Name: Bioluminiscencia de imágenes para la evaluación de la respuesta inmune después de la implantación de tejido cardiaco de Ingeniería (EHT) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprende a evaluar respuestas inmunes tras implantación de tejido cardíaco de ingeniería en ratas mediante bioluminiscencia in vivo. Este método permite monitorear la supervivencia del injerto de forma no invasiva y longitudinal.

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Sonja Schrepfer, Conradi Lenard y Arne Hansen recibió fondos de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SCHR992/3-1, SCHR992/4-1, CO 858/1-1, HA 3423/3-1). El trabajo también fue apoyado por subvenciones de la Unión Europea a Thomas Eschenhagen (EUGeneHeart y Angioscaff).

1. EHT Generación y condiciones de cultivo Fabricación de fibrina basado en EHT se realizó como se describe en otro lugar 4. En resumen, la generación de fibrina, basado en EHT para fines de implantación, una mezcla maestra se prepara con células aisladas de neonatos ROSA / luciferasa ASE corazones de ratas transgénicas, fibrinógeno bovino y Matrigel. Agarosa moldes de fundición se prepararon utilizando separadores de teflón colocados en placas de cultivo de 6 pocillos. Después de la solidificación de la agarosa, separadores fueron retirados y bastidores de silicona después se colocaron en placas de cultivo con los mensajes de llegar en los moldes. Para generar altas tensiones, la mastermix se mezcló brevemente con una cantidad calculada de la trombina y la pipeta en el molde. Después de la polimerización del fibrinógeno, bastidores de silicona con EHTs adherido a los postes fueron removidas suavemente de los moldes de agarosa, transferidos a las nuevas 6-y placas de cultivo celular y mantiene en un 37 ° C, 7% de CO 2 de cultivo celular incubadora usando a medida medio de cultivo celular. EHT se mantuvieron bajo condiciones de cultivo celular hasta el día diez. Durante este lapso de tiempo, las células de corazón de rata neonatal comenzó a interconectar alargada, y alinear a lo largo de las líneas de fuerza en medio de mensajes de silicona. En el momento de la implantación, las contracciones espontáneas coherente se observaron, desviando los mensajes de silicona. 2. EHT implantación EHT implantación se llevó a cabo, ya sea en inmunocompetentes Brown Norway (BN) ratas, ratones o inmunodeficientes desnuda para investigar la respuesta inmune alogénico. Ratas BN y desnuda un peso de 100 - 150 g fueron adquiridos de Charles River Alemania (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) y alojados en condiciones convencionales, dieta estándar comida de rata y libidum agua ad. Ratas inmunodeficientes se encuentran en las camas estéril, jaulas, agua esterilizada y se utiliza. El comité de evaluación ética alemán revisó y aprobó los procedimientos con animales. Todos los instrumentos quirúrgicos son esterilizados antes de su uso. El procedimiento de implante se realiza de la siguiente manera: Rata son anestesiados con isoflurano (2,5-3%), utilizando una cámara de inducción. La exposición humana a isoflurano se puede reducir mediante el trabajo en una mesa de corriente descendente o no de recirculación de campana. La temperatura corporal se mantiene durante el procedimiento quirúrgico. <ol><li> Afeitarse la zona abdominal y aplicar ungüento oftálmico para evitar que los ojos se sequen durante la anestesia. </li><li> Coloque el ratón sobre la espalda y colocar una máscara sobre su nariz y la boca para mantener la anestesia. </li><li> Desinfectar el área abdominal con Betadine y etanol al 80%. Hisopo de limpieza de suciedad, desde el centro del área afeitada movimiento hacia afuera, hacia la zona de pelo. </li><li> Revisar los reflejos pellizcar las patas traseras para asegurarse de que la rata es lo suficientemente anestesiado. </li><li> Coloque el animal y realizar una incisión abdominal que separa la piel y el músculo en dos pasos para abrir el abdomen. Caliente se utiliza la esterilización de cuentas entre la piel y la apertura de los músculos. </li><li> Lugar de los intestinos en una solución salina caliente guante sin polvo hidratada. Veces el guante de todo el intestino para evitar la pérdida de humedad. </li><li> Eliminar el tejido graso y exponer el bazo. </li><li> Visualizar