Name: Organotípicos Culturas del cerebelo: Retos y detección de apoptosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Aprende a preparar cultivos organotípicos de cerebelo para estudiar la apoptosis inducida por fast ligand en ratones silvestres y mutantes. Este método permite analizar la viabilidad celular mediante tinción inmunofluorescente.

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Este estudio fue financiado en parte por la Fundación Ipsen. IMV es un profesor Sociedad Americana del Cáncer de Biología Molecular, y el titular de la Cátedra Irwin y Joan Jacobs en Ciencias de la vida ejemplar. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH, Fundación Leducq, Fundación Meriaux, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, y HN y Frances C. Berger Fundación. PAS es financiado por McKnight Fondo de Dotación para la Neurociencia y el Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (R01 DA019022). Los autores desean agradecer a Mark Schmitt. Arte gráfico fue diseñado por Jamie T. Simon. Patrocinio fue proporcionado amablemente por Invitrogen.

1. Organotípicos Culturas del cerebelo: <ol><li> Para generar éxito organotípicos culturas cerebelosa utilizar ratones entre P0-P3 o P8-P12. Para nuestro experimento utilizaron ratones en el rango de P8-P12 ya que esta etapa de desarrollo era más apropiado para nuestro estudio. </li><li> Prepare la disección y el medio de cultivo: <ol><li> La disección del cerebro y la preparación de corte se llevan a cabo en la baja artificial de sodio líquido cefalorraquídeo (ACSF), que contiene cloruro de calcio 1 mM, 10 mM D-glucosa, 4 mm de cloruro de potasio, cloruro de magnesio 5 mM, bicarbonato de sodio de 26 mm, 246 mm y una solución de sacarosa rojo fenol (1:1000) , pH 7,3. Para esterilizar la solución, se filtra a través de un filtro de 0,22 micras y se almacenan a 4 ° C. </li><li> Rodajas de cerebelo se cultivan en el 75% mínimo indispensable medio de Eagle (MEM), el 25% inactivado por calor suero de caballo, HEPES 25 mM, 1 mM glutamina, glucosa 5 mg / ml, penicilina (100 U / ml) y estreptomicina (100 U / mL). Filtrar el medio a través de un filtro de 0,22 micras y se almacenan a 4 ° C durante un máximo de dos semanas. </li></ol></li><li> Diseccionar el cerebro en el helado a medio ACSF previamente burbujeado con carbogen (95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono) Tenga en cuenta que la saturación con Carbogen va a cambiar el pH de la solución por lo que pasará de rojo a naranja. La disección se debe realizar en el menor tiempo posible, teniendo cuidado de no dañar la estructura del cerebro. </li><li> Rebanada del cerebro en las secciones sagitales de 400 m con un vibratome. <ol><li> Haga un corte sagital con una hoja de afeitar en un hemisferio, tratando de cortar lo menos posible del cerebelo, lo que proporcionará una superficie plana para cortar. La corteza se usa sólo para el apoyo para hacer el corte en lonchas más fácil, pero como el tiempo es un tema importante que es más conveniente para cortar la mitad rostral de la corteza con una cuchilla de afeitar. </li><li> El uso de cianoacrilato (Superglue) para fijar la posición del cerebro en la placa de metal vibratome. Es importante para enfriar la placa de hielo antes de añadir la cola y que se extendió también con la punta del tubo para formar una capa adhesiva delgada. Si hay un exceso de pegamento, que se desprenden de la placa cuando se entra en contacto con la ACSF y la muestra se perderá. </li><li> Una vez que el cerebro está conectado a la placa vibratome, añadir una cantidad suficiente para cubrir los medios de comunicación ACSF el cerebro y la puso debajo de la placa de hielo para mantenerlos fríos. </li><li> Cortar rodajas de 400 micras y la transferencia con una pipeta de plástico Pasteur (corte la punta para ampliarla y evitar daños a los cortes) a una placa de 6 celdas, y la cultura que contiene ACSF en el hielo. </li><li> Separar el cerebelo desde el resto del cerebro con la ayuda de dos jeringas de insulina (jeringas de pequeño diámetro de calibre 28 agujas) bajo el microscopio de disección. Algunos cortes se han unido a un pegamento de los bordes: este es el momento para tratar de eliminar, ya que puede afectar la viabilidad de la división. Es importante hacerlo con cuidado sin dañar la estructura del cerebelo. </li></ol></li><li> Transferencia de las rodajas de cerebelo a los 6 y placas que contienen de 30 mm se inserta la placa de cultivo con 0,4 micras poros. Añadir 1 ml de medio de cultivo por pozo, que se pre-condicionada por la incubación de al menos 2 horas a 37 ° C y 5% de CO 2 (en el cultivo celular incubadora). Colocar los insertos en la parte superior de los medios de asegurarse de que no hay burbujas de aire atrapadas debajo y luego colocar las rodajas de cerebelo (1-3 por inserto) en la parte superior de los insertos de asegurarse de que estén completamente extendidos y que el líquido no es cubierta ellos. Aspirar el exceso de los medios de comunicación si es necesario. