La ingeniería biológica basada en los injertos vasculares El uso de un biorreactor pulsátil

El objetivo general de este procedimiento es diseñar injertos vasculares basados en biología utilizando un sistema de biorreactor pulsátil. Esto se logra preparando un andamio biodegradable a partir de una malla de PGA en el cual las células crecerán en fila y ensamblando estos andamios en una cámara de biorreactor. Luego, los andamios se siembran con células de músculo liso y una tapa con entrada de aire y tubo de alimentación sella la cámara del biorreactor.

A continuación, el biorreactor se conecta a un sistema de flujo para proporcionar un flujo pulsátil a los vasos dentro del biorreactor. En el reactor, las células crecen formando vasos que superan pruebas inmunoquímicas, bioquímicas y mecánicas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la enfermedad arterial coronaria, ya que representa un enfoque prometedor para regenerar injertos vasculares de pequeño diámetro implantables destinados al bypass arterial.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la ingeniería vascular, puede aplicarse a otros sistemas orgánicos que están sujetos a fuerzas fisiológicas cíclicas. En general, las personas que son nuevas en este método tendrán dificultades. Se necesitará mucha práctica para dominar completamente las habilidades.

Tuvimos por primera vez la idea de este enfoque cuando comprendimos la importancia de aplicar estimulación mecánica fisiológica para regenerar construccos de ingeniería. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el proceso de uso del biorreactor es difícil de aprender debido a la gran cantidad de pasos y solo puede adquirirse mediante una demostración detallada. Para comenzar, utilice agua destilada para limpiar secciones de 30 centímetros de longitud de tubo de silicona con un diámetro interno de tres milímetros y déjelas secar al aire.

Utilice tijeras para cortar una sección de malla de PGA de 1,1 centímetros por ocho centímetros para cada trozo de tubo utilizando un hemostato, de modo que la malla de PGA quede sujeta al tubo con sutura Dexon 6.0; ate tres nudos quirúrgicos y continúe con puntos simples utilizando el hemostato. La malla fijada forma un andamio de PGA. Lave los andamios sumergiéndolos primero en hidróxido de sodio uno molar durante uno a dos minutos, y luego realice tres enjuagues en agua destilada durante dos minutos cada uno. Séquelos suavemente entre enjuagues y déjelos secar al aire en una campana durante 15 minutos después del tercer enjuague.

Una vez seco, suturar una funda de Dacron de un centímetro en cada extremo de la malla con tres puntadas. Dejar un solapamiento de dos a tres milímetros del tubo y no perforar el tubo. Asegurarse de dejar aproximadamente 15 centímetros de hilo libre para su uso posterior en este protocolo.

Todos los componentes del biorreactor y herramientas se autoclavan previamente. El día anterior a la iniciación del cultivo en el biorreactor, este debe ensamblarse parcialmente: sumerja los componentes del biorreactor, los andamios, la malla, el tubo de silicona, los instrumentos quirúrgicos y un alambre delgado más largo que la longitud del biorreactor en un baño de etanol al 70 % durante al menos 30 minutos mientras están sumergidos. Utilice el alambre para pasar el tubo de silicona a través de los brazos laterales del reactor.

Ahora saque el biorreactor y sujete los andamios de PGA en su interior fijando los refuerzos de Dacron sobre los bordes ensanchados de vidrio. Utilice el exceso de sutura para asegurar cada refuerzo. A continuación, mediante conectores, fije el tubo de silicona en un lado del andamio a un par de brazos del biorreactor y conecte el tubo del otro lado del andamio a los otros dos brazos.

Una vez instalados los conectores, extráigalos de los brazos laterales y enjuague el biorreactor con etanol. Deje que el reactor repose durante 10 minutos en cada lado. Coloque el biorreactor sobre algunas placas de Petri y enjuáguelo con cultivo de tejidos.

Clasifique el agua. Mediante el uso de una pipeta, asegúrese de enjuagar también la malla y el tubo. Ahora coloque una barra de agitación estéril en el reactor para su uso futuro y seque el aparato durante la noche en la campana con el ventilador encendido y la luz UV apagada a partir de este momento.

No se incline sobre el reactor, ya que esto podría provocar contaminación. Durante la preparación, todos los conectores deben limpiarse con alcohol. Antes de realizar las conexiones, muchas de las uniones se refuerzan luego con paraformo, el cual debe empaparse en etanol al 70 % antes de su aplicación. Por lo tanto, tenga abundancia de ambos materiales.

Como medida de precaución y listo para usar, coloque un plato de Petri estéril sobre cada abertura del biorreactor para proteger el andamio de PGA del interior frente a contaminantes. Ahora, comience la preparación conectando el puerto de inyección al tercer brazo no utilizado del biorreactor. A continuación, conecte la bolsa de suero al sistema de flujo.

Con el conjunto de tubos para morsa, ate el extremo azul lo más cerca posible de la unión en Y y sujete el tubo con una pinza. Conecte el tubo rojo al extremo opuesto de la bolsa de suero. Luego conecte el tubo blanco a un lado del sistema de flujo.

