Name: La disección y 2-Photon imagen de los ganglios linfáticos periféricos en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 48 s
Description: Aprende a diseccionar ganglios linfáticos periféricos en ratones para imagen de dos fotones in situ. Este método permite visualizar la motilidad de células T CD4+ en respuestas inmunitarias.

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Queremos agradecer a Paquette Rebecca de asistencia con la preparación de reactivos. MPM es apoyado por una beca Ruth L. Kirchstein predoctoral de los Institutos Nacionales de Salud y el apoyo de subvenciones GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48.071 (IP), también de los Institutos Nacionales de Salud.

1. La transferencia adoptiva de células: Vena de la cola o la inyección intraocular son métodos adecuados para la introducción de la célula de seguimiento con etiqueta fluorescente o que expresa la proteína de los linfocitos. En este vídeo. hemos demostrado la transferencia adoptiva de células por inyección vena de la cola. a. Materiales Células T CD4 + están marcadas con CFSE M 1,4 durante 30 minutos a 37 º C, se lavaron dos veces, y volvió a suspender en 100 L de RPMI-1640. Las células se cargan en una jeringa de insulina estéril calibre 28 para inyección. El número de células utilizadas depende del experimento se está realizando. Por lo general, 5 millones de células T son suficientes para una visualización sencilla de células T. Un limitador de roedores para el ratón es necesario para evitar lesiones en el animal y para ti mismo. b. Asegurar que el animal El ratón es seguro para la transferencia adoptiva de respaldo lentamente al animal en la inmovilización de los roedores (ver video) y cerrar el extremo abierto del tubo suavemente el émbolo. ¡No te sueltes de la cola del ratón durante este proceso, ya que algunos animales más pequeños pueden dar la vuelta dentro de la inmovilización. Este método evita que el animal se dañe a sí mismo y que se mueva durante la inyección. Al configurar el limitador de roedores, no empujar el émbolo más allá de lo necesario para mantener los animales de saltar hacia adelante. Además, no empujar el émbolo contra el animal, y no dejar al animal en el que lo detiene por un período prolongado de tiempo. c. Visualización de la vena de la cola Tire suavemente de la cola hacia usted para que sea ligeramente envuelta en su dedo índice y se mantiene en la parte interna de los dedos por el pulgar. Identificar las venas de la cola se encuentra en ambos lados de la cola en posición vertical. La visualización es facilitado por el calentamiento de la cola con agua tibia, luego lavarlo con etanol. d. La inyección de células Cuando la vena ha sido localizado, inserte la jeringa bisel hacia arriba en un ángulo paralelo a la vena superficial. Una vez en la vena, con suavidad el émbolo, si usted está en la vena no debe haber resistencia a la inyección. Si hay alguna resistencia, retire la jeringa y vuelva a intentarlo en un lugar diferente. Si usted está en la vena, presione lentamente el émbolo hasta que la inyección se ha completado. La cola no debe dilatarse durante la inyección. Si es así, esto significaría que la aguja no está en la vena. Es posible &quot;perder&quot; la vena durante la inyección. Si esto sucede, retire la aguja e intentar la inyección en un lugar diferente. Si usted necesita para tratar más de una inyección, lo mejor es mover la cola hacia el cuerpo del ratón desde el sitio de la inyección original. Planee con anticipación para esta posibilidad, a partir distal de la cola que tiene el espacio para otro intento en la transferencia adoptiva. e. Después de la inyección consideraciones Después de la inyección se ha completado, un pequeño reflujo de la sangre de la vena se producirá. Presione suavemente el sitio de la inyección con una limpieza de limpiar hasta que el sangrado se detenga. Retire el émbolo y dejar que el animal camina hacia adelante, fuera de la inmovilización, mientras que suavemente aferrarse a la cola. Siempre consulte con su comité de cuidado de los animales y los protocolos de utilización de animales para asegurarse de que están de acuerdo. Es importante practicar esta técnica varias veces antes de intentar el experimento real. 2. El aislamiento del nodo linfático El aislamiento de los ganglios linfáticos de dos fotones de imágenes requiere la eliminación cuidadosa de los ganglios linfáticos correcta de los tejidos circundantes. a. Selección y ubicación de los ganglios linfáticos periféricos Selección de los ganglios linfáticos de imágenes dependerá de los objetivos experimentales. Sea consciente de infección local o por inyección ganglios linfáticos de