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 cambia el medio de cultivo cada 2 o 3 días. Lo mejor es reemplazar sólo una parte del medio (por ejemplo, el volumen medio) a la vez, ya medio utilizado contiene derivados slice-factores tróficos que son importantes para la supervivencia celular. </li></ol> 2. Fas tratamiento y tinción de las rebanadas del cerebelo: <ol><li> Para el experimento de exposición a la apoptosis, que la cultura primero las rodajas durante 5 días cambiando los medios de comunicación en el día in vitro 3 (DIV3). En DIV5 culturas son tratados con 0,5 mg / mL de la Jo2 Fas anticuerpo agonista añadiendo directamente a los medios de comunicación a fin de tener un fondo limpio de la muerte celular ya que los cambios de los medios de comunicación pueden inducir a cierta mortalidad en los cultivos. La mitad de los pozos no se tratan como controles. </li><li> Después de 24 horas retire el material por debajo de los insertos por succión. Para solucionar los cortes, agregar 1 ml de helado un 4% por debajo de PFA y 1 ml por encima de la inserción. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de 10 minutos, retire la PFA y lavar brevemente con PBS frío. </li><li> A continuación, retire la PBS y añadir 1 ml y por debajo de 1 ml por encima de la inserción de helado de metanol al 20% en PBS e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar a continuación con PBS y añadir 1 ml por debajo de 1 ml y por encima de la inserción de un 0,5% de Triton X-100 en PBS durante la permeabilización. Se incuba durante un mínimo de 12 horas a 4 ° C. </li><li> Después de permeabilización, bloque con un 20% BSA en PBS durante un mínimo de4 horas a temperatura ambiente o la noche a 4 ° C. En esta etapa, las rebanadas se pueden mantener en solución de bloqueo durante al menos 3 días a 4 ° C. </li><li> Con el fin de manchar las rodajas de corte con cuidado la pieza de la membrana insertar adjunto a la parte del cerebelo y la transferencia a 24 y placas que contienen PBS. </li><li> La inmunotinción se hace de forma secuencial, primero con el reactivo TUNEL durante una hora y luego con el anticuerpo Calbidin noche a la mañana. <ol><li> Aspirar el PBS y añadir 250 l de reactivo TUNEL en cada pocillo asegurándose de que cubre toda la superficie del corte. Se incuba a 37 ° C durante una hora en la oscuridad. </li><li> Después de una hora remover la mezcla de TUNEL y lavar con PBS tres veces durante 10 minutos. </li><li> Después del último lavado, eliminar el PBS y añadir 250 l de una dilución 1 / 1000 de la calbindina anticuerpos en PBS e incubar durante la noche a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Eliminar la solución de anticuerpo primario y lavar con PBS tres veces durante 10 minutos. </li><li> Añadir 250 ml del anticuerpo secundario diluido 1 / 500 en PBS y se incuba durante al menos tres horas a temperatura ambiente en la oscuridad. El kit TUNEL usamos está marcado con rojo TMR, por lo tanto, nuestro anticuerpo secundario para calbindina se conjuga con Alexa-488. </li><li> Lavar tres veces durante 10 minutos con PBS y montar los cortes sobre un portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje que contiene DAPI. </li><li> Imagen de las rebanadas con un microscopio confocal utilizando los 488 nm y 561 nm de longitud de onda de excitación de calbindina y TUNEL, respectivamente. </li></ol></li></ol> 3. Los resultados representativos: El principal reto de este protocolo es capaz de generar saludables culturas rebanada del cerebelo, sobre todo porque nuestra lectura final será la muerte celular. Una sana cultura aparece como uno donde la capa de células del cuerpo es transparente y permite ver la estructura foliada del cerebelo bajo el microscopio (Figura 1). Después de unos días en la cultura de las rodajas de empezar a células que son delgadas y no neuronales se puede observar la migración fuera de los márgenes de la división. Las células redondas oscuras (la mayoría de los macrófagos probable) que cubren los cortes después de unos días en la cultura, con el tiempo se reducirán en número después de 10-14 días in vitro (Figura 2) 5. La prueba definitiva para la viabilidad de los cortes es para teñir de diferentes marcadores celulares, tales como calbindina de las células de Purkinje. La Figura 3 muestra una imagen representativa microscopio confocal de la capa de células de Purkinje con varios núcleos TUNEL positivos. Es importante tener en cuenta que incluso si algunas rebanadas recibió un estímulo apoptótico, fueron expuestos sólo durante 24 horas. Esto permitió tiempo suficiente para observar la fragmentación del ADN en las células que mueren con la tinción de TUNEL, pero una capa de células de Purkinje definido todavía estaba presente. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Parte sana del cerebelo en DIV2. Esta imagen muestra la capa de células del cuerpo translúcido y la estructura foliada del cerebelo en una porción saludable. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Parte sana del cerebelo en DIV 7. En esta imagen todavía se puede observar la estructura foliada del cerebelo y la aparición de cuerpos de células oscuras. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imagen representativa de una rebanada de Fas-cerebelosa tratado. Esta imagen confocal muestra las células de Purkinje se tiñeron con calbindina (verde) y las células apoptóticas positivas para la tinción de TUNEL (rojo). Las células de Purkinje no aparecen en una sola fila, pero se agrupan formando una estructura similar a folio.

