La ingeniería biológica basada en los injertos vasculares El uso de un biorreactor pulsátil

El objetivo general de este procedimiento es diseñar injertos vasculares de base biológica utilizando un sistema de biorreactor pulsátil. Esto se logra preparando un andamio biodegradable de malla PGA donde crecerán las células en hileras y ensamblándolas en una cámara de biorreactor. A continuación, los andamios se asientan con células musculares lisas y una tapa con aire y un tubo de alimentación sella la cámara del biorreactor.

A continuación, el biorreactor se conecta a un sistema de flujo para proporcionar un flujo pulsátil a los recipientes del biorreactor. En el reactor, las células se convierten en recipientes que pasan pruebas inmunoquímicas, bioquímicas y mecánicas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la enfermedad de las arterias coronarias, ya que esta técnica es un enfoque prometedor para regenerar injertos vasculares implantables de pequeño diámetro para la derivación arterial.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la ingeniería vascular, se puede aplicar a otros sistemas de órganos que están sometidos a fuerzas fisiológicas cíclicas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades. Necesitarás mucha práctica para dominar completamente las habilidades.

La primera vez que tuvimos la idea de este enfoque fue cuando nos dimos cuenta de la importancia de aplicar la estimulación mecánica fisiológica para regenerar construcciones de ingeniería. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el proceso de grabación del biorreactor es difícil de aprender porque hay muchos pasos y solo se puede adquirir a través de una demostración detallada. Para comenzar, use agua destilada para limpiar secciones de 30 centímetros de largo de tubos de silicona de tres milímetros de diámetro interior y deje que se sequen al aire.

Use tijeras para cortar una sección de 1.1 centímetros por ocho centímetros de malla PGA para cada pieza de tubo usando un hemostático, de modo que la malla PGA al tubo con sutura Dexon 6.0 ate tres nudos quirúrgicos y siga con puntos individuales con hemostático, la malla asegurada hace un andamio PGA. Lave los andamios sumergiéndolos primero en hidróxido de sodio molar durante uno o dos minutos, y luego tres inmersiones en agua destilada durante dos minutos por inmersión. Sécalos con palmaditas entre lavados y déjalos secar al aire en una capucha durante 15 minutos después del tercer lavado.

Una vez seco, sutura puños de dacrón de un centímetro en cada extremo de la malla con tres puntos. Deje un superpuesto de tubo de dos a tres milímetros y no perfore el tubo. Asegúrese de dejar unos 15 centímetros de sutura libre para su uso posterior en este protocolo.

Todos los componentes y herramientas del biorreactor se esterilizan en autoclave de antemano. El día antes de iniciar el cultivo del biorreactor, el biorreactor debe estar parcialmente ensamblado sumergir los componentes del biorreactor, los andamios, por lo que la malla de los tubos de silicona, los instrumentos quirúrgicos y un alambre delgado más largo que la longitud del biorreactor en un baño de etanol al 70% durante al menos 30 minutos mientras está sumergido. Use el cable para tirar del tubo de silicona a través de los brazos laterales del reactor.

Ahora emerge el biorreactor y fije los andamios PGA en el interior sujetando los manguitos de dacrón sobre los labios de vidrio acampanado. Use el exceso de sutura para atar cada manguito. A continuación, utilizando conectores, conecte el tubo de silicona a un lado del andamio con un par de brazos de biorreactor y fije el tubo del otro lado del andamio a los otros dos brazos.

Cuando los conectores estén instalados, sáquelos de los brazos laterales y enjuague el biorreactor con etanol. Deje el reactor en remojo durante 10 minutos por cada lado. Coloque el biorreactor en unas placas de Petri y enjuáguelo con cultivo de tejidos.

Grado del agua. Con una pipeta, asegúrese de enjuagar también la malla y el tubo. Ahora coloque una barra agitadora estéril en el reactor para su uso futuro y seque el aparato durante la noche en la campana con el soplador encendido y los rayos UV apagados a partir de este punto.

No se incline sobre el reactor, ya que esto podría provocar contaminación. Durante la configuración, todos los conectores deben limpiarse con alcohol. Antes de realizar las uniones, muchas de las uniones se refuerzan con paraform, que debe empaparse en etanol al 70% antes de aplicarlo. Así que ten un montón de ambos.

Como medida de precaución, coloque una placa de Petri estéril sobre cada abertura del biorreactor para proteger el andamio PGA en el interior de los contaminantes. Ahora comience la configuración conectando el puerto de inyección al tercer brazo no utilizado del biorreactor. A continuación, conecte la bolsa intravenosa con el sistema de flujo.

Con el juego de tubos de morsa, ate el extremo azul lo más cerca posible de la unión en Y y sujete el tubo. Conecte el tubo rojo al extremo más alejado de la bolsa intravenosa. A continuación, conecte el tubo blanco a un lado del sistema de flujo.

