Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

Me llamo Allison Clavon. Soy ayudante de investigación del Dr. Alex Bishop en el Instituto de Investigación sobre el Cáncer Infantil Gree del Centro de Ciencias de la Salud de la UT en San Antonio, Texas. Hoy voy a demostrar cómo diseccionar un ojo de roedor para obtener una muestra completa del epitelio pigmentario retiniano.

Este tejido es de interés para el estudio del desarrollo y las enfermedades de la retina, y también es el sitio de un ensayo de reparación dirigida del ADN por homología in vivo. Así que comencemos. Aquí hay un ojo listo para la disección.

Primero, analicemos las estructuras anatómicas que utilizará como puntos de referencia durante todo el procedimiento. Estos son los ojos de un animal diluido. Aquí se encuentra el nervio óptico en la parte posterior del ojo opuesto.

Ese es el cristalino. El iris se ve a través del cristalino. El área blanquecina en la parte posterior del ojo es la esclerótica.

Por lo tanto, esta región se denomina límite esclerocorneal. El primer paso de la disección consiste en eliminar tejidos accesorios como el tejido conectivo muscular y el nervio óptico. A continuación, debe extraerse la córnea, realizando un corte circular.

En este punto, se puede extraer el cristalino, lo que resulta en una copa óptica hueca. A continuación, se realizan cuatro cortes desde la división esclerocorneal hacia la cabeza del nervio óptico. La estructura resultante se asemeja a una flor de cuatro pétalos.

Cada uno de estos cuatro pétalos se corta luego por la mitad, obteniendo una estructura que se asemeja a una flor de ocho pétalos. En esta etapa, la I puede presentar abultamientos en algunas zonas debido a su naturaleza esférica. Para contrarrestar esto y lograr una montura de orificio más plana, se pueden hacer ocho cortes más cortos justo más allá de los abultamientos.

Necesitará varios materiales a mano en su estación de trabajo, incluyendo un pipeta de 100 o 200 µL y puntas correspondientes, un portaobjetos X-P-B-S-A de 35 milímetros con cubreobjetos, glicerol al 90 % y esmalte de uñas transparente para la preparación de portaobjetos, un portaportas para secar los portaobjetos, una caja de toallitas Kim y un recipiente de desecho de cintura. Además de estos materiales comunes, también necesitará un juego de herramientas especializadas para microdisección, incluyendo pinzas rectas; pinzas anguladas a 45 grados se utilizan para sostener, girar y manipular generalmente el ojo durante toda la disección. Estas pinzas de 15 grados tienen un ángulo hacia arriba y también se usan para manipular y manejar el ojo.

Finalmente, necesitará un par de tijeras de resorte. Es muy importante que utilice tijeras de resorte en lugar de tijeras de estilo tradicional. Para esta disección, antes de comenzar, asegúrese de ajustar la altura de su silla de manera que, al sentarse erguido, sus ojos estén al nivel de los oculares.

Encorvarse sobre el microscopio provoca dolor de hombros y espalda e inhibe la calidad de sus disecciones. Para comenzar, vierta un XPBS en la tapa del recipiente de 35 milímetros. Luego, transfiera los ojos que planea diseccionar al recipiente.

Este es un ojo de un ratón C57 negro de tipo silvestre. Puede observarse muy pequeño, con un diámetro de aproximadamente tres milímetros y medio. La opacidad de la esclerótica le confiere un tono azulado.

El primer paso en la disección consiste en eliminar todos los tejidos extraños alrededor del ojo, como el tejido conectivo muscular y el nervio óptico. Aquí tengo las pinzas de 45 grados en la mano izquierda y las pinzas de 15 grados en la derecha. Puede utilizar un par de pinzas para sujetar el ojo mientras tira del tejido con el otro par.

Cuando se desprenda un trozo grande de tejido, limpie cuidadosamente la pinza sobre una toalla Kim. Tenga cuidado de no aplastar ni perforar el ojo. Uno de los beneficios de realizar esta disección en suspensión es que puede ver fácilmente el tejido conectivo alejándose del ojo.

Finalmente, llegará un punto en el que ya no pueda eliminar más tejido con pinzas. Sustituya sus pinzas con ángulo de 15 grados por tijeras de resorte. Utilice las tijeras de resorte para cortar el nervio óptico.

Utilice el borde exterior de la hoja para empujar el tejido hacia adelante, en dirección a la división esclerocorneal. Luego, corte y limpie suavemente las tijeras sobre una toallita kim. Veámoslo nuevamente.

Empuje el tejido hacia adelante, en dirección a la división corneoescleral, con el borde exterior de las tijeras cuando el tejido esté levantado. Recorte, siga empujando los fragmentos de tejido hacia adelante con el borde romo de las tijeras y luego elimínelos mediante recortes, hasta que todo el tejido extraño haya sido removido. Por lo general, hay dos bandas de tejido resistente en el ojo.