drenaje, y seleccione el nodo apropiado para la imagen. El artículo de Van den Broeck et al., Describe la ubicación y la morfología de los nódulos linfáticos murino en detalle 3. En este video, se demuestra la escisión de los seis nodos linfáticos grandes periféricos que son adecuados para el aislamiento de células o de imagen. b. Extirpación de los ganglios linfáticos: Tenga en cuenta la integridad de los tejidos, mientras que la eliminación de los ganglios linfáticos. Tenga cuidado de no romper la cápsula o de cualquier forma puedan dañar la estructura de los ganglios linfáticos. Pérdida de la integridad estructural de los ganglios linfáticos pondrá en peligro el experimento. Si es necesario, eliminar la grasa de la superficie de los ganglios linfáticos con finas pinzas de disección (# 5 Dumont) bajo un microscopio de disección. Los ganglios linfáticos no debe tener nada de grasa que queda en la superficie del nodo, ya que esto oscura imagen por la dispersión de la luz. La extirpación de los ganglios linfáticos adecuada es también una técnica importante para la práctica antes de que el experimento real en primer lugar. 3. Linfáticos Node imágenes de la instalación y consideraciones El ganglio linfático debe ser asegurado a la etapa de formación de imágenes, que en este caso consiste en una cámara empotrada. Calentado, el oxígeno-perfusión medios de comunicación se bombea a la cámara de un lado mediante una bomba peristáltica y el calentador de línea, y que sale a través de un canal a la baja-clasificados en una cámara de recolección con un tubo de vacío en un matraz de recogida de residuos. En nuestro sistema, el ganglio linfático se sumerge en 37 ° C y los medios de comunicación super-perfundidos con médicos carbogen grado (5% CO2, 95% O 2). La temperatura de los medios de perfusión debe registrarse como cerca de los ganglios linfáticos de lo posible. Su sistema en particular puede requerir variaciones en el caudal de los medios de comunicación y el diseño del escenario para dar cabida a la platina del microscopio y el objetivo. a. Los ganglios linfáticos de imagen de configuración: Como se muestra en el video, seguro que el ganglio linfático por primera fijación, medular hacia abajo (a la imagen de T o de las zonas de células B con un microscopio vertical) a un cubreobjetos de plástico, cortado al tamaño adecuado. Es importante usar un adhesivo tisular no tóxico (se utiliza VetBond ™ de 3M Corporation). El cubreobjetos se asegura en los medios de comunicación que fluye por la colocación de una cantidad muy pequeña de grasa de silicona en la parte inferior de la hoja de la cubierta, y luego adherirse a esta la base de cristal de la cámara de imágenes. b. 2-Photon imágenes consideraciones: Varios factores pueden causar que los linfocitos a dejar de moverse: la temperatura es demasiado alta o demasiado baja, el exceso de potencia del láser, la compresión u otros daños a los ganglios linfáticos, y la falta de oxígeno. Daños debidos a la potencia del láser excesiva o temperaturas&gt; ~ 39 ° C es irreversible. Si las células son escasas, a menudo es mejor para aumentar la ganancia del detector o el protocolo de células etiquetado en lugar de utilizar un láser de potencia superior para visualizar las células. Optimización de etiquetado o la expresión de proteínas fluorescentes puede ser necesaria para que la fluorescencia por encima del nivel de la autofluorescencia de fondo. Con una ganancia razonable y los ajustes de la potencia del láser, un cambio de dos registros de la fluorescencia por encima del valor (medido por citometría de flujo) es razonable para la visualización de la célula. Con ajustable de dos fotones láser, la longitud de onda de excitación debe ser un poco menos del doble del máximo de excitación de un solo fotón del fluoróforo se va a examinar. En dos fotones experimentos con más de una etiqueta o proteína fluorescente puede ser necesario experimentar con la longitud de onda de excitación utilizada para encontrar los ajustes óptimos para ambas etiquetas. Excitación de dos fotones también se puede utilizar para imágenes de las estructuras de colágeno endógeno mediante el aprovechamiento de las propiedades intrínsecas azul generación de segundo armónico. Generación de segundo armónico (SHG) se produce cuando dos fotones se combinan dentro de un material y emitir un fotón de la doble de la frecuencia de los fotones originales. En el tejido, de dos fotones de excitación se produce cuando la luz del láser incidente es perpendicular a la estructura de una proteína muy ordenado, como el colágeno. Cuestiones prácticas relativas a dos fotones imágenes fueron discutidos en cuatro revisiones de vista previa, 5.

