durante la inhibición de la síntesis de proteínas...

El objetivo general del siguiente experimento es analizar la estructura y función de ribosomas puros que contienen un ARNt peptídico único. Esto se logra realizando ensayos de traducción in vitro con extractos libres de células desprovistos de factores de liberación y ARNm marcados con biotina, para generar complejos de ribosomas con ARNt peptídico detenidos y unidos al ARNm marcado con biotina. Como segundo paso, se mezclan perlas paramagnéticas unidas a estreptavidina con los ensayos de traducción in vitro para permitir su interacción con las moléculas de biotina localizadas en el ARNm.Posteriormente, las perlas se extraen utilizando campos magnéticos que separan los complejos de ribosomas con peptidil-tRNA detenidos, unidos a los ARNm, del resto de la reacción. A continuación, los complejos de ribosomas con peptidil-tRNA purificados se pueden mezclar con factores de traducción, como factores de liberación, antibióticos inhibidores o agentes químicos modificadores, con el fin de analizar su función. Los resultados obtenidos muestran la inhibición de la hidrólisis de los peptidil-tRNA y su correlación con cambios estructurales en los ribosomas, basados en ensayos de actividad de peptidil transferasa o de terminación de la traducción mediante geles SDS o Tris Racine page, y ensayos de protección frente a modificaciones utilizando geles urea page.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la centrifugación diferencial es que las muestras aisladas contienen principalmente ribosomas con una sola población de ARNt pep. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la expresión génica, como la naturaleza de los polipéptidos nacientes y cómo los antibióticos afectan la función del ribosoma, por ejemplo, modulando el proceso de traducción. Para comenzar este procedimiento, obtenga dos gramos de un pellet bacteriano seco de E. coli procedente de cultivos en fase logarítmica.Lave el sedimento mediante resuspensión en un litro de tampón, seguido de centrifugación a 5,000 Gs durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Después de realizar dos lavados, resuspenda el sedimento bacteriano resultante en 40 mililitros de tampón y rompa las células bacterianas utilizando una prensa francesa con una presión de 6,000 PSI. Esta presión corresponde a 600 unidades usando un pistón de una pulgada.Recoger la suspensión disruptada en un tubo de vidrio limpio de 50 mililitros. Tratar la suspensión disruptada con DIO triol o DTT de un milimolar y centrifugar la muestra a 30.000 Gs durante 30 minutos. Eliminar el sobrenadante resultante y repetir el procedimiento de centrifugación.Guarde el sobrenadante obtenido de la segunda centrifugación, distribuya el sobrenadante final en tubos micro. Finalmente, enfríe rápidamente. Congele las alícuotas utilizando una mezcla de etanol con hielo seco o nitrógeno líquido y almacene las muestras a menos 60 o menos 80 grados Celsius.Inicie la preparación de extractos libres de células desprovistos de RF dos mezclando 4,5 mililitros de bolas en suspensión de proteína A esfero cuatro B con cinco mililitros de un suero antisuero anti RF dos. Incube la mezcla en una rueda rotatoria a temperatura ambiente durante una hora. Centrifugue la mezcla a 2.500 G para separar las bolas del suero antisuero.Deseche el sobrenadante. Las perlas ahora contienen los dos anticuerpos anti RF y se denominarán perlas anti RF. Lave las perlas resuspendiéndolas en un mililitro de tampón B.Luego, centrifugue las perlas como antes para separar las perlas anti RF dos del tampón B. Repita este procedimiento de lavado dos veces. Después de lavar las perlas, mezcle un mililitro del extracto libre de células con 150 microlitros de perlas anti RF dos e incube en una rueda rotatoria a cuatro grados Celsius durante dos horas tras la incubación. Centrifugue la mezcla a 10.000 Gs para separar el extracto libre de células de las perlas.Elimine el sobrenadante y trátelo nuevamente con otros 150 microlitros de perlas anti RF dos antes de repetir la incubación y la precipitación una vez más. Distribuya la solución final del extracto libre de células agotado de RF dos en tubos micro a 100 microlitros por tubo. Congele las alícuotas utilizando una mezcla de hielo seco y etanol o nitrógeno líquido y almacénelas a menos 60 o menos 80 grados Celsius.Prepare la reacción de PCR combinando la plantilla de plásmido que contiene las secuencias por traducir, oligonucleótidos desoxi, DTPs, ADN polimerasa intacta y tampón de PCR según la estrategia. Una vez preparada la muestra de PCR, realice la reacción de amplificación y precipite el ADN para purificar los productos de PCR mediante la adición de un décimo de volumen de acetato de sodio tres molar, pH 5,2, y dos volúmenes de etanol frío a 0 °C. Después de repetir el procedimiento de precipitación una vez más, suspendemos el ADN resultante en 100 microlitros de agua tratada con diclorodimetilhidantoína o agua tratada con dióxido de cloro.Verifique la integridad de los productos de PCR mediante electroforesis en geles de agarosa. Típicamente, este procedimiento produce 100 microgramos de un producto de ADN de 600 pares de bases. Prepare una reacción de transcripción in vitro de 100 microlitros en agua tratada con DEPC mezclando cinco microgramos del fragmento de ADN generado por PCR con ribonucleótidos marcados con UTP biotinilado y la mezcla del enzima T7.Incubar la