Aislamiento de ratón las células epiteliales respiratorias y la exposición al humo del cigarrillo Experimental de la interfaz de aire líquido

El objetivo general de este procedimiento es aislar células epiteliales de las vías respiratorias para estudiar los efectos tóxicos de la exposición al humo del cigarrillo. Esto se logra primero mediante la disección de tráqueas de ratón y luego digiriendo las tráqueas en solución de pronasa. El segundo paso del procedimiento consiste en recolectar las células epiteliales y propagar el cultivo en medio líquido.

El tercer paso consiste en diferenciar los cultivos en una interfase aire-líquido. El paso final del procedimiento es exponer las células epiteliales al humo de cigarrillo apical en la interfase aire-líquido. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran una monocapa completamente diferenciada de células epiteliales mediante microscopía de inmunofluorescencia.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, como los efectos de la exposición al humo del cigarrillo sobre la morfología de las CLIA y los marcadores bioquímicos inducidos por el humo del cigarrillo relacionados con el daño celular. Comience los preparativos para este procedimiento un día antes de la disección preparando los hams. Medio F 12 que contiene antibióticos, hams medio F 12 que contiene antibióticos y 20%F-B-S-M-T-E-C, medio básico que contiene antibióticos.

Medio MTEC con ADN de solución única de FBS al 5 %, soluciones stock de ácido retinoico y medio de proliferación MTEC según las instrucciones del protocolo escrito. Esterilice todas las herramientas quirúrgicas que se utilizarán en la disección el día de la misma. Asegúrese de que el área de disección esté limpia y de que todas las herramientas de disección estén a mano.

Sterilice la cabina de flujo laminar. Luego, trabajando dentro de la cabina de flujo laminar, prepare una solución de 0,15 % de pronasa.

Añada 15 miligramos de pronasa a 10 mililitros de medio Hams F-12 que contenga antibióticos en un tubo cónico de 50 mililitros. Coloque en hielo hasta su uso.

Las tráqueas de ratón se disecan a partir de ratones utilizando procedimientos quirúrgicos estándar; desinfecte el tubo que contiene las tráqueas y colóquelo en la cabina de cultivo de tejidos. Transfiera el tejido traqueal a una placa de Petri de 100 milímetros con medio Ham's F12 que contenga antibióticos. Utilice pinzas quirúrgicas estériles para eliminar el tejido conectivo de las tráqueas.

Luego, transfiera las tráqueas limpias a la segunda placa de Petri de 100 milímetros que contiene medio Ham's F12 con antibióticos. Utilice tijeras de disección para cortar las tráqueas a lo largo del eje vertical y exponer el lumen.

Transfiera las tráqueas al tubo cónico de 50 mililitros que contiene 10 mililitros de solución de pronasa y colóquelo en el refrigerador para incubar durante la noche a cuatro grados Celsius. Finalmente, prepare placas transwell recubiertas con colágeno tipo uno para su uso. Al día siguiente, agregue 50 miligramos de colágeno, uno por mililitro de ácido acético 0,02 N; pipetee un mililitro de esta solución en cada pocillo de una placa de 12.

Placa de pozo profundo. Envuelva la placa con película de parafina y déjela reposar durante la noche a temperatura ambiente en la cabina de cultivo celular. El día siguiente.

Invierta suavemente el tubo que contiene las tráqueas de ratón de 10 a 12 veces. Luego, deje que el contenido del tubo incube durante 30 a 60 minutos adicionales a cuatro grados Celsius. Trabajando en la campana de cultivo de tejidos, pipetee 10 mililitros de medio Hams F12 que contenga antibióticos en FBS al 20% hacia el tubo cónico que contiene el tejido traqueal digerido e inviértalo 12 veces.

Luego pipetee 10 mililitros de medio Ham's F12 que contenga antibióticos en FBS al 20 % en cada uno de tres tubos cónicos de 15 mililitros. Utilice una pipeta estéril de pasta para transferir el tejido traqueal desde la solución de pronasa al primero de los tubos que contienen el medio Ham's F12 suplementado.

Coloque la solución de pronasa en hielo, tape el tubo que contiene el tejido traqueal e inviértalo suavemente 12 veces para mezclar. Luego, utilizando la pipeta de pasta, transfiera el tejido traqueal al segundo tubo cónico de 15 mililitros e invierta este tubo 12 veces. Repita el procedimiento de transferencia e inversión utilizando el último tubo cónico de 15 mililitros.

