El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

El objetivo general del siguiente experimento es analizar la estructura y función de ribosomas puros que contienen un ARNt peptídico único. Esto se logra realizando ensayos de traducción in vitro con extractos libres de células desprovistos de factores de liberación y ARNm marcados con biotina, para generar complejos de ribosomas con ARNt peptídico detenidos y unidos al ARNm marcado con biotina. Como segundo paso, se mezclan perlas paramagnéticas unidas a estreptavidina con los ensayos de traducción in vitro para permitir su interacción con las moléculas de biotina localizadas en el ARNm.

Posteriormente, las perlas se extraen utilizando campos magnéticos que separan los complejos de ribosomas con peptidil-tRNA detenidos, unidos a los ARNm, del resto de la reacción. A continuación, los complejos de ribosomas con peptidil-tRNA purificados se pueden mezclar con factores de traducción, como factores de liberación, antibióticos inhibidores o agentes químicos modificadores, con el fin de analizar su función. Los resultados obtenidos muestran la inhibición de la hidrólisis de los peptidil-tRNA y su correlación con cambios estructurales en los ribosomas, basados en ensayos de actividad de peptidil transferasa o de terminación de la traducción mediante geles SDS o Tris Racine page, y ensayos de protección frente a modificaciones utilizando geles urea page.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la centrifugación diferencial es que las muestras aisladas contienen principalmente ribosomas con una sola población de ARNt pep. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la expresión génica, como la naturaleza de los polipéptidos nacientes y cómo los antibióticos afectan la función del ribosoma, por ejemplo, modulando el proceso de traducción. Para comenzar este procedimiento, obtenga dos gramos de un pellet bacteriano seco de E. coli procedente de cultivos en fase logarítmica.

Lave el sedimento mediante resuspensión en un litro de tampón, seguido de centrifugación a 5,000 Gs durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Después de realizar dos lavados, resuspenda el sedimento bacteriano resultante en 40 mililitros de tampón y rompa las células bacterianas utilizando una prensa francesa con una presión de 6,000 PSI. Esta presión corresponde a 600 unidades usando un pistón de una pulgada.

Recoger la suspensión disruptada en un tubo de vidrio limpio de 50 mililitros. Tratar la suspensión disruptada con DIO triol o DTT de un milimolar y centrifugar la muestra a 30.000 Gs durante 30 minutos. Eliminar el sobrenadante resultante y repetir el procedimiento de centrifugación.

Guarde el sobrenadante obtenido de la segunda centrifugación, distribuya el sobrenadante final en tubos micro. Finalmente, enfríe rápidamente. Congele las alícuotas utilizando una mezcla de etanol con hielo seco o nitrógeno líquido y almacene las muestras a menos 60 o menos 80 grados Celsius.

Inicie la preparación de extractos libres de células desprovistos de RF dos mezclando 4,5 mililitros de bolas en suspensión de proteína A esfero cuatro B con cinco mililitros de un suero antisuero anti RF dos. Incube la mezcla en una rueda rotatoria a temperatura ambiente durante una hora. Centrifugue la mezcla a 2.500 G para separar las bolas del suero antisuero.

Deseche el sobrenadante. Las perlas ahora contienen los dos anticuerpos anti RF y se denominarán perlas anti RF. Lave las perlas resuspendiéndolas en un mililitro de tampón B.

Luego, centrifugue las perlas como antes para separar las perlas anti RF dos del tampón B. Repita este procedimiento de lavado dos veces. Después de lavar las perlas, mezcle un mililitro del extracto libre de células con 150 microlitros de perlas anti RF dos e incube en una rueda rotatoria a cuatro grados Celsius durante dos horas tras la incubación. Centrifugue la mezcla a 10.000 Gs para separar el extracto libre de células de las perlas.

Elimine el sobrenadante y trátelo nuevamente con otros 150 microlitros de perlas anti RF dos antes de repetir la incubación y la precipitación una vez más. Distribuya la solución final del extracto libre de células agotado de RF dos en tubos micro a 100 microlitros por tubo. Congele las alícuotas utilizando una mezcla de hielo seco y etanol o nitrógeno líquido y almacénelas a menos 60 o menos 80 grados Celsius.

Prepare la reacción de PCR combinando la plantilla de plásmido que contiene las secuencias por traducir, oligonucleótidos desoxi, DTPs, ADN polimerasa intacta y tampón de PCR según la estrategia. Una vez preparada la muestra de PCR, realice la reacción de amplificación y precipite el ADN para purificar los productos de PCR mediante la adición de un décimo de volumen de acetato de sodio tres molar, pH 5,2, y dos volúmenes de etanol frío a 0 °C. Después de repetir el procedimiento de precipitación una vez más, suspendemos el ADN resultante en 100 microlitros de agua tratada con diclorodimetilhidantoína o agua tratada con dióxido de cloro.

Verifique la integridad de los productos de PCR mediante electroforesis en geles de agarosa. Típicamente, este procedimiento produce 100 microgramos de un producto de ADN de 600 pares de bases. Prepare una reacción de transcripción in vitro de 100 microlitros en agua tratada con DEPC mezclando cinco microgramos del fragmento de ADN generado por PCR con ribonucleótidos marcados con UTP biotinilado y la mezcla del enzima T7.