<ol><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+tissue+imaging%3A+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
</ol>

En este protocolo de vídeo se muestran los procedimientos para la transferencia de células adoptivas y el aislamiento de ganglios linfáticos y la preparación requerida para la motilidad de linfocitos de imágenes en un ganglio linfático periférico. De dos fotones de imagen tiene varias ventajas sobre la imagen confocal en ambos tejidos explantados (en la foto) y en los preparativos intravital. En particular, el uso de infrarrojos excitación minimiza la dispersión de luz y permite obtener imágenes ~ 300 micras por debajo de la cápsula del ganglio linfático y más profundo en los tejidos alrededor de 4. Por otra parte, multi-fotón de excitación se limita hasta el punto focal del objetivo, minimizando foto decoloración y daños en los tejidos a los lados del plano focal. Como con cualquier nueva técnica, sin embargo, de dos fotones de imagen no es una panacea y sus limitaciones y peligros potenciales deben tener en cuenta 5. Entre ellas se encuentra la exigencia de que - a excepción de las señales intrínsecas, tales como la generación de segundo armónico por el colágeno de las células de interés deberán ser marcados con fluorescencia mediante sondas extrínsecas o por la expresión de proteínas fluorescentes. La impresión de este modo se crea que estas células marcadas están nadando en un vacío negro, mientras que en la verdad que estamos inmersos, e interactuar con un entorno complejo de elementos estructurales y una miríada de otras células sin etiqueta, invisible. En los seis años desde la introducción de dos fotones de imágenes a la inmunología, esta técnica ha permitido a los investigadores para hacer frente a viejas cuestiones de visualizar de manera directa en los tejidos vivos intactos los procesos incluyendo las interacciones célula-célula, la motilidad celular y la localización, vías de señalización celular y células citotóxicas matando a los acontecimientos. El campo ha evolucionado rápidamente más allá de las descripciones fenomenológicas inicial, y análisis cuantitativos, junto con el modelado y simulación por computadora ahora están comenzando a tener sentido de cómo los movimientos celulares aparentemente caótica y las interacciones dentro de los nódulos linfáticos conducen a una respuesta inmune eficiente. Este avance es un nuevo examen en una publicación reciente 1, que enumera más de 100 artículos que describen la aplicación de la microscopía de dos fotones de immunoimaging.