mezcla de reacción a 37 grados Celsius durante tres horas. Para cuantificar la cantidad de ARNm obtenido, eliminar la plantilla de ADN añadiendo DNasa libre de ARN. Incubar la reacción a 37 grados Celsius durante 10 minutos.Para purificar los productos de ARNm, precipite el ARN dos veces añadiendo un décimo de volumen de acetato sódico 3 M, pH 5,2 y dos volúmenes de etanol frío; resuspenda el ARNm precipitado en 100 microlitros de agua tratada con dpci. Verifique la integridad de los productos de ARNm marcados con biotina mediante electroforesis en geles aros. Habitualmente, este procedimiento produce entre uno y dos miligramos de un producto de ARNm marcado con biotina de 600 nucleótidos para comenzar el aislamiento de ribosomas en traducción que contienen un ARNt peptídico. Se prepara una mezcla de reacción de traducción in vitro de 500 microlitros en agua tratada con dey.Primero, prepare la mezcla de reacción tamponada descrita en el protocolo escrito adjunto y luego agregue 75 M de cada uno de los aminoácidos, excepto el que será reemplazado por un aminoácido radiactivo. A continuación, agregue de 20 a 50 microlitros del extracto libre de células deficiente en RF dos a la solución tampón que contiene los aminoácidos. Incube la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente para permitir la activación de los ribosomas.Una vez que los ribosomas se hayan activado, agregue de 10 a 15 microgramos de ARNm marcados con biotina a la muestra. Incube la mezcla de reacción a 37 grados Celsius durante 10 minutos.Mientras tanto, prepare tres mililitros de perlas paramagnéticas de estreptavidina o SMB en tampón C. Tras la incubación, agregue la suspensión de SMP a la mezcla de reacción de traducción. Incube la nueva suspensión a temperatura ambiente durante 10 minutos. Separe el SMB de la mezcla aplicando un campo magnético mediante soportes magnéticos para separación. Resus.Suspenda el SMB en el tampón C y separe las perlas nuevamente utilizando el soporte magnético. Después de repetir este procedimiento de lavado dos veces, re suspenda las perlas en 500 microlitros de tampón C. Almacene la suspensión en hielo y realice el siguiente procedimiento inmediatamente. Para visualizar el peptid tRNA, mezcle 10 microlitros del SMB suspendido en tampón C con 10 microlitros de tampón de carga y separe los componentes unidos a las perlas mediante la electroforesis de las muestras en geles de poliacrilamida al 10 % en Tris-tric.Seque los geles utilizando un secador de geles al vacío. Luego, verifique la integridad y la purificación del ARNt del péptido exponiendo el gel seco a una película de rayos X. Para analizar el ARN ribosómico, combine 190 microlitros de una solución de EDTA dos milimolar preparada con agua tratada con DPCi, 200 microlitros de fenol equilibrado con agua y 10 microlitros de una suspensión de perlas.Mezcle la suspensión resultante mediante vortexado vigoroso. Separe la fase inorgánica de la fase orgánica por centrifugación a 10.000 Gs durante tres minutos. A temperatura ambiente, recoja la capa acuosa superior en un nuevo tubo microcéntrifuga, precipite el ARN de la capa acuosa añadiendo un décimo de volumen de acetato sódico tres molar pH 5,21, un microlitro de solución de glicógeno de 20 miligramos por mililitro y dos volúmenes de etanol helado. Re suspenda el ARN precipitado en 10 microlitros de agua tratada con dpcI.Verifique la integridad de los ARN ribosomales mediante electroforesis en geles de niros. Usualmente, 50 microlitros de suspensión de beat producen un microgramo de ARN ribosomal. Aquí se presentan los resultados de una serie de análisis que evalúan la calidad y funcionalidad de los ribosomas traductores aislados.La observación de una banda única resuelta en geles de poliacrilamida indica la presencia de polipéptidos unidos a los ARNm marcados con biotina que están fijados al SMB. La purificación de ARN ribosomales. Este procedimiento también establece la presencia de ribosomas unidos a estos ARNm marcados con biotina.La adición de puromicina, un antibiótico que induce la actividad peptidil transferasa del ribosoma, provoca la escisión de los ARNt peptídicos nascentes. Esto se observa como un cambio en el patrón de migración del polipéptido aislado en geles de poliacrilamida. Conjuntamente, estos datos indican que los ARNm marcados con biotina unidos al SMB contienen ribosomas funcionales con ARNt peptídicos.El aislamiento de ribosomas en proceso de traducción que contienen ARNt peptídicos específicos permite el estudio de los efectos de los ARNt peptídicos, antibióticos y otras moléculas sobre la función y la estructura ribosomal. En los ejemplos presentados aquí, el antibiótico s parsamyn y el aminoácido triptófano inhiben la escisión hidrolítica del ARNt peptídico TNAC naciente por RF dos en los ribosomas aislados.La interacción del triptófano o de la esparsomicina con el ribosoma también induce cambios estructurales en algunos nucleótidos que constituyen el ARN 23 S del ribosoma en proceso de traducción. Una vez dominado, la parte principal de esta técnica puede realizarse en cinco horas si se lleva a cabo correctamente siguiendo estos procedimientos. Otros métodos como el microscopio crioelectrónico (cryo-EM) o análisis estructurales adicionales pueden realizarse para responder preguntas complementarias sobre la estructura del ribosoma que contiene un péptido, ARN único.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

