El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

El objetivo general del siguiente experimento es analizar la estructura y función de los ribosomas puros que contienen un péptido único TRNA. Esto se logra mediante la realización de ensayos de traducción in vitro con extractos libres de células y ARNm marcados con biotina agotados con factor de liberación para generar complejos de ribosomas de ARNt de pep estancados unidos a los ARNm marcados con biotina. Como segundo paso, las perlas paramagnéticas unidas a estreptavidina se mezclan con los ensayos de traducción in vitro para permitir su interacción con las moléculas de biotina ubicadas en el ARNm.

Más tarde, las perlas se extraen utilizando campos magnéticos que extraen los complejos de ribosoma de ARNt peptídicos estancados unidos a los ARNm de la reacción total. A continuación, los complejos de ribosoma de ARNt peptídico purificado se pueden mezclar con factores traslacionales como la traducción del factor de liberación, antibióticos inhibidores o agentes modificadores químicos para analizar la función. Inhibición y estructura del ribosoma Se obtienen resultados que muestran la inhibición de la hidrólisis de los tRNAs peptídicos y su correlación con cambios estructurales en los ribosomas basados en la actividad de la transferasa peptídica o ensayos de terminación traduccional utilizando geles de página SDS o Tris Racine y ensayos de protección de modificación utilizando geles de página de urea.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la centrifugación diferencial, es que las muestras aisladas contienen en su mayoría ribosomas con una sola población de pep tRNA. Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el campo de la expresión génica, como la naturaleza de los polipéptidos nacientes y los antibióticos que afectan la función del ribosoma como modulación del proceso de traducción. Para comenzar este procedimiento, obtenga dos gramos de un pellet bacteriano seco de E. coli de cultivos en fase logarítmica.

Lavar el pellet por Resus suspendiéndolo en un litro de tampón, seguido de centrifugación a 5.000 Gs durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de realizar dos lavados, suspenda el pellet bacteriano resultante en 40 mililitros de tampón y rompa las células bacterianas con una prensa francesa que aplique una presión de 6.000 PSI. Esta presión corresponde a 600 unidades utilizando un pistón de una pulgada.

Recoja la suspensión interrumpida en un tubo de vidrio limpio de 50 mililitros. Trate la suspensión interrumpida con un triol milimolar DIO o centrífuga DTT de la muestra a 30.000 Gs durante 30 minutos. Retire el sobrenadante resultante y repita el procedimiento de centrifugación.

Guarde el sobrenadante obtenido de la segunda centrifugación, dispense el sobrenadante final en microtubos. Por último, flash. Congele las alícuotas con una mezcla de hielo seco, etanol o nitrógeno líquido y almacene las muestras a menos 60 o menos 80 grados centígrados.

Comience la preparación de extractos libres de células empobrecidos de RF dos mezclando 4,5 mililitros de proteína A esferones, cuatro perlas de suspensión B con cinco mililitros de un anti RF dos antisuero. Gire la mezcla en una rueda giratoria a temperatura ambiente durante una hora. Centrifugar la mezcla a 2.500 Gs para separar las perlas del antisérum.

Deseche el sobrenadante. Las perlas ahora contienen los anticuerpos anti RF dos y se denominarán perlas anti RF dos. Lave las perlas de la suspensión Resus en un mililitro de tampón de abeja.

A continuación, centrifugar las perlas como antes para separar las dos perlas anti RF del tampón B. Repita este procedimiento de lavado dos veces. Después de lavar las perlas, mezcle un mililitro del extracto libre de células con 150 microlitros de dos perlas anti RF e incube en una rueda giratoria a cuatro grados centígrados durante dos horas después de la incubación. Centrifugar la mezcla a 10.000 Gs para separar el extracto libre de células de las perlas.

Retire el sobrenadante y trátelo de nuevo con otros 150 microlitros de dos perlas anti RF antes de repetir la incubación y tirar hacia abajo una vez más. Dispense la solución final de extracto libre de células agotada de RF dos en microtubos a 100 microlitros por tubo. Congele las alícuotas con una mezcla de hielo seco, etanol o nitrógeno líquido y almacene a menos 60 o menos 80 grados centígrados.

Prepare la reacción de PCR combinando la plantilla de plásmido que contiene las secuencias a traducir, oligo desoxinucleótidos, DTPs, ADN polimerasa intacta en tampón de PCR de estrategia. Una vez preparada la muestra de PCR, se realiza la reacción de amplificación para precipitar el ADN con el fin de purificar los productos de PCR añadiendo un décimo volumen de acetato de sodio de tres molares pH 5,2 y dos volúmenes de etanol helado. Después de repetir el procedimiento de precipitación una vez más, suspendemos el ADN resultante en 100 microlitros de percarbonato de datilo o agua tratada con dsy.

Verificar la integridad de los productos de PCR por electroforesis en agrogeles. Por lo general, este procedimiento produce 100 microgramos de un producto de ADN de 600 pares de bases. Prepare una reacción de transcripción in vitro de 100 microlitros en agua tratada en profundidad mezclando cinco microgramos del fragmento de ADN generado por PCR con ribonucleótidos biotina marcados con UTP y mezcla de enzimas T seven.