Inserte una llave de paso de tres vías en el sistema de flujo. Conecte un extremo del tubo del transductor de presión a la llave de paso y el otro extremo a la abertura central de la bolsa de IV. Para llenar parcialmente el sistema de flujo y verificar fugas, agregue 350 mililitros de PBS y 1% fungi zone a la bolsa de IV.

Utilizando una jeringa de 60 mililitros antes o después de conectarla al sistema de flujo, ajuste la llave de paso para controlar la dirección del flujo de PBS y comprima la bolsa para purgar el sistema. Este paso puede realizarse antes o después del acomodamiento de las células. Ahora las células pueden acomodarse en el biorreactor.

En este ejemplo, reconstituya y suspenda 8 millones de células SM, lo que equivale aproximadamente a una placa T-75 confluyente, en 1,25 mililitros de medio, y distribúyalas uniformemente sobre el andamio de PGA desde la unión de Dacron hasta la unión de Dacron. Después de añadir las células, limpie con alcohol el borde del biorreactor. Evite permanecer sobre el reactor.

A continuación, ensamble cuidadosamente la tapa de corcho de silicona. Asegúrese de no exponer la parte inferior de la tapa al retirarla de la bolsa de autoclave o durante cualquiera de los siguientes pasos de fijación. En primer lugar, conecte el puerto de inyección al tubo de alimentación en el conector macho.

En segundo lugar, sujete filtros de PTFE de 0,20 micrones a cada uno de los tres puertos de aire. En tercer párrafo, cubra el puerto de inyección con película. Inserte la tapa ensamblada con el tapón de silicona en el biorreactor de vidrio.

Asegúrese de que el tubo de alimentación no toque los andamios de PGA colocados. Luego selle con paraform. Ahora conecte el biorreactor al sistema de flujo y coloque el biorreactor y el sistema de flujo dentro de un incubador a 37 grados Celsius.

Durante 25 a 30 minutos, el reactor debe colocarse de lado y girarse cada cinco minutos. A continuación, mientras aún está en la incubadora, llene la cámara del biorreactor con 400 mililitros de medio de cultivo 4 a 10 utilizando una bomba a través de un tubo de alimentación. Ahora incube los andamios sembrados sin bombeo pulsátil durante seis a siete días a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.

No es necesario cambiar el medio ni suplementar con vitamina C durante este periodo antes de encender la bomba; inspeccione los tubos en busca de fugas o dobleces. Luego, ajuste la velocidad de la bomba para mantener un rango de presión entre -30 y 270 milímetros de mercurio. Monitoree y mantenga esta presión diariamente durante todo el cultivo.

Los cambios de medio y la suplementación con ácido ascórbico deben realizarse dos veces por semana mientras el andamiaje crece con bombeo pulsátil para alimentar con medio fresco. Primero, coloque la entrada de inyección y el filtro de PTFE en las tapas de alimentación, tanto para el cambio de medio como para la eliminación de medio residual. A continuación, coloque firmemente el tubo de alimentación en la bomba de doble dirección e inserte un extremo en la entrada de alimentación del biorreactor y el otro extremo en la tapa de alimentación. Ahora, comience lentamente a bombear 200 mililitros de medio.

Gradualmente se puede aumentar la velocidad de la bomba. Luego, coloque un nuevo tubo de alimentación e inicie lentamente la bomba con 200 mililitros de medio fresco. Para agregar ácido ascórbico al reactor, retire 25 mililitros de medio utilizando una jeringa estéril de 30 mililitros.

Añada cinco mililitros de solución estéril de ácido ascórbico y luego devuelva los 25 mililitros. Los vasos diseñados aparecerán opacos y alcanzarán un grosor de pared de aproximadamente 250 micrones tras ocho semanas de cultivo. Bajo condiciones pulsátiles, la tinción con hematoxilina, eosina y tinción de tejidos de vasos diseñados muestra cambios en la morfología tisular con el tiempo y con el pulso.

El lado luminal de los vasos se indica con una tinción tri cromática de Masson. La tinción para colágeno muestra que el vaso pulsado durante cuatro semanas tiene más colágeno que su contraparte no pulsada. Las flechas blancas señalan los fragmentos restantes de PGA en los vasos a las 12 semanas. El análisis inmunoquímico muestra la expresión del marcador temprano de músculo liso alfa actina, el marcador intermedio de músculo liso calponina 1 y el marcador tardío de músculo liso cadena pesada de miosina. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en siete u ocho horas si se lleva a cabo correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar todo de la manera más limpia y estéril posible siguiendo este protocolo. Se pueden realizar otros métodos, como la modificación de la luz de los vasos ingenierizados, con el fin de responder preguntas adicionales, como la importancia de la modificación de la superficie luminal en el mantenimiento de los vasos ingenierizados durante estudios in vivo. Después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos, especialmente la ingeniería vascular, exploraran posibles métodos para tratar enfermedades de las arterias coronarias en modelos animales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener injertos vasculares implantables mediante un cultivo postal dinámico. No olvide que trabajar con hidróxido de sodio puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de protección ocular y bata de laboratorio al realizar este procedimiento.