Name: Etiquetado linaje de células de pez cebra con láser Uncagable fluoresceína Dextran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprende a etiquetar linajes celulares en embriones de pez cebra mediante descarga fotolítica de fluoresceína enjaulada con láser UV. Este método permite rastrear el destino de células específicas mediante microscopía de inmunofluorescencia.

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Nos gustaría dar las gracias a Dan Carlin para ayudar en la toma de fluoresceína enjaulado. Además nos gustaría agradecer a las fuentes de financiación: Universidad de Vanderbilt Programa Escuela de Medicina de Subvención de Desarrollo de Capacitación de Biología de JAC, y NIH HD054534to JTG.

1. Síntesis de la jaula con fluoresceína Dextran <ol><li> Mida 3,5 a 4 mg de aminodextrano y añadir en el tubo de color Invitrogen suministrado con 1 mg de CMNB-jaula SE fluoresceína. En nuestras manos esta relación da una carga promedio de ~ 2,5 moléculas de colorante por dextrano. </li><li> Añadir 500 l de 0,1 M Na 2 B 4 O 7 buffer (borato de sodio) en el tubo. </li><li> El tapón y mezclar por 30 segundos para disolver el aminodextrano fluoresceína y enjaulado. </li><li> Vamos a reaccionar durante la noche en un mezclador vórtex. </li><li> Desenrosque el cierre inferior de una columna de centrifugación Zeba y aflojar la tapa. Marca un punto en la columna con un rotulador. Colocar la columna en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Centrifugar a 1000 xg durante 2 minutos con el punto frente al centro del rotor. Use la columna inmediatamente después de la compactación. </li><li> Colocar la columna compacta en una nueva de 15 ml tubo cónico. </li><li> Piscina mezcla de reacción y traslado al centro de la cama columna de resina compacta. Reemplace la tapa. </li><li> Centrifugar a 1000 xg durante 2 minutos con el punto frente al centro del rotor. Después de la vuelta, el eluyente y la parte superior de la columna será más o menos el mismo tono de color amarillo. </li><li> Transferir el eluyente amarillo (~ 350 l) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Liofilizar hasta sequedad en un speedvac. Cubrir el speedvac con papel de aluminio. </li><li> Vuelva a suspender el resultado ~ 3.2 mg de espuma de color amarillo pálido en el agua a una concentración final de 1% w / v. </li><li> Almacenar esta solución a -20 ° C en papel de aluminio cubierto de tubos. Es una buena idea alícuota de la solución de dextrano para prevenir la repetición de congelación-descongelación. </li></ol> 2. La inyección de fluoresceína Caged Dextran en embriones de pez cebra <ol><li> Diluir 1% w / v stock de jaulas 01:05 fluoresceína dextrano o 1:10 en KCl 0,2 M. </li><li> Inyectar 0,5 - 1.0nL de la solución de fluoresceína enjaulados en la yema de un embrión de células etapa con una presión de inyección. Una vez inyectado, garras de embriones debe ser mantenido en la oscuridad a 28,5 ° C para reducir no específicos uncaging. </li><li> Eliminar manualmente coriones a partir de embriones. </li><li> Anestesiar a los embriones en el 4% tricaína. </li><li> Los embriones se montará en el 0,8% de agarosa en 35mmx10mm placa de Petri, luego se cubre con agua de huevo. </li><li> Equilibre agarosa derretida en el 50 del bloque de calor ° C durante al menos 15 minutos. </li><li> Con una pipeta de vidrio, elaboración de un embrión en una cantidad mínima de agua y la liberan en la agarosa. Nota: Es importante que se enfríe el tubo de agarosa en la mano durante aproximadamente 30 segundos antes de colocar el embrión en el tubo para evitar matar al embrión. </li><li> Pipeta el embrión de la trompa, junto con aproximadamente 50μL de agarosa y expulsar el contenido en el centro de la placa de Petri. </li><li> Orientar rápidamente el embrión utilizando un hilo de plástico con las células que se uncaged hacia arriba. Nota: La agarosa se ​​enfrían rápidamente para ser precipitada con la orientación del embrión. Los embriones se pueden dañar si se manipula después de la agarosa se vuelve rígido. </li><li> Deje que la agarosa para solidificar completamente (esto tarda unos minutos) y llenar el recipiente con dos tercios del agua de huevo contiene un 4% y 0,003% tricaína PTU. </li></ol> 3. Laser uncaging de fluoresceína Dextran <ol><li> El microscopio usado para uncaging debe tener un objetivo de inmersión en agua 40 veces. </li><li> Utilizamos un Fotónica Instrumentos láser con la célula nm tinte 365 y el 70% / 30% se reparte espejo dicroico. </li><li> Antes de uncaging, el láser se debe hacer parfocal