y difundir el epiplón mayor con unas pinzas. </li><li> Corte cuidadosamente EHT de la suspensión de los mensajes de silicona y la transferencia en el epiplón mayor. </li><li> Envuelva el mayor omentus todo el EHT y fijar con dos suturas de prolene 7-0 sola (Ethicon, Norderstedt, Alemania) </li><li> Luego mueva el intestino en el abdomen. </li><li> Enjuague bien el abdomen con solución salina estéril precalentada. </li><li> Cerca de la capa muscular de la pared abdominal usando suturas de prolene 6-0 en ejecución (Ethicon, Norderstedt, Alemania). </li><li> Use 5-0 prolene (Ethicon, Norderstedt, Alemania) que se ejecuta suturas para cerrar la piel. </li><li> Mientras que la rata aún está en la anestesia, inyectar 5 mg / kg por vía subcutánea Carprofen. </li><li> Para proporcionar una analgesia suficiente para este tipo de procedimiento, un analgésico (como el metamizol) se añade al agua potable (50 mg Metamizol por 100 ml) de medicamentos para el dolor durante 3 días después del trasplante. </li></ol> 3. Bioluminiscencia de imágenes después de la implantación EHT La plataforma bioimagen IVIS (Xenogen, Alameda, CA, EE.UU.) se utiliza para obtener imágenes de bioluminiscencia no invasiva in vivo y los resultados se analizaron mediante la viva imagen IVIS (Xenogen) paquete de software. Imágenes se realiza diariamente a partir de 2 horas tras la intervención. Anestesiar la rata con isoflurano (2,5 - 3%) con una cámara de inducción. <ol><li> Desinfectar el área abdominal y torácica ampliamente mediante Provo-yodo, el próximo uso etanol al 80%, repetir este paso tres veces. </li><li> Inyectar d-luciferina (Xenogen, 375 mg / kg de peso corporal) ip </li><li> Lugar ratas anestesiadas en la cámara de imágenes IVIS (hasta 4 ratas pueden ser analizados al mismo tiempo). </li><li> Evaluar la intensidad de la señal de luc + dentro de las células EHT en unidades de fotones / s / cm 2 / steridianin la región de interés (ROI) al inicio del estudio (120 minutos después de la implantación) y en los días 1, 2, 3, 5, 7, 10, y en las semanas 2, 3 y 4. Tenga en cuenta el pico de la señal (aparece alrededor de 20 minutos después de D-luciferina de la inyección). </li></ol> Crear un gráfico (Excel) que muestra la intensidad de la señal a través del tiempo. 4. La correlación de los resultados de BLI y ELISPOT El celular in vivo la respuesta inmune en BN inmunocompetentes y inmunodeficientes ratas desnudas fueron estudiados después de EHT trasplante. El bazo de los animales receptores se cosechó 5 días después del trasplante de EHT para aislar esplenocitos destinatario. ELISPOT con mitomicina inhibe EHTs (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) como estimulador y 5 x 10 6 esplenocitos destinatario como células de respuesta se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante (BD Biosciences) con IFN-γ y recubierto de IL-4 placas para investigar TH1-, y la respuesta TH2, respectivamente. IFN-γ e IL-4 puntos fueron significativamente mayores en el modelo inmunocompetentes, en comparación con el modelo de inmunodeficiencia (IFN-γ: p = 0,001; IL-4: p = 0,023; t de Student-test). 5. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2605/2605fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Correlación de los resultados de BLI y ELISPOT a) El celular in vivo la respuesta inmune en personas inmunocompetentes Noruega Brown y inmunodeficientes ratas desnudas fueron estudiados después de la implantación EHT. Esplenocitos receptores se cosecharon cinco días después de la implantación EHT. IFN? y la expresión de IL-4 fue evaluada por ensayos de ELISPOT con mitomicina inhibe EHT como estimuladores y 5x106 esplenocitos destinatario como células de respuesta. Th1 y Th2 fueron significativamente mayores en el modelo inmunocompetentes en comparación con el modelo de inmunodeficiencia como se evidencia por IFN-y IL-4, respectivamente. b) Luc EHTs + fueron trasplantados en el mayor omentus de cualquiera de las ratas BN inmunocompetentes o inmunodeficientes ratas desnudas. Supervivencia de las células fue seguido longitudinalmente por BLI. La tasa de los animales que rechazaban el EHTs trasplantado se presenta. Todas las ratas BN rápidamente rechazó el trasplante de EHT, mientras que las células sobrevivieron en ratas de células T deficientes.

