Aislamiento de ratón las células epiteliales respiratorias y la exposición al humo del cigarrillo Experimental de la interfaz de aire líquido

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células epiteliales de las vías respiratorias con el fin de estudiar los efectos tóxicos de la exposición al humo del cigarrillo. Esto se logra diseccionando primero las tráqueas de los ratones y luego digiriendo la tráquea en solución de pronasa. El segundo paso del procedimiento es recolectar células epiteliales y propagar el cultivo de quid.

El tercer paso es diferenciar los cultivos en una interfaz aire-líquido. El paso final del procedimiento es exponer las células epiteliales al humo apical del cigarrillo en la interfaz aire-líquido. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran una monocapa de células epiteliales completamente diferenciada mediante microscopía de inmunofluorescencia.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, como los efectos de la exposición al humo del cigarrillo en la morfología de CLIA y los marcadores bioquímicos de lesión celular inducidos por el humo del cigarrillo. Comience los preparativos para este procedimiento un día antes de la disección preparando jamones. F 12 medios que contienen antibióticos radioaficionados F 12 medios que contienen antibióticos y 20%F-B-S-M-T-E-C, medio básico que contiene antibióticos.

Medio MTEC con 5%FBS, soluciones madre de ácido retinoico de una solución de ADN y medio de proliferación MTEC de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos que se vayan a utilizar en la disección el día de la disección. Asegúrese de que el área de disección esté limpia y de que todas las herramientas de disección estén a mano.

Esterilizar la campana de cultivo de tejidos. Luego trabajando en la campana de cultivo de tejidos. Prepare una solución de pronasa al 0,15%.

Añade 15 miligramos de pronase a 10 mililitros de jamones. F 12 medios que contienen antibióticos en un tubo cónico de 50 mililitros. Coloque sobre hielo hasta su uso.

Las tráqueas de ratón se diseccionan de ratones Mediante procedimientos quirúrgicos estándar, desinfecte el tubo que contiene las tráqueas y colóquelo en la campana de cultivo de tejidos. Transfiera el tejido de la tráquea a una placa de Petri de 100 milímetros con medios jams F 12 que contengan antibióticos. Use pinzas quirúrgicas estériles para extraer el tejido conectivo de las tráqueas.

Luego transfiera las tráqueas limpias a la segunda placa de Petri de 100 milímetros que contiene jamones. F 12 medios con antibióticos. Use tijeras de disección para cortar las tráqueas a lo largo del eje vertical y exponer el lumen.

Transfiera las tráqueas al tubo cónico de 50 mililitros que contiene 10 mililitros de solución de Pronase y colóquelas en el refrigerador para incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Por último, prepare las placas transwell tratadas con colágeno uno para su uso. Al día siguiente, agregue 50 miligramos de colágeno, uno por mililitro de pipeta de ácido acético 0.02 N un mililitro de esta solución en cada pocillo de un 12.

Placa de pozo trans pozo. Envuelva la placa en película para y dejemos reposar toda la noche a temperatura ambiente en la campana de cultivo de tejidos. Al día siguiente.

Invierta suavemente el tubo que contiene las tráqueas del ratón de 10 a 12 veces. A continuación, deje que el contenido del tubo se incube durante 30 a 60 minutos adicionales a cuatro grados centígrados. Trabajando en la campana de cultivo de tejidos pipetear 10 mililitros de radioaficionados F 12 medios que contienen antibióticos en 20%FBS en el tubo cónico que contiene el tejido traqueal digerido e invertir 12 veces.

A continuación, pipetee 10 mililitros de medios de radioaficionados F 12 que contienen antibióticos al 20%FBS en cada uno de los tres tubos cónicos de 15 mililitros. Utilice una pipeta de pasta estéril para transferir el tejido traqueal de la solución de pronasa al primero de los tubos que contienen jamones suplementados. F 12 medios de comunicación.

Coloque la solución de Pronase en el cubra con hielo el tubo que contiene el tejido traqueal e invierta suavemente 12 veces para mezclar. Luego, con la pipeta para pasta, transfiera el tejido traqueal al segundo tubo cónico de 15 mililitros e invierta este tubo 12 veces. Repita el procedimiento de transferencia e inversión utilizando el tubo cónico final de 15 mililitros.

Por último, utilice la pipeta de pasta para retirar y desechar el tejido traqueal. A continuación, extraiga la solución de pronase del hielo y combine los tres volúmenes de 15 mililitros de medios de jamones F 12 suplementados con la solución de pronase. Centrifugar la muestra en la centrífuga refrigerada a cuatro grados centígrados durante 10 minutos a 1.400 rotaciones por minuto después de la centrifugación desechar el supena, luego pipetear aproximadamente 100 a 200 microlitros de ADN, una solución por tráquea en el pellet y reus.