Inserte una llave de paso de tres vías en el sistema de flujo. Conecte un extremo del tubo del transductor de presión a la llave de paso y conecte el otro extremo a la abertura central de la bolsa intravenosa. Ahora, para llenar parcialmente el sistema de flujo y verificar si hay fugas, agregue 350 mililitros de PBS y 1% de zona de hongos a la bolsa intravenosa.

Usando una jeringa de 60 mililitros antes o después de conectarlo al sistema de flujo, ajuste la llave de paso para controlar la dirección del flujo de PBS y apriete la bolsa para enjuagar el sistema. Este paso se puede realizar antes o después del asiento de la celda. Ahora las células se pueden asentar en el biorreactor.

En este ejemplo, resus suspende 8 millones de células SM, que es aproximadamente un T 75 confluente en 1,25 mililitros de medio y las gotea uniformemente sobre el andamio PGA desde la unión de Dacron hasta la unión de Dacron. Después de agregar las celdas, limpie el borde del biorreactor con alcohol. Evite sobrevolar el reactor.

A continuación, ensamble con cuidado la tapa del tapón de silicona. Asegúrese de no exponer la parte inferior de la tapa mientras se retira de la bolsa del autoclave o durante cualquiera de los siguientes pasos de fijación. Primero, conecte el puerto de inyección al tubo de alimentación en el conector macho.

En segundo lugar, coloque filtros de PTFE de 0,20 micras en cada uno de los tres aeropuertos. En tercer lugar, filme el puerto de inyección. Inserte la tapa del tapón de silicona ensamblada en el biorreactor de vidrio.

Asegúrese de que el tubo de alimentación no toque los andamios PGA sentados. Luego selle con paraform. Ahora conecte el biorreactor al sistema de flujo y coloque el biorreactor y el sistema de flujo dentro de una incubadora a 37 grados centígrados.

Durante 25 a 30 minutos, el reactor debe colocarse de lado y girarse cada cinco minutos. A continuación, mientras aún está en la incubadora, llene la cámara del biorreactor con 400 mililitros de cuatro a 10 medios de cultivo utilizando una bomba a través de un tubo de alimentación. Ahora incube los andamios sembrados sin ningún bombeo pulsátil durante seis o siete días a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.

No es necesario cambiar el medio ni tomar suplementos de vitamina C durante este tiempo antes de encender la bomba, inspeccione el tubo en busca de fugas o torceduras. A continuación, ajuste la velocidad de la bomba para mantener un rango de presión entre 30 y 270 milímetros negativos de mercurio. Controle y mantenga esta presión diariamente durante toda la cultura.

Los cambios de medio y la suplementación de ácido ascórbico deben realizarse dos veces por semana mientras el andamio crece con bombeo pulsátil para alimentar primero el medio fresco, conecte el puerto de inyección y el filtro de PTFE a las tapas de alimentación para fines de eliminación de desechos tanto de medio como de medio cambio. A continuación, coloque el tubo de alimentación firmemente en la bomba direccional doble e inserte un extremo en el puerto de alimentación del biorreactor y el otro extremo en la tapa de alimentación. Ahora comience a bombear lentamente 200 mililitros de medio.

Gradualmente se puede aumentar la velocidad de la bomba. Luego, conecte una nueva sonda de alimentación y comience a bombear lentamente 200 mililitros de medio fresco. Para agregar ácido ascórbico al reactor, retire 25 mililitros de medio con una jeringa estéril de 30 mililitros.

Agregue cinco mililitros de solución estéril de ácido ascórbico y luego devuelva los 25 mililitros. Los recipientes de ingeniería media parecerán opacos y alcanzarán un espesor de pared de aproximadamente 250 micras después de ocho semanas de cultivo. En condiciones pulsátiles, la tinción con hemat, toína y eosina de los vasos modificados genéticamente muestra cambios en la morfología del tejido con el tiempo y con la pulsación.

El lado luminal de los vasos se indica con una tinción tri CHRO de L masson. En el caso del colágeno, las flechas blancas señalan que los fragmentos de PGA restantes en los vasos a las 12 semanas. El análisis inmunoquímico muestra la expresión del marcador temprano de músculo liso alfa actina, el marcador intermedio de músculo liso cal poin one y el marcador tardío de músculo liso miosina cadena pesada Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en siete u ocho horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar todo de la manera más limpia y diligente posible siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la modificación del lumen de los recipientes diseñados, para responder preguntas adicionales como la importancia de la modificación de la superficie luminal en el mantenimiento de los recipientes diseñados durante los estudios in vivo. Después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos, especialmente la ingeniería vascular, exploraran posibles medios para tratar las enfermedades de las arterias coronarias en modelos animales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo lograr injertos vasculares de ingeniería implantables a través de un cultivo postal dinámico. No olvide que trabajar con hidróxido de sodio puede ser peligroso, y siempre se deben usar precauciones como protección para los ojos y bata de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.