El primero está unido en la división esclerocorneal, y el segundo se muestra mientras se recorta. Aquí está aproximadamente a mitad de camino entre la división esclerocorneal y la cabeza del nervio óptico. El siguiente paso en la disección consiste en retirar la córnea y el cristalino.

Utilice la pinza de 45 grados para elevar un colgajo aproximadamente en la mitad de la córnea. Luego, use las tijeras de resorte para realizar una pequeña incisión en la base del colgajo. Introduzca la hoja inferior de las tijeras en la incisión, por debajo del iris.

Realice un corte hacia, pero sin llegar a, la división esclerocorneal. Ahora, gire lentamente el ojo 360 grados, realizando pequeños cortes alrededor. Intente mantener las tijeras por debajo del iris, cortando simultáneamente la córnea y el iris.

Se necesita mucha práctica para hacerlo tan fácilmente como lo muestro aquí. Una vez que se ha retirado la córnea, gire el ojo sobre su costado y presione suavemente sobre la parte externa del ojo para expulsar el cristalino. La estructura restante tendrá forma de copa a continuación.

El ojo debe dividirse en cuartos. Para hacerlo, gire el ojo sobre su costado e inserte la hoja inferior de sus tijeras de resorte. Realice un corte longitudinal hacia, pero sin llegar hasta, la cabeza del nervio óptico.

Para hacer esto, mantenga los brazos a los lados y las tijeras frente a usted, aproximadamente perpendiculares a su cuerpo y al corte del ojo. Realice el segundo corte directamente opuesto al primer corte. Tómese su tiempo para alinear correctamente y poder hacer un corte suave.

Realizar múltiples cortes puede causar irregularidades, pero si se alinean cuidadosamente, no son perceptibles; observe cómo puedo trabajar con esta forma esférica del ojo en lugar de en contra de ella, ya que el ojo mantiene su forma normal. Cuando esté suspendido en PBS, el resto de la disección se llevará a cabo sobre un portaobjetos. Sostenga el ojo con la pinza en ángulo de 45 grados y levántelo del PBS.

Coloque el ojo sobre un portaobjetos nuevo. Con ambas pinzas anguladas, desdoble cuidadosamente el ojo. Observe que hay un pequeño margen de córnea e iris alrededor del perímetro del ojo, lo cual es útil para manipularlo.

A continuación, debe cortar cada uno de los cuatro pedales por la mitad. Gire el ojo de modo que uno de los pedales quede perpendicular a su cuerpo. Sujete la esquina del pedal con la pinza en ángulo de 15 grados.

Levante ligeramente y luego realice un corte desde la división esclerocorneal hacia el polo óptico. Estos cortes deben ser perpendiculares a una tangente. Una tangente es una línea que es perpendicular al diámetro.

Por lo tanto, sus cortes deben estar alineados con el diámetro del ojo. Ahora gire el portaobjetos para que el siguiente pétalo quede perpendicular a su cuerpo y repita. Sujete la esquina del pétalo.

Levante ligeramente y corte. Repita hasta que cada uno de los cuatro pedúnculos grandes haya sido cortado por la mitad. La sustancia de color blanquecino es la retina neural, que se encuentra directamente encima del epitelio pigmentario de la retina (RPE).

La retina neural puede proteger el epitelio pigmentario de la retina (RPE), así que déjela intacta hasta que haya realizado todos los cortes. Observe cómo las pétalos están ligeramente curvados. No intente contrarrestar esto.

Tómese su tiempo para alinear correctamente y poder realizar un buen corte único. Debido a que el ojo es redondo, tiende a plegarse; para evitar este plegamiento, puede hacer ocho cortes cortos.

Uno en cada pétalo. Utilice la misma estrategia básica que en la ronda anterior de cuatro cortes. Levante la esquina del pétalo y corte, pero en este caso, corte solo aproximadamente hasta la mitad de la longitud del pétalo.

Una vez que haya realizado todos los cortes, puede retirar la retina neural. Aquí estoy agregando unas gotas de PBS 1X al espécimen. No debe dejar que su epitelio pigmentado de la retina se seque.

La retina neural solo debería estar débilmente asociada con el epitelio pigmentario retiniano subyacente. Se puede observar que se separa bastante fácilmente. Sin embargo, normalmente permanecerá adherida en la división corneoescleral, que en el interior del ojo es una cresta irregular denominada cuerpo ciliar.

Puede insertar la punta de la pinza de 15 grados en el nervio óptico para fijar la muestra mientras se separa la retina neural. El cuerpo ciliar marca el borde del epitelio pigmentario de la retina (RPE), el tejido de pigmentación oscura que se ha desprendido. Aquí se encuentra el iris, no el RPE.