Suspenda con golpecitos suaves. Incuba las células en hielo durante cinco minutos. Centrifugar el tubo a 1.400 rotaciones por minuto durante cinco minutos de cuatro grados centígrados y desechar el supinado.

A continuación, pipetee ocho mililitros de medio MTEC que contenga un 10% de FBS en el pellet y vuelva a suspender la placa. La suspensión celular en una placa paria se incuba a 37 grados centígrados en una atmósfera de 95% de aire y 5% de dióxido de carbono durante cinco o seis horas. Este es un paso de selección negativo para la eliminación de fibroblastos.

Después de la incubación, recoja la suspensión celular de la placa paria y pipetee en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, enjuague la placa dos veces con cuatro mililitros de medio MTEC que contenga un 10% de FBS. Transfiera ambos lavados al tubo cónico de 50 mililitros que contiene la suspensión celular.

Pipetear un mililitro de la suspensión celular en un tubo de einor. Reserve esta alícuota para el análisis de espín por citos y la centrífuga de recuento de células. El tubo cónico de 50 mililitros que contiene los 15 mililitros restantes de suspensión celular es de 1.400 rotaciones por minuto a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

Durante la centrifugación, retire y deseche la solución de colágeno de la placa transwell previamente preparada. Deje que la placa se seque bajo el capó durante cinco minutos, luego lave dos veces con PBS después del lavado final. Aspire todo el PBS y pipetee 1,5 mililitros de medio de proliferación en el compartimento basal del pocillo trans después de la centrifugación.

Deseche el supinato y vuelva a suspender el pellet de células en un volumen adecuado de medios de proliferación para facilitar la siembra de 7,5 veces 10 a las cuatro a una veces 10 a las cinco células en 500 microlitros de suspensión por pocillo. Pipetear 500 microlitros de suspensión celular en la superficie apical de la membrana de policarbonato transworld. Insertar. Incubar los cultivos MTEC sumergidos a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada que contenga 95% de aire y 5% de dióxido de carbono durante siete a 10 días con cambios de medios cada dos días.

Mida la resistencia de las células epiteliales trans con un intervalómetro. Cuando la resistencia epitelial alcanza los 1000 ohmios por centímetro cuadrado y los cultivos parecen confluentes. Conversión a cultivo LI mediante la extirpación de la media apical.

También reemplace los medios basales con medios básicos MTEC que contengan 2% de suero nuevo y ácido retinoico. Incubar los cultivos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 10 a 14 días para permitir la diferenciación con cambios de medio cada dos días. Primero, configure la máquina de fumar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Registre el peso de un filtro flexible de poste no utilizado. Luego coloque el filtro en el soporte de acero inoxidable en línea en el tubo de muestreo que va desde el puerto de muestreo en la cámara de ahumado hasta la bomba de flujo constante. Conecte la unidad de muestreo al medidor de gas mediante un tubo de salida mediante un sistema de exposición de celda CS.

Exponga el lado apical de las culturas transmundmundistas al humo de los cigarrillos convencionales de tres cigarrillos con filtro de referencia de investigación R four F. Exponga las células al humo de uno o dos cigarrillos. Exponga los cultivos de control al aire ambiente durante un período de exposición equivalente después de que el muestreo de gas gane peso.

En el filtro pool flex, se normaliza el material total depositado en el filtro en miligramos. Para el volumen total de aire muestreado, el humo de uno a dos cigarrillos generalmente produce de 100 a 200 miligramos por metro cúbico de TPM. Después de la exposición al cigarrillo, recoja las células y los medios basales para realizar análisis adicionales.

Este es un ejemplo de una monocapa sana de células epiteliales respiratorias de ratón teñida para células epiteliales nucleares y marcadores C. El aislamiento, la proliferación y la diferenciación epitelial exitosos utilizan una monocapa intacta con una morfología de adoquín. Los cultivos están esencialmente libres de fibroblastos.

Estas imágenes de micrografía electrónica son representativas de cultivos MTEC sanos y representan la ultraestructura de los diversos tipos de células y la morfología de CELIA. Este video de imágenes de células vivas muestra la morfología C saludable de los cultivos MTEC. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar las células epiteliales traqueales de ratón, diferenciarlas en una interfaz de aire líquido y exponerlas al humo del cigarrillo convencional.