La inducción de anergia aloantígenos específicos en las células mononucleares de sangre periférica mediante estimulación aloantígeno con bloqueo de señales co-estimuladoras

El objetivo general del siguiente experimento consiste en activar linfocitos T donantes alorreactivos frente al receptor mediante una estimulación ex vivo con antígenos alo del receptor en presencia de anticuerpos que bloquean la coestimulación de los linfocitos T por las células presentadoras de antígenos a través de su receptor CD28. Esto se logra primero aislado PBMC de dos donantes sanos diferentes. A continuación, se establece un cultivo colectivo de activación alo mediante la incubación de poblaciones de PBMC no coincidentes en HLA en presencia de anticuerpos monoclonales frente a los ligandos B7.1 y B7.2 para bloquear la estimulación de CD28.

Luego, la eficacia de la alo-activación se mide mediante reacciones linfocitarias mixtas primarias y secundarias, o MLR. Finalmente, la especificidad alo de la alo-activación se determina analizando las respuestas frente a terceros y frente al CMV. Se obtienen resultados que muestran que los linfocitos T del donante quedan hiporresponsivos ante una posterior estimulación alógena, pero que los linfocitos T del donante no aloreactivos permanecen intactos y funcionales.

Hemos empleado con éxito esta estrategia en ensayos clínicos piloto previos y en curso de infusión de linfocitos T de donante aloenergizados durante y después del trasplante de células madre con incompatibilidad de HLA, y hemos observado una mejor reconstrucción inmunitaria, menos infecciones y una enfermedad de injerto contra huésped aguda y crónica menos grave en comparación con los controles históricos de receptores de trasplantes con incompatibilidad de HLA no manipulados. Una ventaja importante de la estrategia de aloanodización es que se minimizan los efectos fuera de blanco, ya que la técnica no reduce las respuestas de linfocitos T específicas contra patógenos ni contra antígenos asociados a tumores, ni elimina las células T reguladoras CD4 del reservorio de linfocitos T del donante, lo que demuestra que el procedimiento será realizado por Christine Vin, científica titular en nuestro laboratorio. El primer paso consiste en extraer sangre de dos donantes voluntarios sanos.

Las células de un donante servirán como respuesta y las células de otro donante servirán como estímulo. A continuación, aísle los PBMC de la sangre mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando fial pac. Mantenga una pequeña cantidad de células con trian blue y cuente los PBMC viables utilizando el hemo citómetro reus.

Coloque PBMC procedentes de cada donante en 10 mililitros de medio de cultivo completo, a una concentración de 1 millón de células viables por mililitro, en tubos cónicos separados de 15 mililitros. Designe un tubo de PBMC de donante como estimulador y el otro como respondedor para establecer la co-cultura masiva de activación aloinmunológica.

Añada 100 microgramos de anticuerpos anti B 7.1 y anti B 7.2 al tubo de 15 mililitros designado como estimulador. Agite suavemente el tubo e incube durante 30 minutos; tras el período de incubación, irradie los PBMC estimuladores y añádalos a un matraz de cultivo celular T 25 de 50 centímetros cúbicos con tapa permeable al gas.

Etiquete el matraz con el cultivo masivo de células alógenas. A continuación, añada 10 mililitros de PBMC respondedoras del otro donante a una concentración de 1 millón por mililitro en medio completo al matraz. Añada además 100 microgramos de cada uno de los anticuerpos Antib 7.1 y Antib 7.2 al matraz y mezcle suavemente antes de colocar el matraz en posición vertical en un incubador durante 72 horas.

A continuación, irradie otros 10 millones de PBMC estimuladores para un cultivo en co-cultivo de control masivo sin anticuerpos bloqueantes y luego añádalos a un frasco de cultivo celular de 25 cm³ (50 centímetros cúbicos). Etiquete el frasco como cultivo en co-cultivo de control masivo. Añada 10 mililitros de los mismos PBMC respondedores utilizados para el cultivo en co-cultivo aloestimulante masivo, a una concentración de 1 millón por mililitro en medio completo, al frasco y mezcle suavemente antes de colocar el frasco en posición vertical en un incubador durante 72 horas.