Incubar la mezcla de reacción a 37 grados centígrados durante tres horas. Para cuantificar la cantidad de ARNm obtenido, elimine la plantilla de ADN añadiendo D ns libres de ARN. Incubar la reacción a 37 grados centígrados durante 10 minutos.

Para purificar los productos de ARNm, precipite el ARN dos veces agregando un décimo volumen de acetato de sodio de tres molares pH 5.2 y dos volúmenes de etanol frío resuspenda el ARNm precipitado en 100 microlitros de agua tratada con dpci. Verificar la integridad de los productos de ARNm marcados con biotina por electroforesis en geles de aros. Por lo general, este procedimiento produce entre uno y dos miligramos de un producto de ARNm marcado con biotina de 600 nucleótidos para comenzar el aislamiento de los ribosomas traducentes que contienen un péptido. La mezcla de reacción de traducción in vitro TRNA 500 microlitros se prepara en agua tratada.

En primer lugar, prepare la mezcla de reacción tamponada descrita en el protocolo escrito adjunto y, a continuación, añada 75 M de cada uno de los aminoácidos, excepto el que será sustituido por un aminoácido radiactivo. A continuación, agregue de 20 a 50 microlitros de extracto libre de células agotadas RF dos a la solución tampón que contiene los aminoácidos. Incubar la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente para permitir la activación de los ribosomas.

Una vez activados los ribosomas. Agregue de 10 a 15 microgramos de ARNm marcados con biotina a la muestra. Incubar la mezcla de reacción a 37 grados centígrados durante 10 minutos.

Mientras tanto, prepare tres mililitros de perlas paramagnéticas de estreptavidina o SMB en el tampón C. Después de la incubación, agregue la suspensión de SMP a la mezcla de reacción de traducción. Incubar la nueva suspensión a temperatura ambiente durante 10 minutos. Separe el SMB de la mezcla aplicando un campo magnético utilizando soportes de separación magnética. Resus.

Suspenda el SMB en el búfer C y vuelva a separar las perlas con el soporte magnético. Después de repetir este procedimiento de lavado dos veces, vuelva a suspender las perlas en 500 microlitros de tampón C.Store la suspensión en hielo y realice el siguiente procedimiento inmediatamente. Para visualizar el péptido TRNA, mezcle 10 microlitros de SMB suspendido y tampón C con 10 microlitros de tampón de carga, resuelva los componentes unidos a las perlas ejecutando las muestras en geles de poliacrilamida tricaria al 10%.

Seque los geles con un secador de gel al vacío. A continuación, verifique la integridad y la purificación del péptido ARNT exponiendo el gel seco a una película de rayos X. Para analizar el ARN ribosómico, combine 190 microlitros de dos soluciones de EDTA milimolar preparadas con agua tratada con dpci, 200 microlitros de fenol equiparado con agua y 10 microlitros de una suspensión de perlas.

Mezclar la suspensión resultante mediante un vórtice vigoroso. Separe la fase inorgánica de la fase orgánica por centrifugación a 10, 000 Gs durante tres minutos a temperatura ambiente, recoja la capa superior de agua en un nuevo microtubo, precipite el ARN de la capa de agua agregando un décimo volumen de acetato de sodio tres molares pH 5.21 microlitro de 20 miligramos por mililitro de solución de glucógeno, y dos volúmenes de etanol helado. Volver a suspender el ARN precipitado en 10 microlitros de agua tratada con dpci.

Verificar la integridad de los ARN ribosómicos por electroforesis en geles niros. Por lo general, 50 microlitros de suspensión batida producen un microgramo de ARN ribosómico. Aquí se presentan los resultados de una serie de análisis que evalúan la calidad y funcionalidad de los ribosomas traductores aislados.

La observación de una banda única resuelta en geles de poliacrilamida indica la presencia de polipéptidos unidos a los ARNm marcados con biotina unidos al SMB. La purificación de ARN ribosómicos. El uso de este procedimiento también establece la presencia de ribosomas unidos a estos ARNm marcados con biotina.

La adición de purmicina, un antibiótico que induce la actividad de la péptido transferasa del ribosoma, da como resultado la escisión de los ARNt del péptido naciente. Esto se observa como un cambio en el patrón de migración del polipéptido aislado en geles de poliacrilamida. En conjunto, estos datos indican que los ARNm marcados con biotina unidos al SMB contienen ribosomas funcionales con ARNt peptídicos.

El aislamiento de ribosomas traducentes que contienen ARNt de péptidos específicos permite el estudio de los efectos de los ARNt de péptidos, antibióticos y otras moléculas sobre la función y la estructura del ribosoma. En los ejemplos presentados aquí, el antibiótico s parsamyn y el aminoácido triptófano inhiben la escisión hidrolítica del naciente TNAC tRNA peptídico tRNA por RF dos. En los ribosomas aislados.

La interacción del triptófano o micina con el ribosoma también induce cambios estructurales en algunos nucleótidos que constituyen el 23 S-R-R-N-A del ribosoma traductor. Una vez dominada, la parte principal de esta técnica se puede realizar en cinco horas de realizar correctamente siguiendo estos procedimientos. Otros métodos, como el crioelectromagnético, son análisis estructurales adicionales que se pueden realizar para responder preguntas adicionales sobre la estructura del ribosoma que contiene pepina única, ARN.