la disección y 2-photon imagen de los ganglios linfáticos periféricos en ratones

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

De dos fotones de imágenes ha revelado una coreografía elegante de la motilidad y las interacciones celulares en el ganglio linfático en condiciones basales y en el inicio de una respuesta inmune 1. En este sentido, los actuales métodos para la transferencia adoptiva de células T etiquetados, el aislamiento de los ganglios linfáticos, y la motilidad de imágenes de células CD4 + T en los ganglios linfáticos explantados como describió por primera vez en 2002 2. Imágenes de dos fotones de las células inmunes requiere que las células están marcados con fluorescencia, ya sea mediante la tinción con un colorante de la célula de seguimiento o por expresar una proteína fluorescente. Demostramos el procedimiento de transferencia adoptiva de células derivadas de ratones inyección de donantes en la vena de la cola de un animal receptor, donde el hogar de los órganos linfoides en aproximadamente 15-30 min. Se ilustra el aislamiento de un ganglio linfático y se describen los métodos para asegurar el montaje correcto de los ganglios linfáticos extirpados. Otras consideraciones, como la oxigenación adecuada de los medios de perfusión, la temperatura y la potencia del láser se discuten. Finalmente, se presentan las imágenes de vídeo en 3D de las células CD4 + células T ingenuas exhibiendo la motilidad estado de equilibrio a 37 ° C.

De dos fotones de imágenes ha descubierto la motilidad de linfocitos y las interacciones celulares en el ganglio linfático en condiciones basales y durante una respuesta inmune 1. En este caso, se demuestra la transferencia adoptiva de células T, el aislamiento de los ganglios linfáticos, y la motilidad de imágenes de células CD4 + T en los ganglios linfáticos explantados.

La disección y 2-Photon imagen de los ganglios linfáticos periféricos en ratones

La imagenología de dos fotones ha revelado una elegante coreografía de motilidad e interacciones celulares dentro del ganglio linfático en condiciones basales y en el...