con el objetivo y atenuada a la alimentación adecuada. </li><li> Para enfocar el láser, colocar una lámina de vidrio reflejado en el objetivo y el enfoque del objetivo hasta que los arañazos en la diapositiva son visibles. </li><li> Ajuste del atenuador de láser hasta que el láser puede producir un rasguño claramente visible en el espejo con un solo pulso. </li><li> Ajustar el enfoque objetivo hacia arriba y abajo. Si el láser puede producir un cero cuando el objetivo está fuera de foco, ajuste el enfoque de láser de ¼ de vuelta hacia arriba o hacia abajo. Repita hasta que el láser puede rayar el espejo sólo cuando el objetivo se centra. </li><li> Lugar montado embrión en el objetivo y se centran en el área que se uncaged. </li><li> Para desenjaular, se centran en una célula de interés y el pulso es 10-20 veces menos 2-3 Hz. </li><li> Después de uncaging, sin el embrión mediante el peeling de agarosa de distancia con unas pinzas y poniéndolas en agua que contienen huevo PTU 0,003%. Deje que se desarrollan los embriones en una caja opaca a la luz hasta que se fija. </li></ol> 4. Anticuerpo etiquetado y detección de Uncaged Dextran con fluoresceína <ol><li> Fix embriones en Ab fijador (4% de paraformaldehído, 0,3 CaCl 2, 8% de sacarosa, fosfato 1X buffer de pH de solución salina, 7.3) de dos a cuatro horas a temperatura ambiente (RT) o durante la noche (O / N) a 4 ° C. Mantener los embriones en una caja de luz o un tubo estrecho envueltas en papel aluminio para todas las medidas de etiquetado. </li><li> Retire el fijador y reemplazar con el 100% de MeOH, dejar durante 10 minutos a temperatura ambiente, eliminar MeOH y reemce con MeOH frescas 100%. </li><li> Tienda en MeOH a -20 ° C durante al menos 30 minutos. Nota: Es posible almacenar en MeOH para un máximo de dos semanas antes de epítopos comienzan a degradarse. </li><li> Rehidratar embriones con 5 lavados minutos a temperatura ambiente de 75% de fosfato MeOH/1X solución salina tamponada con Tween 20 al 0,1% (1X PBSTw), entonces 1XPBTw 50% MeOH/50%, entonces el 25% MeOH/75% 1X PBSTw. </li><li> Lavar tres veces durante 5 minutos en 1XPBSTw. </li><li> Si los embriones son&gt; 24 horas de vida, permiabilize embriones con 10 mg / ml de proteinasa K en 1XPBSTw. Permiabilization tiempo depende de la etapa. Cinco minutos en proteinasa K es suficiente si los embriones tienen entre 24 y 48 horas posteriores a la fecundación (HPF). Más tiempo puede ser necesario si las larvas de la tercera edad. Volver a fijar en Ab fijador durante 20 minutos a temperatura ambiente </li><li> Lavar cinco veces durante 5 minutos en 1XPBSTw a temperatura ambiente. </li><li> Incubar en la solución de bloqueo (1XPBS, 0,1% Triton X100, el 10% suero de oveja, 10% de albúmina de suero bovino, 1% de dimetilsulfóxido) durante 1-2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Diluir anticuerpos primarios (anti-fluoresceína además de anticuerpos contra el tipo de célula-marcadores específicos) en solución de bloqueo. </li><li> Embriones se incuban O / N a 4 ° C en una solución que contiene anticuerpos primarios. </li><li> Lavar cuatro veces durante 20 minutos en solución salina tamponada con 1XPhosphate Triton x100 0,1% (PBSTx) a temperatura ambiente. </li><li> Diluir anticuerpos marcados con fluorescencia secundaria (por lo general 1:300) en solución de bloqueo. </li><li> Incubar O / N a 4 ° C en una solución que contiene anticuerpos secundarios. </li><li> Lavar cuatro veces durante 20 minutos en 1XPBSTx a temperatura ambiente. </li><li> Embriones claro en 1XPBS 50% glycerol/50% por lo menos dos horas a temperatura ambiente, luego retire el glicerol / PBS mezcla y se añaden 100% de glicerol y se deja reposar O / N a 4 ° C. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Después de inmunomarcación, debe haber una zona enriquecida de la tinción de las células que se uncaged (Figure.1). No es raro ver una señal relativamente alta proporción de ruido en&gt; el pez cebra de 48 horas de edad, debido a uncaging espontánea de la fluoresceína. <img src="/files/ftp_upload/2672/2672fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Etiquetado linaje de peces cebra complejo pineal. A las 24 HPF, una porción de la glándula pineal esbozo anterior, indica foxd3:. Expresión GFP, se uncaged utilizando pulsos de láser UV A) Por 48hpf, un grupo en el lado izquierdo de células llamadas parapineal (círculo rojo) ha surgido de la uncaged dominio (círculo blanco). B) Uncaged señal de fluoresceína se enriquece en el parapineal (círculo rojo) y el órgano pineal (círculo blanco).