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

Todos los animales de trabajo llevado a cabo se realizó de acuerdo con las políticas establecidas por el IACUC. El Instituto Salk es un centro acreditado AAALAC.

Este método describe una de las muchas aplicaciones posibles de cultivos organotípicos neuronal y que nos ha permitido estudiar el efecto de los estímulos de apoptosis de tipo salvaje y mutante rodajas de cerebelo. La parte más crítica de este experimento es ser capaz de generar consistentemente saludable culturas trozo del cerebelo. Los factores clave son la disección y el método de los cortes y la capacidad para llevar a cabo el protocolo en el menor tiempo posible, pero al mismo tiempo teniendo cuidado de no dañar los trozos. Otro factor crucial es la preparación y la composición de los medios de cultivo, estos cultivos son muy sensibles, así que tuvimos que probar varias recetas y las marcas de los medios de comunicación. Incluso los diferentes lotes de suero o cualquier otro componente de los medios de comunicación podría afectar la viabilidad de los sectores. Tenemos los mejores resultados con el suero de caballo de Lot # 480116 Invitrogen. Una vez que los cortes del cerebelo se generan se puede estudiar el desarrollo del cerebelo, la electrofisiología, la supervivencia de las células solas o en respuesta a estímulos apoptóticos, excitotoxicidad, o la falta de oxígeno. Los estudios comparativos con el tipo salvaje y mutante rebanadas del cerebelo han sido muy profundas en muchos aspectos de la función del cerebelo y el desarrollo.

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 6 pocillos / 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3506/ 3527</td><td></td></tr><tr><td>insertos para placa de cultivo de 30 mm (0,4-&amp;mu;m poro</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>CD95 (Jo2) de hámster anti-murino, purificado NA/LE</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In situ&lt;/em&gt; kit de detección de muerte celular, TMR rojo</td><td>Grupo Roche</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Calbindina D-28k de conejo</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo secundario Alexa 488-anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Vectashield con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotípicos culturas del cerebelo: retos y detección de apoptosis