Hola, me llamo Melanie Matthew. Soy del laboratorio de Micah Helen en la Universidad de California en Irvine. Y hoy vamos a extraer ganglios linfáticos de un ratón con el fin de realizar imágenes fotónicas in situ.Esto implica la extirpación de los ganglios linfáticos inguinales, los ganglios linfáticos axilares y los ganglios linfáticos cervicales. Los seis ganglios linfáticos periféricos que son de fácil acceso en un ratón Para obtener células fluorescentes en los ganglios linfáticos de nuestros ratones. Para realizar imágenes mediante microscopía de dos fotones, primero debemos realizar la transferencia adoptiva de células marcadas con fluorescencia.Entonces, para este experimento, voy a mostrarles primero la transferencia adoptiva. Aquí tenemos nuestra jeringa de insulina de calibre 28. Voy a cargarla con algunas células o células.Primero quiero destapar la jeringa para que se desplace fácilmente. Voy a cargar cuidadosamente las células. Haré todo lo posible por no tocar las paredes del tubo con la jeringa de insulina, ya que esto embotaría la jeringa y dificultaría la inyección en la vena de la cola del ratón.Si hay burbujas de aire, debe sacudirlas para eliminarlas, de modo que ya no interfieran. Tápelas para quitarlas de en medio aquí. Así está mejor.Ahora estamos listos para inyectar estas células en la vena de la cola. Bien, aquí tenemos nuestro ratón C 57 black six. Vamos a introducirlo lentamente y con suavidad en el inyector de la vena de la cola.A muchos ratones no les gusta esto, pero evita que salten cuando se realiza la inyección real y se lastimen más, o que usted pueda sufrir una punción con la aguja. Por lo tanto, simplemente asegure lentamente al ratón en el interior. Ahora busque la vena de la cola a lo largo de los lados de la cola del ratón.Entonces, una arteria grande discurre a lo largo de la parte superior. Y a ambos lados de la cola del ratón, hay dos venas largas y bien definidas que van hasta la punta.Así que toma la aguja y comienza cerca de la base de la cola, buscando una vena. Justo ahí puedo ver que hay una vena. Voy a humedecerla un poco con etanol, lo que puede hacer que se vea un poco más clara.Vale, ahora vamos a inyectar en la vena de la cola y es importante mantener el bisel de la aguja hacia arriba, es decir, con el extremo abierto de la aguja orientado hacia arriba. Y moverla casi paralela a la cola.No desea introducir la aguja en un ángulo porque las venas están justo en la superficie. Solo desea deslizar la aguja en la vena de la cola muy lentamente. Y al hacerlo, con un poco más de experiencia, debería poder sentir cómo entra.Pero las primeras veces que quiera empujar el líquido, observe si hay alguna resistencia. Si no hay resistencia, está en la vena de la cola y puede realizar una inyección rápida y sencilla, como la que acabo de hacer. Luego puede retirar lentamente la aguja.Otra confirmación de que está dentro de la vena es que observará una pequeña gota de sangre proveniente del flujo de retorno. Así, ver un buen flujo de retorno de sangre saliendo un poco desde el sitio de inyección confirmará que definitivamente introdujo la aguja en la vena de la cola. Además, el ratón debería dejar de sangrar poco después de la inyección.Vale, aquí tenemos nuestro ratón negro seis. Vamos a extraer los ganglios linfáticos del ratón de las regiones inguinales, que están aquí, aquí debajo de la axila, donde se localizan los ganglios axilares, y en el otro lado aquí. Luego, los ganglios cervicales superficiales, que se encuentran aquí arriba en la garganta, allí y allá, uno a cada lado.Hola. Ahora estamos listos para diseccionar nuestro ratón. Voy a comenzar fijando el ratón sobre la tabla, aquí en la mesa de disección. Simplemente adelante y fije las patas. Sí.Debe asegurarse de que la sujeción con alfileres sea segura. Esto nos permitirá exponer mejor los ganglios linfáticos periféricos. Por lo tanto, normalmente sujeto con alfileres las cuatro patas.No me preocupo por la cola. A algunas personas les gusta sujetar también la cola. Y luego, para evitar que el pelo se introduzca en la zona donde estamos diseccionando y se extienda sobre nuestros ganglios linfáticos y nuestros instrumentos, rociamos al ratón con etanol al 70 %.Y ahora que el ratón está anestesiado con etanol, voy a realizar una incisión en la línea media. Para ello, separo el pelaje del cuerpo. Como pueden ver, puedo levantar la piel y formar una pequeña tienda.Y eso le impedirá cortar el peritoneo, lo cual no desea hacer en este caso. Bien, así que voy a comenzar con mi incisión media aquí arriba. Realizo un corte pequeño y me