<ol><li>Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering myocardial tissue.</a> Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).</li>
<li>van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transplantation+of+adipose+tissue-+and+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+infarcted+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart.</a> Transplantation. 87, 642-652 (2009).</li>
<li>Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Firefly+rats%22+as+an+organ%2Fcellular+source+for+long-term+in+vivo+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">"Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging.</a> Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).</li>
<li>Hansen, A., Eder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drug+Screening+Platform+Based+on+Engineered+Heart+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue.</a> Circ Res. , (2010).</li>
</ol>

Antes de la aplicación clínica de la tecnología EHT para la reparación cardiaca, las preguntas fundamentales tales como la inmunogenicidad de los componentes celulares y la matriz o la supervivencia del injerto después de la implantación deben ser evaluados en modelos experimentales. In vivo imágenes de bioluminiscencia representa una técnica nueva y útil para la supervivencia de la célula de seguimiento tras el trasplante . Hemos logrado generar fibrina basado en EHT contiene luciferasa positivo (luc +) las cé...

<ul><li> LEW-Tg (Gt (ROSA) 26Sor-luc) 11Jmsk ratas (número NBPR rata 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) </li><li> Fibrinógeno bovino (solución madre: 200 mg / ml aprotinina más 5 mg / ml de fibrinógeno en NaCl 0,9%, Sigma F4753) </li><li> Matrigel (BD Bioscience 356235) </li><li> DMEM (Biochrome F0415) </li><li> Suero de caballo (Gibco 26050) </li><li> Penicilina / estreptomicina (Gibco 15140) </li><li> La insulina (Sigma-Aldrich I9278) </li><li> Aprotinina (Sigma Aldrich A1153) </li><li> d-luciferina (Biosynth L-8220) </li><li> Inmunoenzimático lugar (ELISPOT) placas de ensayo (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99) </li></ul>

bioluminiscencia de imágenes para la evaluación de la respuesta inmune después de la implantación de tejido cardiaco de ingeniería (eht)

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Diversas técnicas de la ingeniería de tejidos cardíacos han llevado a cabo en las últimas décadas, incluidas las estrategias de andamios utilizando materiales de andamiaje o nativo o bioartificiales, el atrapamiento de los miocitos cardíacos en los hidrogeles, como la fibrina o el colágeno y el apilamiento de las monocapas miocitos 1. Estos conceptos tienen por objeto la restauración de compromiso de la función cardíaca (por ejemplo después de un infarto de miocardio) o como modelos experimentales (por ejemplo, toxicología predictiva y la detección de sustancias o modelos de enfermedad). Un control preciso de la supervivencia celular después de la implantación del tejido del corazón de ingeniería (EHT) se ha convertido en posible con in-vivo de imágenes de bioluminiscencia (BLI) técnicas 2. A continuación se describe la generación de fibrina, basado en EHT a partir de una cepa de rata transgénicos con expresión ubicua de la luciferasa de luciérnaga (ROSA / Tg luciferasa-ASE, 3). La implantación se realiza en el epiplón mayor de cepas de ratas diferentes para evaluar la respuesta inmune del organismo receptor después de la implantación EHT. Comparación de los resultados generados por BLI y la enzima técnica vinculada al contado Inmuno (ELISPOT) confirman la utilidad de BLI para la evaluación de la respuesta inmune.

Este video muestra el uso del<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de bioluminiscencia para estudiar la respuesta inmune después de la implantación de tejido cardiaco de Ingeniería (EHT) en ratas.