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Cultivos organotípicos de tejido neuronal se introdujeron por primera vez por Hogue en 1947 de 1,2 y han constituido un gran avance en el campo de la neurociencia. Desde entonces, la técnica se desarrolló aún más y actualmente hay muchas formas diferentes de preparar cultivos organotípicos. El método presentado aquí es una adaptación de la descrita por Stoppini et al. Para la preparación de los cortes y de Gogolla et al. Por el procedimiento de tinción 3,4. Una característica única de esta técnica es que permite estudiar las diferentes partes del cerebro como el hipocampo y cerebelo en su estructura original, proporcionando una gran ventaja sobre los cultivos disociados en el que se interrumpen todas las de la organización celular y las redes neuronales. En el caso de que el cerebelo es aún más favorable, ya que permite el estudio de las células de Purkinje, muy difícil de obtener como cultivo primario disociados. Este método puede ser usado para estudiar algunas características del desarrollo del cerebelo in vitro, así como para los experimentos electrofisiológicos y farmacológicos, tanto de tipo salvaje y ratones mutantes. El método descrito aquí fue diseñado para estudiar el efecto de los estímulos apoptóticos como ligando de Fas en el cerebelo en desarrollo, mediante la tinción de TUNEL para medir la muerte celular por apoptosis. Si la tinción de TUNEL se combina con marcadores tipo específico de célula, como calbindina de las células de Purkinje, es posible evaluar la muerte celular de una manera la población de células específicas. La tinción calbindina también sirve el propósito de evaluar la calidad de las culturas del cerebelo.

Este método describe la generación de organotípicos culturas del cerebelo y el efecto de ciertos estímulos apoptóticos sobre la viabilidad de los diferentes tipos de células del cerebelo.

Organotípicos Culturas del cerebelo: Retos y detección de apoptosis

Los cultivos organotípicos de tejido neuronal fueron introducidos por primera vez por Hogue en 1947 1,2 y han constituido un avance fundamental en el campo de la neurociencia. ...