aseguro de no estar penetrando el peritoneo.Puede observarse el peritoneo debajo. Deslizo la tijera por debajo del corte y trabajo lentamente separando la piel del peritoneo, realizando pequeños cortes mientras avanzo, ya que vamos a extraer los ganglios linfáticos cervicales. Voy a cortar hasta la línea de la mandíbula del ratón con mucha precaución y lentamente, asegurándome de no dañar ningún vaso sanguíneo importante.Luego, dado que estamos tomando los ganglios linfáticos inguinales, que se encuentran en la porción inferior del colgajo de piel, voy a realizar una incisión media hasta aproximadamente la cola, hasta la base de la cola. Así quedó. Hay una incisión media que nos servirá.Ahora voy a separar la piel del peritoneo. Voy a hacer esto suavemente con pinzas, separando la piel del peritoneo a medida que avanzo. Y estoy exponiendo el primer ganglio linfático que vamos a diseccionar.Este es el ganglio linfático inguinal aquí abajo en el colgajo cutáneo inferior. Ahora que he separado un colgajo de piel del cuerpo principal del ratón, voy a fijarlo para exponer el ganglio linfático inguinal. Así queda mejor expuesto el ganglio linfático inguinal, lo que nos permitirá diseccionarlo de manera limpia.Aquí tenemos el ganglio linfático inguinal expuesto tras fijarlo. Normalmente se encuentra en el colgajo de piel, justo por encima de la pata. Y se puede localizar observando la bifurcación en forma de Y de los vasos sanguíneos que corren por encima de él.Y ahí está. Está alojado junto con un poco de grasa y los vasos sanguíneos que corren por encima. Muy bien, ahora voy a extraer el nódulo linfático inguinal.Deslizo mis pinzas a lo largo de ambos lados del ganglio linfático para separarlo de la grasa. No queremos ninguna grasa. Con nuestra imagenología de dos fotones, esto obstaculizaría la penetración del láser en el tejido.Veamos. Es importante separar toda la grasa del ganglio linfático, así como mantener intacta la corteza del ganglio linfático. Muy bien, así está bien.Aquí tenemos nuestro ganglio linfático de hiena. Voy a colocarlo en nuestro medio, y una buena forma de saber si se ha eliminado toda la grasa es observar si el ganglio linfático se hunde. Una vez que lo coloques en el medio, se irá directamente al fondo.Si hay grasa, flotará. Muy bien, ahora voy a extraer el ganglio linfático auxiliar. Se encuentra en la axila del ratón, justo junto a un vaso sanguíneo importante.Así que a veces puede ser complicado porque habrá mucho sangrado que oscurecerá el nódulo. Pero les mostraré lo que hago y esperemos que esta vez no haya sangrado. Primero de todo, libero la solapa de piel y luego libero efectivamente esta parte del antebrazo junto al nódulo que deseo extraer.Esto me permite separar la piel con mayor destreza usando los dedos, pero sujetando este músculo que recorre la axila, y con un leve tirón debería salir un ganglio axilar. Y ahora mismo voy a buscarlo. Y ahí está.Está justo allí en la axila, a lo largo de un vaso sanguíneo importante. Ahora voy a diseccionar el ganglio axilar y puedes volver a sujetar la piel con alfileres o sostenerla con los dedos, según lo que te resulte más cómodo. Pero prefiero trabajar con mucho cuidado en esta zona.Hay muy poca grasa alrededor de este ganglio linfático, lo que lo hace adecuado para la obtención de imágenes, pero se encuentra junto a un vaso sanguíneo importante, por lo que se puede perder fácilmente si no se tiene cuidado. Para el ganglio axilar, estoy sujetando el tejido conectivo que lo rodea y separándolo lentamente de los vasos sanguíneos. Bien, y listo.Aquí está nuestro ganglio axilar. Está justo ahí. Es un ganglio linfático largo y aplanado.Y estoy sujetando un poco del tejido conectivo que queda en el lateral del ganglio para no dañar el ganglio propiamente dicho. Vamos a realizar la imagen para mantener los ganglios linfáticos hidratados. Antes de realizar nuestra imagen en el instituto, los colocamos en medio independiente de CO2 en cámaras individuales para poder llevar un seguimiento de los ganglios linfáticos inguinales, axilares y cervicales.La forma de saber si ha realizado una buena preparación del ganglio linfático es si este se hunde hasta el fondo después de diseccionarlo. Eso indica que hay muy poca grasa en el ganglio linfático. Bien, ahora voy a extraer el ganglio linfático cervical, el cervical superficial.Y hago esto, comienzo volviendo a fijar desde donde extraje el ganglio axilar, exponiendo un poco mejor el tejido cervical. Y los ganglios linfáticos cervicales están cerca de los músculos de la mandíbula del ratón, exactamente a lo largo del