Modificado ES / OP9 Co-cultivo Protocolo establece Caracterización mejorada de la progenie hematopoyética

El objetivo general del siguiente experimento consiste en diferenciar células madre embrionarias murinas en diversas líneas hematopoyéticas primitivas y definitivas. Y para caracterizar todos los descendientes de las células madre embrionarias, la diferenciación celular hematopoyética murina se logra colocando las células madre embrionarias sobre una capa estromal de células OP9 M de fresa fluorescentemente marcadas. Cada día de diferenciación o co-cultivo representa las distintas etapas del desarrollo hematopoyético en el momento adecuado de recolección.

La progenie de células ES diferenciadas puede separarse de la línea celular estromal M de fresa OP nueve mediante clasificación celular. Este protocolo de diferenciación de células ES reproduce la hematopoyesis primitiva y definitiva tal como se observa in vivo, y puede utilizarse para caracterizar defectos hematopoyéticos asociados con líneas celulares ES knockout sin el uso de embriones. Hola, bienvenido al laboratorio de la Dra. Judith Gassen en el Centro Integral de Cáncer Johnson de la UCLA.

Mi nombre es Alicia Poz. La principal ventaja de la técnica que voy a mostrarles hoy frente a los métodos existentes de co-cultivo con OP9 es que este procedimiento permite el paso de todas las células del día cinco y del día ocho, así como la separación completa de toda la progenie derivada de las células ES. Las células estromales OP9 se cultivan en medio de cultivo celular OP9, el cual debe cambiarse cada dos días.

Las células OP nine deben subcultivarse tres días antes de que sean necesarias para el cultivo conjunto. Es importante tener en cuenta que durante el mantenimiento, las células OP nine nunca deben mantenerse a una densidad superior al 90 % de confluencia. Primero lave las células dos veces con PBS, luego agregue 0,1 % de tripsina-EDTA PRECALENTADA durante cinco minutos cuando las células se hayan desprendido. AÑADA medio de cultivo para células OP nine y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros.

Centrifugar los tubos para sedimentar las células a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y resuspender las células en medio de cultivo fresco M de células OP nine de fresa. Sembrar las células a una densidad mínima de 10 a la cuarta células por centímetro cuadrado en la placa el día en que comience el experimento de co-cultivo. Las células OP nine que fueron pasadas tres días antes deben estar confluentes. Las células ES deben cultivarse según el protocolo estándar para su línea celular específica.

Lave las células ES dos veces con PBS con tripsina y 0,25 % de tripsina-EDTA, e incube durante cinco minutos a 37 grados Celsius. A continuación, agregue medio de diferenciación en co-cultivo a las células ES y transfiéralas a tubos cónicos de 15 mililitros. Precipite las células ES a 400 ×g durante cinco a siete minutos a temperatura ambiente.

Después de eliminar el sobrenadante, resuspenda las células ES en medio de diferenciación para co-cultivo. Utilice una aguja de extremo romo de calibre 21 para obtener una suspensión de células individuales. Cuente las células utilizando azul de tripano y un hemocitómetro.

Ahora recupere el matraz con M fresa. OP nueve células del incubador. Retire el medio de las células OP nueve y agregue medio de diferenciación en co-cultivo al plato de matraz.

Una vez 10 a la tercera células ES por centímetro cuadrado para cada matraz de células M strawberry OP nueve; incubar las células a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono con humedad. Este es el día cero y el cultivo co-cultivo debe tener este aspecto. Tres días después del inicio del co-cultivo de células ES M strawberry OP nueve.

Se observan principalmente grandes agrupaciones planas de progenie derivada de ES con bordes definidos, y algunos remolinos de células habrán comenzado a formarse. Retire cuidadosamente el medio del cultivo co-cultivo y sustitúyalo por medio de diferenciación fresco cinco días después del inicio del co-cultivo. Una diferenciación adecuada de las células ES sobre una capa confluente de células M strawberry OP9 debería dar lugar a hemangioblastos, que aparecen como mundos de células apiladas.