El objetivo general del siguiente experimento es investigar el efecto del estímulo apoptótico fast ligand en el cerebelo en desarrollo de ratones de tipo salvaje y mutantes. Esto se logra primero mediante la disección del cerebro de ratones de tipo salvaje y ratones knockout entre los días posnatales ocho y doce. El segundo paso consiste en cortar los cerebros en rebanadas de 400 micrómetros de grosor y aislar el cerebelo de cada rebanada.El tercer paso consiste en cultivar las secciones cerebelosas durante cinco días para asegurarse de que estén sanas antes de inducir la muerte celular con el ligando rápido. El paso final del procedimiento es analizar el efecto del ligando rápido en las diferentes poblaciones celulares cerebelosas de ratones tipo salvaje y knockout, basándose en la tinción inmunofluorescente para el marcador apoptótico tunnel, combinada con marcadores específicos de tipo celular como calbindina para las células bikini. La principal ventaja de los cultivos cerebelosos vivos es que permiten conservar la estructura regional del cerebelo, a diferencia de los cultivos primarios disociados, en los que las redes neuronales y varias organizaciones se ven alteradas.Por lo tanto, este tema permitirá responder algunas preguntas clave en neurociencias, especialmente porque se dispone del ratón tipo silvestre y del ratón mutante. Así, se puede estudiar el desarrollo comparativo, se puede analizar la fisiología, así como también la electrofisiología y la farmacología. Aunque este método puede proporcionar información sobre la función del ligando rápido en la supervivencia celular o en el cerebelo, también puede utilizarse para investigar los efectos del ligando rápido en la corteza y el hipocampo.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque, para obtener una lisis cerebelosa saludable, es fundamental colocarlas en cultivo lo más rápido posible sin comprometer su integridad. Por lo tanto, es importante tener buenas habilidades de disección y corte antes de intentar todo el proceso. Cuando sea posible.Los pasos del siguiente procedimiento deben realizarse en una cabina de cultivo celular antes de la disección. Prepare un medio de LCR para la disección cerebral y la preparación de cortes, así como el medio de cultivo de cortes según el protocolo escrito, y almacénelos a cuatro grados Celsius el día de la disección. Prepare placas de cultivo celular para el cultivo de los cortes cerebelosos.Agregue un mililitro de medio de cultivo de laminillas en cada pocillo de una placa de seis pocillos. Luego use fórceps estériles para colocar las cápsulas de cultivo en cada uno. Asegúrese de que no queden burbujas de aire atrapadas debajo de la cápsula.Coloque la placa de cultivo en una incubadora de cultivo de tejidos ajustada a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante al menos dos horas para preacondicionar el medio. A continuación, burbujee el medio ACSF frío con gas carbógeno. La saturación del medio con carbógeno altera el pH de la solución y produce un cambio de color de rojo a naranja.Vierta un poco del medio A CSF frío con burbujas en un plato de Petri estéril y en una placa de seis pocillos. Coloque estos recipientes sobre hielo junto con la placa del vibrátomo que se utilizará para cortar el cerebro. El plato de Petri que contiene el medio A CSF frío con burbujas se usará para diseccionar el cerebro de un ratón joven de P ocho a P 12 tras la disección.Utilice una cuchilla de afeitar para realizar un corte sagital en un hemisferio y obtener una superficie plana para montarlo en la placa de vibram. También se puede cortar la parte rostral de la corteza. Seque la placa de vibram enfriada con una toalla de papel.Luego, agregue un poco de pegamento instantáneo sobre la platina y extiéndalo de forma zigzagueante con la punta del tubo de pegamento. Para formar una capa adhesiva delgada, use una espátula para transferir el cerebro a la platina del vibrátomo, colocando el lado aplanado en contacto con el pegamento instantáneo. Una vez que el cerebro esté adherido a la placa del vibrátomo, agregue suficiente medio ACSF para cubrir el cerebro y coloque hielo debajo de la placa para mantenerlo frío.Corte el cerebro en rebanadas de 400 micrómetros. Luego utilice una pipeta de plástico para pasta con el extremo cortado y ensanchado para transferir las rebanadas a la placa de seis pocillos que contiene medio A CSF sobre hielo, trabajando bajo el microscopio de disección.Utilice dos jeringas de insulina con agujas de pequeño diámetro de calibre 28 para separar el cerebelo del resto del cerebro. Si alguna de las secciones tiene pegamento instantáneo en el borde, use las dos agujas de jeringa para retirar el pegamento de la sección. Utilice la pipeta de plástico para fideos con el extremo cortado y ensanchado para transferir las secciones hacia la parte superior de los filtros.Añadir de una a tres secciones por inserto garantiza que las secciones estén completamente extendidas y que ningún líquido las cubra. Si es necesario, aspire el exceso de medio con la pipeta, incube a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. Después de 48 horas, reemplace la mitad del volumen del medio con medio fresco, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas debajo del inserto.El medio original restante contiene factores tróficos derivados de cortes que son importantes para la supervivencia celular. El desafío apoptótico se realiza después de cinco días de cultivo. Añada el anticuerpo agonista rápido JO dos al medio de cultivo celular en los pocillos que se tratarán.Deje la mitad de los pocillos sin tratar como controles. Una vez transcurridas 24 horas, aspire el medio de los pocillos. Luego, fije las secciones agregando mediante pipeta un mililitro de paraformaldehído al 4 % frío bajo el inserto y un mililitro de PFA encima del inserto.Deje que los cortes se fijen en el PFA durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspire el PFA y lave brevemente con dos mililitros de PBS frío mediante pipeteo: un mililitro encima del inserto y un mililitro debajo del inserto.A continuación, aspire el PBS y pipetee un mililitro de metanol al 20% frío con hielo en PBS debajo del inserto y un mililitro encima del inserto. Incube durante cinco minutos a temperatura ambiente, luego aspire el metanol al 20% del pocillo y lave la sección y el pocillo D con PBS. Como antes, pipetee un mililitro de Triton X-100 al 0,5% en PBS encima del inserto y otro mililitro debajo del inserto.Incubar durante un mínimo de 12 horas a cuatro grados Celsius para permeabilizar las secciones tras la permeación. Aspirar el Triton X-100 al 0,5% en PBS y pipetear un mililitro de BSA al 20% en PBS encima de la sección y un mililitro debajo de la sección. Bloquear las secciones durante un mínimo de cuatro horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius.Una vez finalizado el bloqueo, use tijeras limpias para cortar cuidadosamente el trozo de membrana insertado en la sección de cerebelo. Luego, use pinzas limpias para transferir el trozo de membrana a una placa de 24 pocillos que contenga PBS; aspire el PBS y agregue 250 microlitros de reactivo tunnel en cada pocillo, asegurándose de que el reactivo cubra toda la superficie de la sección.Incubar a 37 grados Celsius durante una hora en la oscuridad cuando haya transcurrido la hora. Aspirar el reactivo del túnel de los pocillos y reemplazarlo con 500 microlitros de PBS. Proteger la placa de la luz e incubarla a temperatura ambiente durante 10 minutos para lavar.Repita este proceso dos veces después del último lavado. Aspire el PBS y agregue 250 microlitros de una dilución uno a 1000 del anticuerpo contra calbindina en PBS e incube durante la noche a cuatro grados Celsius en la oscuridad. El día siguiente.Aspire la solución de anticuerpo primario y lave con PBS 3 veces durante 10 minutos. A continuación, añada 250 microlitros de anticuerpo secundario diluido uno a 500 en PBS. Cubra la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz e incube durante al menos tres horas a temperatura ambiente tras la incubación.Lave los cortes tres veces durante 10 minutos con PBS y utilizando un medio de montaje que contenga dappy. Monte los cortes sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio y coloque una cubeta. Observe los cortes con un microscopio confocal utilizando longitudes de onda de excitación de 488 nanómetros y 561 nanómetros para kale, bendin y tunnel, respectivamente.Esta imagen muestra un corte cerebeloso sano. Después de dos días in vitro, la capa de cuerpos celulares aparece translúcida y la estructura foliada del cerebelo es claramente visible bajo el microscopio. Después de siete días in vitro, la estructura foliada del corte cerebeloso sano aún es visible.Además, cuerpos celulares oscuros, probablemente macrófagos, generalmente cubren la sección. La imagen confocal que se observa aquí es representativa de una sección cerebelosa tratada rápidamente. Las células bikini aparecen verdes tras la tinción con un anticuerpo primario, seguido de un anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488.Las células apoptóticas positivas para la tinción TUNEL aparecen en color rojo, ya que el kit TUNEL utilizado está marcado con TMR. Las células Bikini rojas no aparecen en una sola fila, sino agrupadas formando una estructura similar. Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar dentro de la cabina de flujo laminar para cultivo de tejidos siempre que sea posible y minimizar el tiempo que el tejido cerebral permanece expuesto a posibles contaminantes como bacterias o hongos.Utilizando este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos a estos cortes, incluyendo análisis bioquímicos y electrofisiológicos para obtener información adicional sobre el contenido proteico así como sobre la excitabilidad neuronal. Esta técnica fue desarrollada originalmente para estudiar el efecto de la muerte celular mediada rápida en células de Perkin que portan mutaciones que afectan la vía rápida. Las células periales rara vez sobreviven en cultivo primario.Por lo tanto, este procedimiento fue el mejor enfoque experimental. Espero que, tras ver este video, tengan una buena idea de cómo preparar cortes de barriles cerebrales y de cómo se puede estudiar el estímulo apático y su efecto sobre diferentes tipos celulares cerebrales.