Incubar la mezcla de reacción a 37 grados Celsius durante tres horas. Para cuantificar la cantidad de ARNm obtenido, eliminar la plantilla de ADN añadiendo DNasa libre de ARN. Incubar la reacción a 37 grados Celsius durante 10 minutos.

Para purificar los productos de ARNm, precipite el ARN dos veces añadiendo un décimo de volumen de acetato sódico 3 M, pH 5,2 y dos volúmenes de etanol frío; resuspenda el ARNm precipitado en 100 microlitros de agua tratada con dpci. Verifique la integridad de los productos de ARNm marcados con biotina mediante electroforesis en geles aros. Habitualmente, este procedimiento produce entre uno y dos miligramos de un producto de ARNm marcado con biotina de 600 nucleótidos para comenzar el aislamiento de ribosomas en traducción que contienen un ARNt peptídico. Se prepara una mezcla de reacción de traducción in vitro de 500 microlitros en agua tratada con dey.

Primero, prepare la mezcla de reacción tamponada descrita en el protocolo escrito adjunto y luego agregue 75 M de cada uno de los aminoácidos, excepto el que será reemplazado por un aminoácido radiactivo. A continuación, agregue de 20 a 50 microlitros del extracto libre de células deficiente en RF dos a la solución tampón que contiene los aminoácidos. Incube la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente para permitir la activación de los ribosomas.

Una vez que los ribosomas se hayan activado, agregue de 10 a 15 microgramos de ARNm marcados con biotina a la muestra. Incube la mezcla de reacción a 37 grados Celsius durante 10 minutos.

Mientras tanto, prepare tres mililitros de perlas paramagnéticas de estreptavidina o SMB en tampón C. Tras la incubación, agregue la suspensión de SMP a la mezcla de reacción de traducción. Incube la nueva suspensión a temperatura ambiente durante 10 minutos. Separe el SMB de la mezcla aplicando un campo magnético mediante soportes magnéticos para separación. Resus.

Suspenda el SMB en el tampón C y separe las perlas nuevamente utilizando el soporte magnético. Después de repetir este procedimiento de lavado dos veces, re suspenda las perlas en 500 microlitros de tampón C. Almacene la suspensión en hielo y realice el siguiente procedimiento inmediatamente. Para visualizar el peptid tRNA, mezcle 10 microlitros del SMB suspendido en tampón C con 10 microlitros de tampón de carga y separe los componentes unidos a las perlas mediante la electroforesis de las muestras en geles de poliacrilamida al 10 % en Tris-tric.

Seque los geles utilizando un secador de geles al vacío. Luego, verifique la integridad y la purificación del ARNt del péptido exponiendo el gel seco a una película de rayos X. Para analizar el ARN ribosómico, combine 190 microlitros de una solución de EDTA dos milimolar preparada con agua tratada con DPCi, 200 microlitros de fenol equilibrado con agua y 10 microlitros de una suspensión de perlas.

Mezcle la suspensión resultante mediante vortexado vigoroso. Separe la fase inorgánica de la fase orgánica por centrifugación a 10.000 Gs durante tres minutos. A temperatura ambiente, recoja la capa acuosa superior en un nuevo tubo microcéntrifuga, precipite el ARN de la capa acuosa añadiendo un décimo de volumen de acetato sódico tres molar pH 5,21, un microlitro de solución de glicógeno de 20 miligramos por mililitro y dos volúmenes de etanol helado. Re suspenda el ARN precipitado en 10 microlitros de agua tratada con dpcI.

Verifique la integridad de los ARN ribosomales mediante electroforesis en geles de niros. Usualmente, 50 microlitros de suspensión de beat producen un microgramo de ARN ribosomal. Aquí se presentan los resultados de una serie de análisis que evalúan la calidad y funcionalidad de los ribosomas traductores aislados.

La observación de una banda única resuelta en geles de poliacrilamida indica la presencia de polipéptidos unidos a los ARNm marcados con biotina que están fijados al SMB. La purificación de ARN ribosomales. Este procedimiento también establece la presencia de ribosomas unidos a estos ARNm marcados con biotina.

La adición de puromicina, un antibiótico que induce la actividad peptidil transferasa del ribosoma, provoca la escisión de los ARNt peptídicos nascentes. Esto se observa como un cambio en el patrón de migración del polipéptido aislado en geles de poliacrilamida. Conjuntamente, estos datos indican que los ARNm marcados con biotina unidos al SMB contienen ribosomas funcionales con ARNt peptídicos.

El aislamiento de ribosomas en proceso de traducción que contienen ARNt peptídicos específicos permite el estudio de los efectos de los ARNt peptídicos, antibióticos y otras moléculas sobre la función y la estructura ribosomal. En los ejemplos presentados aquí, el antibiótico s parsamyn y el aminoácido triptófano inhiben la escisión hidrolítica del ARNt peptídico TNAC naciente por RF dos en los ribosomas aislados.

La interacción del triptófano o de la esparsomicina con el ribosoma también induce cambios estructurales en algunos nucleótidos que constituyen el ARN 23 S del ribosoma en proceso de traducción. Una vez dominado, la parte principal de esta técnica puede realizarse en cinco horas si se lleva a cabo correctamente siguiendo estos procedimientos. Otros métodos como el microscopio crioelectrónico (cryo-EM) o análisis estructurales adicionales pueden realizarse para responder preguntas complementarias sobre la estructura del ribosoma que contiene un péptido, ARN único.