Bioluminiscencia de imágenes para la evaluación de la respuesta inmune después de la implantación de tejido cardiaco de Ingeniería (EHT)

En las últimas décadas se han implementado diversas técnicas de ingeniería de tejido cardíaco, incluyendo estrategias de andamiaje que utilizan ya sea material nativo o...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar la imagenología bioluminiscente in vivo para estudiar las respuestas inmunitarias tras el implante de tejido cardíaco ingenierizado o EHT en ratas. Esto se logra primero generando EHS positivos para luciferasa. A continuación, los EHS que expresan luciferasa de manera estable se trasplantan al epiplón mayor de ratas receptoras.Luego, se puede realizar imágenes de bioluminiscencia in vivo en animales receptores para monitorear de forma no invasiva la supervivencia y el rechazo del EHT a lo largo del tiempo. Mediante este modelo, la intensidad y la cinética del rechazo agudo, por ejemplo, pueden correlacionarse con la disminución de la intensidad de la señal de bioluminiscencia observada a lo largo del tiempo. La ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes como la histología es que las mediciones diarias permiten una evaluación no invasiva y longitudinal de la supervivencia del injerto.Este método puede proporcionar información sobre la supervivencia y el rechazo de tejidos cardíacos ingenierizados, pero también puede aplicarse a otras preguntas. Por ejemplo, el metabolismo de ehs. La técnica bili será demostrada por Christiana Parman, quien realiza esta técnica a diario.En mi laboratorio, primero se aíslan células cardíacas transgénicas de ratas neonatales luciferasa Lu para generar DHT a base de fibrina con fines de implantación; prepare una mezcla maestra que contenga células aisladas de corazones de ratas transgénicas luciferasa Lu neonatales, fibrinógeno bovino y matrigel en X-D-M-E-M y NKM. Prepare moldes de colado de aros añadiendo nueve mililitros de aros al 2 % en PBS a cada pocillo de placas de cultivo de seis pocillos, y luego colocando separadores de teflón en los pocillos. Una vez que el aros se solidifique, retire los separadores y coloque rejillas de postes de silicona sobre las placas de cultivo, de modo que los postes alcancen el interior de los moldes.Para generar EHT, mezcle suavemente la mezcla maestra, luego agregue una cantidad calculada de trombina a la mezcla maestra y mezcle brevemente. A continuación, pipetee rápidamente 1100 microlitros de la mezcla maestra en cada molde. Después de que el fibrinógeno polimerice, retire suavemente los bastidores con los postes que ahora tienen EHT adherido de los moldes de fundición de agros y transfiera los bastidores a nuevas placas de cultivo celular de seis pocillos que contengan ocho mililitros de medio casero por pocillo.Los EHT se mantienen durante 10 días en un incubador de cultivo celular a 37 grados Celsius y 7 % de dióxido de carbono. El medio se cambia tres veces por semana. Durante este período de cultivo, las células cardíacas de rata neonatal comenzarán a alargarse, interconectarse y alinearse a lo largo de las líneas de fuerza entre los postes de silicona.En el momento del implante, se observarán contracciones espontáneas coherentes. Esterilice los instrumentos para cirugía mediante autoclave antes de usar y caliente 30 mililitros de solución salina estéril. Las ratas para el implante deben pesar entre 100 y 150 gramos y mantenerse en condiciones convencionales, con alimento estándar para ratas y agua ad libitum.En este video, se utilizan ratas marrones de Noruega tras la anestesia; sedar a las ratas antes de la cirugía y confirmar la sedación mediante la ausencia de respuesta al pellizco en los dedos de los pies mientras la rata está bajo anestesia, inyectar cinco miligramos por kilogramo de peso corporal, carens por vía subcutánea en el flanco, afeitar el área abdominal y aplicar pomada oftálmica para prevenir que los ojos del animal se sequen. Durante la anestesia, desinfectar el área abdominal utilizando Betadine y luego pasando un hisopo con etanol al 80% de lo limpio a lo contaminado. Repetir esta desinfección.Dé