Myo-mecánico Análisis de músculo esquelético aislado

El objetivo de este procedimiento es determinar la fuerza generada y la fatigabilidad del músculo esquelético aislado como forma de cuantificar los efectos de la modificación genética o la terapia. En primer lugar, se disecciona el músculo extensor más largo de los dedos de la extremidad posterior del ratón. A continuación, el músculo se monta en una tira muscular mio.

El siguiente paso es determinar el voltaje de estimulación y la pretensión del músculo a partir del cual se alcanza la tensión máxima de contracción. El paso final es determinar la relación fuerza-frecuencia para el músculo, así como el inicio y grado de fatiga con baja frecuencia a la estimulación tánica. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios medibles en mis propiedades mecánicas del músculo a través de la miografía.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las pruebas de esfuerzo, es que la miografía permite una evaluación cuantitativa de la fuerza y la función muscular. Adoptamos este método por primera vez cuando nos dimos cuenta de que se necesitaban medidas cuantitativas para evaluar la función muscular a medida que se probaban nuevas terapias celulares y basadas en bioingeniería para la enfermedad muscular en modelos animales preclínicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología muscular y la distrofia muscular, como si terapias específicas o modificaciones genéticas alteran la función muscular.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos necesarios para manejar correctamente el músculo son difíciles de dominar. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque una disección rápida y traumática de los músculos traseros requiere práctica y habilidad adquirida. La demostración del procedimiento será cuando dejemos a un científico investigador y a un estudiante de posgrado en nuestros laboratorios.

Después de la eutanasia de un ratón, coloque el cadáver con el lado ventral hacia arriba en una bandeja de disección y sujete la pierna a la bandeja bajo un microscopio de disección. Corta la piel y abre con cuidado la fascia. A continuación, pela el músculo tibial anterior desde el tobillo hacia arriba para exponer el músculo extensor largo de los dedos o EDL.

Use gotas de solución de ringer lactato para mantener el músculo húmedo durante la cosecha. A continuación, diseccione la EDL, conservando la mayor cantidad posible de tendón en cada extremo, y teniendo cuidado de no tocar las fibras musculares de la EDL. Coloque el músculo EDL en una placa de Petri que contenga una solución de ringer lactato.

Ahora ata las suturas a cada uno de los tendones musculares. Estos estudios utilizan un baño de tejido para sujetar el músculo y un transductor de fuerza para medir la tensión muscular. Además, se utiliza un estimulador eléctrico de pulso cuadrado y una plataforma de adquisición de datos para obtener, registrar y analizar mis respuestas mecánicas.

El siguiente paso es llenar el baño de injerto mio con 6,5 mililitros de Krebs, por lo tanto, la solución satélite. Calentar el baño a 25 grados centígrados burbujear la solución de Krebs con 95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono después de burbujear durante 15 minutos. Use suturas en los tendones para transferir el músculo EDL al baño.

Asegure los tendones entre las abrazaderas del injerto mio. Tenga cuidado de no sujetar el músculo en sí. Mantenga el baño de injerto mio a 25 grados centígrados.

Para comenzar el análisis de tensión, ajuste la longitud inicial del músculo para que sea igual a la longitud del músculo inci. Utilizando una duración de estímulo de 0,5 milisegundos. Aumente gradualmente el voltaje para determinar el estímulo requerido para obtener la tensión máxima de contracción.

A continuación, ajuste el estímulo un 20% más alto para lograr un estímulo supra máximo, que suele ser de unos 40 voltios. El siguiente paso es estirar gradualmente el músculo hasta que no haya más aumento de la tensión de las contracciones. Esta longitud se considera la longitud muscular óptima.

Permita que el músculo se equilibre durante tres minutos, luego mantenga el músculo en su longitud óptima. Administre un estímulo cuadrado supra máximo y registre la salida, registre la curva de tensión de contracción. En esta figura.

La tensión máxima de contracción se denomina pt. El tiempo de contracción se denomina ct. El medio tiempo de relajación se denomina TRH.

La barra representa un segundo después de un período de descanso de tres minutos. Mida la tensión del Titanic aplicando una tensión de estímulos supermáximos durante 300 milisegundos a 150 hercios a una longitud óptima. Este procedimiento genera una curva de tensión del tétanos.

La tensión máxima del Titanic está etiquetada como po. La tensión Titanic de media relajación está etiquetada como HRTT. La barra representa un segundo después de un período de descanso de tres minutos.

Comience el análisis de frecuencia de fuerza aplicando trenes de 300 milisegundos de estímulos supermáximos a treinta y sesenta y uno, ciento cuarenta y 160 hercios. Permita tres minutos de descanso entre cada tren de estímulos después de un período de descanso de tres minutos. Comience el análisis de fatiga aplicando trenes de taai cortos de 60 hercios durante 300 milisegundos cada tres segundos durante 10 minutos por 10 minutos.

La fuerza del Titanic debería declinar a un nivel de meseta de alrededor del 15% del valor inicial. Después de terminar los registros de fuerza con el músculo a la longitud óptima, mida el diámetro del músculo con el ocular en el microscopio. A continuación, retire las suturas y pese el músculo para determinar la masa muscular.

El último paso es pesar al ratón para evaluar la masa corporal. Estas medidas se utilizan para los cálculos enumerados en el artículo adjunto. Esta figura muestra el aumento de la tensión generada con el aumento de las frecuencias de estímulo

Esta es la respuesta del músculo a un tren de pulso a 30 hercios. Esta figura muestra la mayor fuerza solicitada en un tren de pulsos de 140 hercios. Este gráfico muestra la relación entre la frecuencia de fuerza trazada como el porcentaje de fuerza máxima frente a la frecuencia de estimulación.

La forma de la curva de frecuencia de fuerza es característica de la fuerza muscular y se puede utilizar para hacer comparaciones entre músculos de diferentes animales. Esta figura demuestra fatiga muscular en el transcurso de 10 minutos de estimulación de baja frecuencia. Estas figuras muestran la respuesta del músculo al estímulo entrenado en los puntos de tiempo indicados.

Este gráfico muestra la fatiga muscular de baja frecuencia como un más del porcentaje de fuerza máxima frente al tiempo. La forma de la curva de fatiga de baja frecuencia es característica de la fuerza muscular y se puede utilizar para hacer comparaciones entre músculos de diferentes animales. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica, el Western blot y la PCR cuantitativa para responder preguntas adicionales como si se están expresando proteínas miogénicas específicas y marcadores de células madre en el músculo tratado mientras se intenta este procedimiento. Es importante recordar tener todo el equipo listo para minimizar el tiempo entre la recolección de músculo y el análisis. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar el músculo de la extremidad trasera, montar el músculo en una tira muscular myo, como la que le hemos mostrado de la tecnología myo danesa y medir los cambios en mis propiedades mecánicas.