costado.Son los mismos ganglios linfáticos que se pueden palpar cuando uno está enfermo. Son los que aquí palpará su médico si tiene un resfriado común. Para hacer esto, suelo introducir mi dedo por debajo del tejido para tirar de él ligeramente hacia adelante mientras deslizo la pinza a lo largo del borde.Debería tener un ganglio linfático que sobresalga. Ah, ahí está. Está allí arriba en el tejido.Aquí está. Entonces, hay un ganglio cervical superficial. Debe tener cuidado de no tomar las glándulas salivales.No encontrará ninguna célula T en sus glándulas salivales. Y en estos ganglios linfáticos particulares hay células T positivas para CD4 marcadas con CFSC. Así que les mostraremos algunos videos de esas células T moviéndose dentro del tejido.Vale, ahora voy a pegar el ganglio linfático a una laminilla de plástico irrompible para poder fijarlo al fondo de la platina de imagenología insitu. De este modo evitaremos el movimiento del tejido o la deriva tisular mientras realizamos la imagenología de las células T. Aquí tengo mis laminillas de plástico irrompibles.Lo primero que voy a hacer es cortar uno de ellos al tamaño adecuado para nuestro ganglio linfático. Así que tomo mis tijeras y corto un cuadradito aquí. Bien, ahora voy a aplicar pegamento sobre él.Es un poco de pegamento. Extiéndalo alrededor del trozo de portaobjetos que hemos cortado. Luego voy a tomar una toallita Kim y absorber un poco del pegamento.Este es un pegamento que cubrirá el ganglio. Solo queremos una capa muy delgada para que no obstruya la imagen. Luego voy a sacar un ganglio linfático de la solución.Así que comenzaremos con nuestro primer ganglio linfático aquí, procedente del medio. Desea ser cuidadoso con esto. No desea dañar la corteza del ganglio.Voy a sujetar solo la esquina y pegarla al portaobjetos tocando suavemente la esquina del ganglio linfático sobre el portaobjetos primero, y luego deslizando el ganglio linfático a lo largo del portaobjetos, asegurándolo firmemente. Para ello, utilicé un pequeño resto de grasa que quedaba en el borde del ganglio linfático. De este modo, en realidad no estoy alterando la corteza del ganglio.Luego tomo el ganglio linfático y, para curar el pegamento, voy a sumergirlo en el mismo pozo del que lo saqué. Así que voy a darlo vuelta y sumergirlo suavemente en el medio, llevando todo el pegamento. Retiro un poco del pegamento exo que se curó con él.Ahí lo tenemos. Ahora tenemos un ganglio linfático preparado para imágenes de dos fotones. Así es como se preparan los ganglios linfáticos para la obtención de imágenes de dos fotones in situ.Ahora vamos a llevarlos a nuestro microscopio, configurarlo y obtener excelentes imágenes de las células T que transferimos adoptivamente. Aquí tenemos células T marcadas con CFSE moviéndose dentro de un ganglio linfático inguinal. Este video está acelerado aproximadamente 500 veces y se puede observar que las células son altamente móviles.Se amplían aproximadamente 20 x con nuestro objetivo de inmersión en agua de 20 x. Este es solo un ejemplo del movimiento de los linfocitos T. No hemos realizado ninguna tinción de las células circundantes.Normalmente, en experimentos más avanzados de dos fotones, se pueden tener células dendríticas teñidas, células B teñidas y células T interactuando con células NK teñidas. Se puede marcar prácticamente cualquier tipo celular que se espere observar dentro del ganglio linfático y proceder a obtener imágenes del mismo. Eso es todo respecto a nuestro protocolo de imágenes de ganglios linfáticos.

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Investigación

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El manuscrito demuestra un método innovador para el estudio in vivo de la contractilidad de los vasos linfáticos cervicales y el flujo linfático en ratones, para evaluar diversas funciones fisiológicas de los vasos linfáticos cervicales (cLVs) y las estrategias terapéuticas para la modulación de los mecanismos reguladores linfáticos del drenaje y la eliminación cerebral.

Montaje reproducible para la imagen in vivo de dos fotones de la contractilidad de los vasos linfáticos cervicales y el flujo linfático en ratones

Aquí se presenta un protocolo para evaluar los vasos linfáticos meníngeos (MLVs) de ratón, que desempeñan un papel importante en múltiples enfermedades neurológicas. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método integrado que permita tanto la evaluación funcional del drenaje de trazadores como la caracterización morfológica detallada de la red de MLVs dorsales.

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