Finalmente, utilice la pipeta de pasta para retirar y desechar el tejido traqueal. A continuación, retire la solución de pronasa del hielo y combine los tres volúmenes de 15 mililitros de medio Hams F12 suplementado con la solución de pronasa. Centrifugue la muestra en la centrífuga refrigerada a cuatro grados Celsius durante 10 minutos a 1.400 rotaciones por minuto; tras la centrifugación, deseche el sobrenadante, luego pipetee aproximadamente de 100 a 200 microlitros de la solución de ADNasa I, una solución por tráquea, sobre el precipitado y resuspenda.

Suspender mediante golpecitos suaves. Incubar las células en hielo durante cinco minutos. Centrifugar el tubo a 1.400 rotaciones por minuto durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y desechar el sobrenadante.

Luego pipetee ocho mililitros de medio MTEC que contenga 10 %FBS sobre el precipitado y resuspenda la placa. Incube la suspensión celular en una placa paria a 37 grados Celsius en una atmósfera de 95 %aire y 5 %dióxido de carbono durante cinco a seis horas. Este es un paso de selección negativa para la eliminación de fibroblastos.

Tras la incubación, recolecte la suspensión celular de la placa paria y pipetéeela en un tubo cónico de 50 mililitros. Luego, enjuague la placa dos veces con cuatro mililitros de medio MTEC que contenga 10% de FBS. Transfiera ambos lavados al tubo cónico de 50 mililitros que contiene la suspensión celular.

Pipetee un mililitro de la suspensión celular en un tubo cónico. Reserva esta alícuota para análisis de citocentrifugación y recuento de células. El tubo cónico de 50 mililitros que contiene los 15 mililitros restantes de la suspensión celular se centrifuga a 1.400 revoluciones por minuto a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.

Durante la centrifugación, retire y deseche la solución de colágeno de la placa de transbienel previamente preparada. Deje que la placa se seque bajo la campana durante cinco minutos, luego lávela dos veces con PBS después del lavado final. Aspire todo el PBS y pipetee 1,5 mililitros de medio de proliferación en el compartimento basal del transbienel tras la centrifugación.

Deseche el sobrenadante y resuspenda el botón celular en un volumen adecuado de medio de proliferación para facilitar la siembra de 7,5 × 10⁴ a 1 × 10⁵ células en 500 µL de suspensión por pocillo. Pipetee 500 µL de la suspensión celular sobre la superficie apical del inserto de membrana de policarbonato transwell. Incube los cultivos de MTEC sumergidos a 37 °C en un incubador humedecido que contenga 95 % de aire y 5 % de dióxido de carbono durante siete a 10 días, con cambios de medio cada dos días.

Mida la resistencia transepitelial utilizando un intervalómetro. Cuando la resistencia epitelial alcance 1000 ohmios por centímetro cuadrado y los cultivos parezcan confluentes, conviértalos a un cultivo LI eliminando el medio apical.

También sustituya el medio basal por medio básico MTEC que contenga 2% de suero nuevo y ácido retinoico. Incube los cultivos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 10 a 14 días para permitir la diferenciación, con cambios de medio cada dos días. Primero, prepare la máquina de cigarrillos según las instrucciones del fabricante.

Registre el peso de un filtro de poliéster sin usar. Luego coloque el filtro en el soporte de acero inoxidable en línea sobre el tubo de muestreo que va desde el puerto de muestreo en la cámara de fumado hasta la bomba de flujo constante. Conecte la unidad de muestreo al medidor de gas mediante un tubo de salida utilizando un sistema de exposición con celda CS.

Exponga el lado apical de los cultivos transbienales al humo del cigarrillo convencional procedente de tres cigarrillos de referencia para investigación con filtro R4F. Exponga las células al humo de uno a dos cigarrillos. Exponga los cultivos control al aire ambiente durante un período de exposición equivalente tras la toma de muestras de gas y aumento de peso.

Se normaliza la cantidad total de material depositado en el filtro de flexión de piscina, en miligramos. Para el volumen total de aire muestreado, el humo de uno a dos cigarrillos típicamente produce de 100 a 200 miligramos por metro cúbico de MPT. Tras la exposición al cigarrillo, recolecte las células y el medio basal para análisis posteriores.

Este es un ejemplo de una monocapa sana de células epiteliales respiratorias de ratón teñidas para el marcador nuclear, la célula epitelial y los marcadores C. El aislamiento, la proliferación y la diferenciación epiteliales exitosos utilizan una monocapa intacta con una morfología de adoquín. Las culturas son esencialmente libres de fibroblastos.

Estas imágenes de micrografía electrónica son representativas de cultivos MTEC sanos y muestran la ultraestructura de los diversos tipos celulares y la morfología de los CILIOS. Este video de imagenología de células vivas muestra la morfología C sana en cultivos MTEC. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células epiteliales traqueales de ratón, diferenciarlas en una interfase aire-líquido y exponerlas al humo principal del cigarrillo.