Una técnica para identificar sitios traduccionales pausa en ARNm se describe. Este procedimiento se basa en el aislamiento de polipéptidos nacientes acumulan en los ribosomas durante la traducción in vitro de un ARNm diana, seguido por el análisis del tamaño de las cadenas nacientes utilizando una electroforesis en gel de desnaturalización.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

Se describe aquí una técnica que ahora se utilizan habitualmente para aislar de forma estable consolidados complejos ribosoma cadena naciente (RNC). Esta técnica aprovecha el descubrimiento de que un joven de 17 aminoácidos de longitud SecM "secuencia de la detención" puede detener la elongación de la traducción en un procariota...

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Este protocolo ilustra modificaciones esenciales de fraccionamiento polyribosome con el fin de estudiar la translatome in vivo de muestras del SNC. Permite la evaluación global de la traducción y transcripción de regulación a través del aislamiento y la comparación de ARN total a ribosoma ARN fracciones unidas.

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Muchos ARNm que codifican proteínas mitocondriales se asocian con la membrana externa mitocondrias. Se describe un procedimiento de fraccionamiento subcelular destinada a aislamiento de las mitocondrias de levadura con sus ARNm y ribosomas asociados. Este protocolo se puede aplicar a las células cultivadas bajo diversas condiciones con el fin de revelar los mecanismos de la localización del mRNA y la traducción localizada cerca de las mitocondrias.

Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

La Purificación de Afinidad de Ribosoma Traductora (TRAP) es capaz de capturar la traducción específica del tipo de célula del ARNm. Aquí informamos sobre el primer protocolo TRAP dedicado al aislamiento de ARNm en poblaciones celulares raras de embriones de Drosophila.

TRAP-rc, Traducción ribosoma Affinity Purificación de poblaciones de células raras de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de la cadena naciente, la orientación, el plegado y las vías de ensamblaje. Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

Aprende a aislar ribosomas con peptidil-ARNt específicos mediante extracción magnética con mRNAs biotinilados. Este método permite analizar la estructura y función ribosomal con alta pureza.

El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

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