El aspecto más crítico de este procedimiento consiste en asegurarse de obtener una diferenciación adecuada el día cinco del cultivo conjunto. En este momento, se podrían observar las colonias de eritroblastos no solo microscópicamente, sino también macroscópicamente. Lave cuidadosamente el cultivo conjunto dos veces con PBS y las células con tripsina helada con tripsina-EDTA al 0,25 %, retire las células del matraz con medio de diferenciación ES y transfiera a un tubo. Precipite las células a 400 ×g durante siete minutos a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y agregue medio nuevo. Luego, use una aguja romo de calibre 21 para resuspender las células y asegurar una suspensión de células individuales; cuente las células utilizando un hemocitómetro. Debe haber un aumento de 100 a 150 veces en el número de células ES desde el día cero. Vuelva a sembrar las células en cultivo co-cultivadas sobre una nueva capa de células OP9 confluentes M de fresa el día ocho o nueve, y el día 12 cuente las células nuevamente. Retire el medio con las células hematopoyéticas y resérvelo.

Lave la monocapa una vez con PBS para eliminar las células hematopoyéticas en suspensión y reserve. Añada tripsina-EDTA al 0,25 % al frasco después de que las células adheridas a la trisina hayan sido lavadas, desprenda las células del frasco con medio de diferenciación ES y añádalas a las células hematopoyéticas encontradas en suspensión. Centrifugue las células a 400 G durante siete minutos a temperatura ambiente. Finalmente, re suspenda las células utilizando una aguja de extremo romo de calibre 21 y cuente las células. Las células ya están listas para ser replantadas o utilizadas en ensayos posteriores.

El sistema de co-cultivo ES M fresa OP nueve se puede utilizar para modelar el desarrollo hematopoyético descrito. A continuación se muestra una visión general de los días del curso temporal de co-cultivo en los que los descendientes diferenciados de ES deben transferirse a nuevas células M fresa OP nueve. La diferenciación adecuada de las células ES sobre una capa confluente de células M fresa OP nueve dará como resultado la producción de positivos para flick uno.

Los angioblastos en el día cinco del cultivo conjunto son los precursores mesodérmicos comunes para las líneas endotelial y hematopoyética y deben aparecer como acumulaciones de células, como se muestra en esta imagen. A medida que avanza el cultivo conjunto, deben aparecer agrupaciones de dos a cuatro células alrededor del día seis o siete y crecer hasta formar cúmulos celulares más grandes. Para el día ocho o nueve ya están presentes los precursores hematopoyéticos, mientras que las líneas hematopoyéticas diferenciadas terminalmente aparecen para el día 14.

En contraste, un cultivo conjunto con una diferenciación ESL inadecuada dará lugar a progenie derivada de ES que no presentará un patrón en forma de mundo al quinto día. La ausencia de células en un patrón en forma de mundo indica una formación inadecuada de blastos GIO. Un cultivo conjunto con una formación inadecuada de eblastos resultará finalmente en una diferenciación deficiente de la línea hematopoyética y debe descartarse siguiendo este protocolo modificado de cultivo conjunto ES OP nueve.

La progenie derivada de ES es negativa para fresa y puede separarse mediante citometría de flujo de las células positivas para fresa M. OP nueve células en cualquier día de co-cultivo para su evaluación. Aquí se muestran los resultados de un experimento representativo.

Los nueve protocolos de co-cultivo de células madre embrionarias (ES) publicados anteriormente se han centrado únicamente en el paso y la evaluación de las células flotantes no adherentes. En este protocolo modificado, se realiza el paso y se puede evaluar todas las células derivadas de ES, tanto las adherentes como las no adherentes. Esto conduce a un mayor rendimiento de células hematopoyéticas, permite la identificación de poblaciones celulares raras y posibilita la caracterización completa de toda la progenie de ES, tanto hematopoyética como no hematopoyética.