<ol><li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li>
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<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+%28caged%29+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo%2C+Lytechinus+variegatus%2C+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li>
</ol>

Como se ha descrito, este protocolo ofrece un método de etiquetado linaje relativamente rápido en el pez cebra que se basa en las técnicas de uso de la microinyección, la microscopía e inmunofluorescencia. Hemos encontrado que el láser uncaging ser la manera más eficiente y rentable para desenjaular fluoresceína de forma localizada. Este método podría ser utilizado para etiquetar linaje con criterios de valoración experimental tan tarde como 4 dpf. Sin embargo, como se dividen las células, la concentración de jaula con ...

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Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<table><tbody><tr><td>CMNB-fluoresceína SE protegida</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>Aminodextrana, 10 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>Columnas desalificadoras centrífugas Zeba</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo de cabra antifluoresceína</td><td>Invitrogen</td><td>A11095</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo donkey anti-cabra Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21082</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri de 35 mm × 10 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>microscopio compuesto vertical con objetivo de inmersión en agua de 40x</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM6000B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema manual de iluminación láser MicroPoint</td><td>Photonic Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feniltiourea (PTU)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Roche Group</td><td>03115836991</td><td></td></tr><tr><td>Hilo plástico</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>mezclador vortex</td><td>VWR international</td><td>Vortex Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>inyector de presión</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr></tbody></table>

etiquetado linaje de células de pez cebra con láser uncagable fluoresceína dextran

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Un problema central en la biología del desarrollo es deducir el origen de la miríada de tipos de células presentes en los vertebrados que se presenten a partir de precursores indiferenciados. Los investigadores han utilizado diversos mecanismos de etiquetado linaje, como DII etiquetado y una presión de inyección de enzimas trazabilidad de 2 a determinar el destino celular en etapas posteriores del desarrollo de los sistemas modelo. Los mapas de destino por primera vez en el pez cebra (Danio rerio) se reunieron por inyección iontoforética de los tintes fluorescentes, tales como rodamina dextrano, en células individuales en regiones discretas del embrión y el seguimiento de la suerte de la celda marcada con el tiempo 5.3. Si bien es efectivo, estos métodos son técnicamente exigentes y requieren equipo especializado no se encuentran comúnmente en los laboratorios de pez cebra. Recientemente, photoconvertable proteínas fluorescentes, como el Eos y Kaede, que irreversiblemente cambia de verde a rojo cuando la fluorescencia expuestos a la luz ultravioleta, estamos viendo un mayor uso en el pez cebra 6-8. La claridad óptica del embrión de pez cebra y la relativa facilidad de la transgénesis ha hecho estas herramientas especialmente atractiva para el etiquetado de linaje y de observar la migración de las células in vivo 7. A pesar de su utilidad, estas proteínas tienen algunas desventajas en comparación con el tinte mediada por los métodos de etiquetado linaje. La más crucial es la dificultad que hemos encontrado en la obtención de 3-D de alta resolución durante fotoconversión de estas proteínas. En este sentido, tal vez la mejor combinación de resolución y facilidad de uso para el etiquetado de linaje en el pez cebra hace uso de jaulas con fluoresceína dextrano, un tinte fluorescente que se une a un grupo de enfriamiento que enmascara su fluorescencia 9. El medio de contraste puede ser &quot;Uncaged&quot; (lanzado desde el grupo de extinción) dentro de una célula específica mediante la luz ultravioleta de una lámpara de láser o de mercurio, lo que permite la visualización de la fluorescencia o la inmunodetección. A diferencia de los métodos de iontoforesis, fluoresceína enjaulados puede ser inyectado con aparatos de inyección estándar y uncaged con un microscopio de epifluorescencia equipado con un orificio 10. Además, los anticuerpos contra la fluoresceína detectar sólo la forma uncaged, y el epítopo sobrevive la fijación y 11. Por último, la fluoresceína enjaulados puede ser activado con muy alta resolución 3-D, sobre todo si la microscopia de dos fotones se emplea 12,13. Este protocolo describe un método de etiquetado linaje de fluoresceína enjaulados y uncaging láser. Subsequenctly, uncaged fluoresceína se detecta de forma simultánea con otros epítopos, como las buenas prácticas agrarias, mediante el etiquetado con anticuerpos.