Recomiendo eliminar la mayor cantidad posible del iris porque es muy pegajoso y puede plegarse y adherirse al epitelio pigmentario de la retina (RPE) si la retina neural está desprendiéndose o si quedan restos adheridos al RPE. Probablemente ocurrió una de dos cosas: o los ojos no se fijaron adecuadamente, ya sea durante demasiado tiempo o por un periodo demasiado corto, o estuvieron en almacenamiento durante demasiado tiempo antes de la disección.

El pedal que estoy descubriendo aquí aún no tiene su acceso directo. Puede observarse cómo el pedal se encuentra aproximadamente a un tercio del camino desde el borde del EPR. Por esta razón se recomiendan los ocho accesos directos.

Una vez descartada toda la retina neural, use una pipeta para enjuagar varias veces el epitelio pigmentario de la retina (RPE) con 100 a 200 microlitros de PBS hasta eliminar todo el polvo y los residuos. Aplique con pipeta 80 a 90 microlitros de glicerol al 90 % sobre un portaobjetos nuevo en forma rectangular. Tenga en cuenta que este es el volumen óptimo de glicerol para una cubreobjetos de 22 por 50 milímetros y debe ajustarse según corresponda.

Para otros tamaños de cubreobjetos, use la punta de su pipeta para extender el glicerol. Tenga cuidado de no añadir burbujas de aire al glicerol. Si aparece una burbuja, arrástrela hacia el borde donde reventará.

Deslice el brazo inferior de la pinza de 15 grados por debajo del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y levántelo con cuidado; luego, baje lentamente el RPE en el glicerol. El RPE flotará sobre la superficie del glicerol y podría enrollarse o torcerse ligeramente. Utilice la pinza para enderezar el RPE y para arrastrar el glicerol sobre su superficie.

Si se forman burbujas de aire, arrástrelas hacia el borde, donde estallarán, sosteniendo el cubreobjetos a unos 45 grados. Tóquelo en el borde del glicerol.

Luego muévalo hacia el borde del portaobjetos. Sujete la parte inferior del cubreobjetos con el pulgar y el índice y sostenga el borde opuesto con unas pinzas de 15 grados. Baje muy lentamente el cubreobjetos hacia el portaobjetos tan pronto como se establezca el contacto.

Con el EPR, detenga el descenso, permitiendo que la glicerina migre mientras continúa bajando lentamente su cubreobjetos. Si baja el cubreobjetos demasiado rápido, se incorporarán burbujas de aire en su preparación en este punto. Bajaré el cubreobjetos lentamente cuando toque el EPR y permitiré que la glicerina migre.

Puede observarse que cuando suelto rápidamente el cubreobjetos, se incorporan burbujas de aire. Utilice una cantidad generosa de esmalte de uñas transparente para fijar el borde del cubreobjetos al portaobjetos, rodeando completamente todo el perímetro.

Este es un epitelio pigmentario retiniano típico de un ratón negro C57. Es normal observar la vasculatura subyacente, como se indica aquí. También es normal observar cierta variación en la pigmentación, como manchas que parecen tener menos pigmento.

Sin embargo, las manchas claras como esta probablemente se deban a un daño físico en el epitelio pigmentario de la retina (RPE) y en la coroides subyacente. Dado que la coroides del ojo también está pigmentada, es posible que un daño en un RPE oscuro pase desapercibido si la coroides permanece intacta.

Este es un epitelio pigmentario retiniano (RPE) típico de un ratón diluido. Como se indica, podrá observarse la vasculatura y habrá cierta variación en la pigmentación, como manchas más oscuras y manchas más claras. Sin embargo, es casi imposible observar daño en un RPE diluido.

¿Son estos pequeños parches daño o una variación normal en la pigmentación? Sugiero realizar frotis y tinción para abordar esta pregunta. Esto le dará una idea si está manipulando el I dos de forma demasiado brusca.

La tinción delinea claramente las membranas celulares, haciendo evidentes las zonas dañadas, pero en realidad, el epitelio pigmentario retiniano es bastante resistente, y si manipula el ojo por la córnea, es poco probable que cause daño. Aquí se muestra una preparación completa con una serie de problemas, siendo el menor de ellos el margen excesivamente amplio de córnea, lo cual puede provocar arrugas y plegamientos del material ondulado. Puede observarse aquí un tejido extraño masivo que permanece en la parte posterior del ojo.

Este pétalo está parcialmente doblado, y aquí puede observarse que el epitelio pigmentario retiniano (RPE) ha sido parcialmente desgarrado. Otro problema es que este ojo presenta el aspecto de una rueda de fuegos artificiales. Aquí he dibujado los ángulos de los cortes.

Sin embargo, así es como deberían haber sido. Recuerde, sus cortes deben ser perpendiculares a la tangente y alineados con el diámetro. Acabo de demostrar cómo diseccionar un ojo de ratón para un montaje completo del epitelio pigmentario de la retina.

Epitelio, lo más importante es mantener una buena postura, pero intenta permanecer relajado. Espero que hayas encontrado útil este video y te deseo todo lo mejor en tus futuros experimentos.