tres pasos, cubra al animal y realice una incisión abdominal en la línea media, separando la piel y el músculo en dos pasos para abrir el abdomen. Utilice la esterilización por perlas calientes en los instrumentos entre cada corte. Humedezca un guante sin polvo con la solución salina.Coloque los intestinos dentro del guante. Doble el guante alrededor de los intestinos para evitar la pérdida de humedad. Abrace la incisión y exponga el bazo.Identifique y extienda el mayor momento con pinzas. Corte cuidadosamente el EHT de los postes de silicona de suspensión y transfiéralo al mayor momento. Envuelva el mayor momento alrededor del EHT y ciérrelo fijándolo con dos suturas simples de prolina de siete oh.A continuación, devuelva los intestinos al interior del abdomen. Lave el abdomen con un mililitro de solución salina estéril precalentada. Cierre la capa muscular de la pared abdominal utilizando suturas continuas de prolina 6-0.Utilice cinco puntos de sutura corredizos de prolina 5-0 para cerrar la piel y proporcionar una analgesia suficiente para este tipo de procedimiento. Administre 50 miligramos por 100 mililitros de ole en el agua de bebida durante tres días posteriores a la implantación. La plataforma de bioimagen IVUS se utiliza para la obtención de imágenes de bioluminiscencia no invasiva in vivo, y los resultados se analizan mediante el software IVUS Living Image.Se realiza la imagenología del paquete diariamente, comenzando dos horas después de la cirugía. Antes de visualizar la bioluminiscencia del EHT, anestesie la rata y confirme la sedación mediante el pellizco del dedo del pie. Desinfecte el área abdominal.Inyecte Lucifer a 375 miligramos por kilogramo de peso corporal inicialmente y coloque la rata anestesiada en la cámara de imagen ivu. Se pueden analizar hasta cuatro ratas al mismo tiempo. Utilice el software de imagen viva IVUS para observar y registrar la señal máxima, que aparece aproximadamente 20 minutos después de la inyección de Lucifer.Luego, establezca la intensidad de señal basal de células positivas para luciferasa dentro del EHT en unidades de fotones por segundo por centímetro cuadrado por Ceridian en la región de interés, 120 minutos después del implante y en los días 1, 2, 3, 5, 7, 10 y en las semanas dos, tres y cuatro. Los datos pueden expresarse en forma de gráfico, mostrando la intensidad de señal a lo largo del tiempo. Las respuestas inmunitarias celulares in vivo en ratas Brown, Norway inmunocompetentes e inmunodeficientes.Se estudiaron ratas desnudas tras la implantación de EHT; los linfocitos SP del receptor se obtuvieron cinco días después de la implantación de EHT. La expresión de interferón gamma y de IL-4 se evaluó mediante ensayos de lisado utilizando EHT inhibido con mitomicina como células estimuladoras y cinco veces 10 a la 6 células del receptor como células respondedoras. Las respuestas TH1 y TH2 fueron significativamente más altas en el modelo inmunocompetente en comparación con el modelo inmunodeficiente, según lo evidenciado por la producción de interferón gamma y de IL-4, respectivamente.Los EHS positivos para LUCIFERASA se trasplantaron en el gran omento de ratas PN inmunocompetentes o de ratas desnudas inmunodeficientes. La supervivencia celular se siguió longitudinalmente mediante imagenología de bioluminiscencia (BLI). Se presenta la tasa de animales que rechazaron los EHS trasplantados.Todas las ratas BN rechazaron rápidamente los trasplantes de EHT, mientras que las células sobrevivieron en ratas deficientes en linfocitos T. Una vez dominadas, las cirugías pueden realizarse en cuestión de minutos si la técnica se lleva a cabo correctamente después de la cirugía. Se pueden realizar otros métodos, como ensayos inmunológicos e histología, para responder otras preguntas relacionadas con la infiltración celular y la respuesta humoral.

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Bioluminiscencia de imágenes para la evaluación de la respuesta inmune después de la implantación de tejido cardiaco de Ingeniería (EHT) (Video) | JoVE Journal

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