Este protocolo esboza una manera de etiquetar y rastrear el destino de los pequeños grupos de células de embriones de pez cebra empleando la radiación UV-uncaging de fluoresceína enjaulado, seguido de monte se inmunomarcaje para amplificar la señal de la fluoresceína uncaged.

Etiquetado linaje de células de pez cebra con láser Uncagable fluoresceína Dextran

Un problema central en la biología del desarrollo es deducir el origen de los innumerables tipos celulares presentes en los vertebrados a medida que surgen a partir de células indiferenciadas...

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar linajes celulares en un embrión de pez cebra. Esto se logra primero sintetizando fluoresceína encageada e inyectándola en los embriones de pez cebra. Luego, los embriones se montan en agarosa para que las células que se van a etiquetar queden accesibles.A continuación, se utiliza un láser UV para activar la fluoresceína enjaulada en células seleccionadas del embrión. Finalmente, los embriones se recolectan una vez que han desarrollado hasta la etapa deseada y se detectan las células marcadas en relación con marcadores de linajes particulares. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el destino de células seleccionadas en los embriones mediante la desenjaulación fotoinducida y la microscopía inmunofluorescente.La principal ventaja de esta técnica frente a las técnicas existentes, como la conversión fotónica de Cade, es que la inmunofluorescencia multicolor puede detectar fluoresceína desencapsulada además de otros anticuerpos específicos de marcadores celulares. Para inyectar dextrano de fluoresceína encapsulada en embriones de pez cebra, primero síntesiselo y prepare una solución al 1% peso por volumen. Al

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Investigación

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Biology

Biología

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

La clave para entender los procesos morfogenéticos que forma el embrión temprano es la capacidad de las células de la imagen en alta resolución. Se describe aquí una técnica para el etiquetado de las células individuales o pequeños grupos de células en embriones de pez cebra con toda la membrana dirigidos proteína verde fluorescente.

Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

Las células que mueren son expulsados ​​de los tejidos epiteliales por la contracción concertada de las células vecinas sin interrumpir la función de barrera. La claridad óptica del pez cebra en desarrollo ofrece un excelente sistema para visualizar la extrusión en la vida epitelios. A continuación se describen los métodos para inducir y extrusión de la imagen en la epidermis larvas de pez cebra a una resolución de celulares.

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

Se describe un método para photoactivate células individuales que contienen una proteína fluorescente enjaulado con la absorción de dos fotones de un Ti: Zafiro de femtosegundos oscilador láser. Para asignar el destino de la célula fotoactivado, inmunohistoquímica se usa. Esta técnica se puede aplicar a cualquier tipo de célula.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

Función de los lípidos-Spacer (FSL) construye permiten las características superficiales de las células vivas y los viriones que ser modificado sin la pérdida de vitalidad. El método requiere un contacto sólo una solución simple de construir una célula con FSL / virión y la incorporación de la superficie se produce espontánea y estable.

FSL Construye: Un método simple para la modificación de células / virión superficies con una serie de marcadores biológicos sin afectar su viabilidad

El desarrollo de pez cebra se puede seguir durante días con la microscopía de lámina de luz cuando los embriones están inmersos en tubos de polímero ópticamente claros con agarosa de baja concentración.

Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra

En este artículo describimos los principios para diseñar y realizar un experimento de trazado de linaje multicolor utilizando ratones R26R-Confetti. Proporcionamos un protocolo específico para el seguimiento de las células epiteliales de la córnea que puede ser modificado para otros tejidos de interés.

Un método para Lineage Tracing de células corneales Uso de Multi-color de los ratones reportero fluorescente

Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Las manipulaciones dirigidas para causar estrés dirigido o muerte en células individuales han sido relativamente difíciles de lograr. Aquí, se describe un enfoque de ablación de resolución de una sola célula para estresar selectivamente y matar células individuales en cultivos celulares y animales vivos basado en un láser UV confocal estándar.

Desencadenar el estrés celular y la muerte Uso convencional UV láser confocal Microscopía

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

Aquí, presentamos un protocolo para marcar proteínas con una etiqueta de proteína de fluorescencia en larvas de pez cebra, un sistema in vivo recientemente desarrollado y modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baja abundancia en pez cebra.

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

Aprende a etiquetar linajes celulares en embriones de pez cebra mediante descarga fotolítica de fluoresceína enjaulada con láser UV. Este método permite rastrear el destino de células específicas mediante microscopía de inmunofluorescencia.

Etiquetado linaje de células de pez cebra con láser Uncagable fluoresceína Dextran

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