Aislamiento y cultivo de células de la zona nefrogénica del riñón de embriones de ratón

El objetivo general de este procedimiento es generar un cultivo primario de células de la zona nefrogénica a partir del riñón en desarrollo. Esto se logra primero mediante la disección de riñones de embriones de día 17,5. El siguiente paso del procedimiento consiste en eliminar las cápsulas renales.

A continuación, se realiza una digestión enzimática limitada de los órganos para desprender las células del mesénquima de la cúpula y del estroma cortical de la zona nefrogénica. El paso final del procedimiento consiste en sembrar las células sobre fibronectina y cultivarlas en medio libre de suero. Finalmente, se pueden obtener resultados que demuestran una población purificada de células de la zona nefrogénica mediante tinción inmunológica de marcadores específicos.

Aunque este método puede utilizarse para estudiar la señalización celular, también puede aplicarse para comprender los requisitos del sustrato para la expansión celular. Por ejemplo, para técnicas de injerto, el procedimiento será demostrado por Derek Adams, quien es técnico en mi laboratorio, y Aaron Brown, quien es investigador posdoctoral en mi laboratorio. Después de preparar las soluciones necesarias y tratar las placas de cultivo celular según el protocolo escrito, inicie la disección del riñón embrionario de ratón sacrificando a la madre en el día E 17.5.

De acuerdo con las directrices de su institución, retire el útero y colóquelo en una placa de Petri que contenga varios mililitros de salino tamponado con docos sate o DPVS con calcio y magnesio. Bajo un microscopio estereoscópico, utilice pinzas de relojero para extraer cada embrión y otro par de pinzas para decapitarlo. Una vez que toda la camada haya sido extraída del útero y decapitada, transfiera los embriones a una placa de Petri limpia que contenga suficiente DPBS con calcio y magnesio para cubrir los embriones.

Deje atrás la mayor cantidad posible de sangre y restos de tejido de cada embrión; con pinzas, realice una incisión circunferencial en la pared abdominal a la altura de las umbilicales. Luego, coloque el embrión boca arriba y sujete los hombros con un par de pinzas. Con un segundo par de pinzas, retire los órganos internos desde los pulmones hasta la vejiga.

Los riñones estarán adheridos a la parte posterior del conjunto de órganos internos. A continuación, separe suavemente los riñones del resto de los órganos. Tenga cuidado de mantener los riñones conectados entre sí.

Luego sostenga el tejido entre los riñones con un par de pinzas y tome la glándula suprarrenal adherida a la cápsula de uno de los riñones con el otro par de pinzas. Retire suavemente la cápsula del riñón. Tenga cuidado de no dañar el riñón.

Asegúrese de eliminar cualquier cápsula restante del riñón, así como el útero si aún está adherido. Repita el procedimiento con el riñón restante. Finalmente, corte una pipeta de transferencia a un diámetro adecuado y transfiera suavemente los riñones a un tubo de poliestireno de cinco mililitros de HBSS.

Repita el aislamiento de riñón para cada embrión y reúna los riñones en el tubo, hasta ocho riñones por tubo, en un ambiente estéril. Comience el proceso de digestión enzimática eliminando primero la solución HBSS del tubo de cinco mililitros que contiene los riñones, utilizando una pipeta. Tenga cuidado de evitar el contacto con los riñones y agregue inmediatamente 1,5 mililitros de colagenasa, una solución digestiva de pancreatina.

Repita para cada tubo de riñones y tape los tubos. Luego, colóquelos en un agitador rotatorio en un incubador a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Justo antes de finalizar la incubación, agregue tres microlitros de ADN de una unidad por microlitro a un tubo de poliestireno fresco de cinco mililitros para cada digestión que se realice.

Después de la incubación, retire rápidamente el digestivo del incubador y agregue 75 microlitros de FBS invirtiendo tres veces para mezclar. Déjelo reposar a temperatura ambiente durante dos minutos. Luego, transfiera 1,4 mililitros de la suspensión celular a un tubo de poliestireno de cinco mililitros que contenga la Mezcla de ADN y colóquelo en un mutador dentro de un incubador a 37 grados Celsius durante 10 minutos.

Tras la incubación, transfiera cada suspensión celular a un tubo eppendorf de 1,5 mililitros y centrifugue a 325 ×g durante cinco minutos. A continuación, retire el sobrenadante, centrifugue los tubos a 325 ×g durante cinco minutos. Resuspenda el precipitado en un mililitro de H-B-S-S con 5 % de F-B-S por pipeteo arriba y abajo de cinco a seis veces.

Tape cada tubo antes de pasar a la siguiente muestra. Tras la centrifugación, retire el SNAT y añada 500 microlitros de KSFM con aditivos a cada tubo después de que se haya agregado medio a todos los tubos. Resuspenda suavemente cada pellet celular pipeteando de arriba abajo de cinco a seis veces con una micropipeta de un mililitro. Combine todas las suspensiones celulares en un tubo nuevo de poliestireno de cinco mililitros.

Ahora filtre la suspensión celular a través de un filtro cónico de 40 micrones previamente humedecido y recoja el filtrado en un tubo nuevo de poliestireno. Evite tocar el filtro con la punta de la pipeta una vez que se haya recolectado todo el filtrado. Vuelva a filtrar el sobrenadante una segunda vez a través de un filtro cónico nuevo y previamente humedecido.

Retire el colador y tape el tubo con uno estéril nuevo de un tubo fresco. Cuente las células y siembre a una densidad de 100.000 a 200.000 células por centímetro cuadrado en KSM con aditivos en una placa de cultivo con codificación de fibra. Permita que las células de la zona nefrogénica se recuperen y se adhieran en un incubador humedecido a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante dos a cuatro horas antes de cualquier estimulación para el experimento.

Se muestra aquí un contraste de fase. Imagen a 20x de células de la zona nefrogénica sembradas a 200.000 células por centímetro cuadrado y cultivadas durante 24 horas. En esta imagen, las células de la zona nefrogénica fueron marcadas con anticuerpo anti PAX dos, específico para células progenitoras de nefronas y mostrado en rojo, mientras que los núcleos en azul fueron contramarcados con DAPI.

Se muestra una imagen en contraste de fases de un grupo de progenitores de nefronas a un aumento de 40 x. Para demostrar aún más la especificidad, se aislaron células de la zona nefrogénica de embriones que poseen laxy bajo el control del promotor Fox D uno, el cual se expresa en la población de células estromales. Dentro de la zona nefrogénica del riñón en desarrollo, las células se tiñeron luego con DAPI Titan fi para los núcleos en azul, foin para la F actina en verde y anticuerpo anti beta lactasa en rojo.

Una vez dominado, se puede generar un cultivo primario en monocapa de células de la zona nefrogénica en aproximadamente dos horas. Estos cultivos facilitan estudios rápidos y de alto rendimiento de las vías de señalización celular en el desarrollo de los progenitores del nefrón, ya que son altamente propicios para la transducción viral, el tratamiento con proteínas recombinantes y el tratamiento con moléculas pequeñas. Además, se pueden utilizar procedimientos adicionales de clasificación celular para aislar tipos celulares específicos a partir de estos cultivos.