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Realizar experimentos in vitro para reflejar las condiciones in vivo lo más adecuadamente posible no es una tarea fácil. El uso de cultivos celulares primarios es un paso importante hacia la comprensión de la biología celular en todo un organismo. El protocolo proporcionado describe cómo crecer y cultivar con éxito las neuronas cerebelosas de ratón embrionarios.

Cultivo primario de neuronas aisladas del cerebelo del ratón embrionario

Los cultivos de rodajas organotípicas son una poderosa herramienta para estudiar los procesos neurodesarrollo o degenerativos/regenerativos. Aquí, describimos un protocolo que modela la muerte del neurodesarrollo de las células de Purkinje en cultivos de rebanadas cerebelosas de ratón. Este método puede beneficiar la investigación en el descubrimiento de fármacos neuroprotectores.

Supervivencia de células Purkinje en cultivos de rebanadas de cerebeloso organotípico

Las células cerebelosas de Purkinje (PC) son particularmente sensibles a las deficiencias en la respuesta al daño del ADN. Se presenta un protocolo para la evaluación visual de la dinámica de la respuesta de la PC al daño del ADN, que implica la tinción de cadenas de poli(ADP-ribosa) unidas a proteínas dentro de cultivos organotípicos cerebelosos.

Visualización de la respuesta al daño del ADN en células de Purkinje mediante cultivos organotípicos cerebelosos

Aprende a preparar cultivos organotípicos de cerebelo para estudiar la apoptosis inducida por fast ligand en ratones silvestres y mutantes. Este método permite analizar la viabilidad celular mediante tinción inmunofluorescente.

Organotípicos Culturas del cerebelo: Retos y detección de apoptosis

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