El siguiente paso consiste en medir la función del grupo de linfocitos T donadores activados por aloantígenos el mismo día que las culturas colectivas de coal. Rotule una placa de 96 pocillos con fondo en U para cada uno de los tres puntos temporales que se van a medir. Luego, vierta cinco mililitros de cada una de las culturas colectivas de control y de activación por aloantígenos en tubos de 15 mililitros.

A continuación, pipete 200 microlitros de suspensión celular de cada tubo en pocillos por triplicado en cada una de las tres placas. Etiquete estos pocillos como sin bloqueo coestimulador o sin BCC para las células procedentes de los cultivos fríos de control masivo y BCC para las células procedentes de los cultivos fríos masivos aloestimulantes. Luego añada 200 microlitros de medio completo a seis pocillos en cada placa como controles negativos.

Finalmente, añada 200 microlitros de PBS a todos los pocillos vacíos para reducir la evaporación y coloque las placas en el incubador 72 horas después de establecer las culturas colectivas. Etiquete una placa UBO 96, pocillo, MLR secundario para cada uno de los tres puntos temporales que se van a medir. Para preparar las células respondedoras para el MLR secundario, transfiera cinco mililitros de cada una de las culturas colectivas control y aloestimulantes a tubos de 15 mililitros y centrifugue los tubos durante cinco a 10 minutos a 2000 RPM a temperatura ambiente. Luego lave las células dos veces más aspirando cuidadosamente los sobrenadantes, resuspendiendo los pellets, añadiendo 10 mililitros de medio completo a cada tubo y centrifugando nuevamente las células después del segundo lavado.

Re-suspenda las células en un mililitro de medio completo. Utilice la tinción con azul de tripano para enumerar las células viables y ajuste la concentración celular a un millón de células respondedoras viables por mililitro. Pipete 100 microlitros de la suspensión celular de cada tubo en pozos triplicados de cada placa.

Etiquete estos pozos primero como estimulación con aleación de primera parte o FP. Luego, pipetee 100 microlitros de suspensión celular de cada tubo hacia otros tres pozos en cada placa y etiquete estos pozos como estimulación CD3/28 de PBMC del mismo donante utilizado para proporcionar las células estimuladoras de PBMC de primera parte para el alo. Las culturas coestimuladas activadas y los controles se utilizan como células estimuladoras para el MLR secundario; suspenda 10 millones de PBMC del donante de primera parte a una concentración de 1 millón por mililitro y añada radiación.

100 microlitros de células estimuladoras irradiadas en los pozos etiquetados como fp de restimulación alógena en cada placa de MLR secundario. Para los controles positivos, añada un microlitro de anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 y 98 microlitros de medio completo en los pozos etiquetados como estimulación CD3-28 en cada placa de MLR secundario. Además, añada 200 microlitros de medio completo en seis pozos vacíos de cada placa para utilizarlos como controles negativos y añada 200 microlitros de PBS a todos los pozos vacíos para reducir la evaporación.

Coloque las placas en el incubador. El siguiente paso consiste en medir la especificidad del proceso alo utilizando PBMC aisladas de un nuevo donante sano denominado donante de terceros, que se emplean para evaluar la especificidad del proceso alo en un MLR secundario. Suspenda los PBMC de terceros a una concentración de un millón de células por mililitro e irradie la etiqueta 3 96 mientras las placas secundarias de MLR continúan el día tres, cinco y siete.

Para preparar las células respondedoras para el MLR secundario destinado a medir la especificidad, transfiera cinco mililitros de cada uno de los cultivos colectivos de control y de estimulación aloinmunológica a tubos de 15 mililitros y centrifugue los tubos durante cinco a 10 minutos a 2000 RPM. Luego lave las células dos veces aspirando cuidadosamente los sobrenadantes, resuspendiendo los pellets, agregando 10 mililitros de medio completo a cada tubo y centrifugando nuevamente las células tras el segundo lavado. Re suspenda las células en un mililitro de medio completo.

Utilice la tinción con azul de tripano para contar las células y ajuste la concentración celular a 1 millón de células respondedoras viables por mililitro, luego pipetee 100 microlitros de suspensión celular de cada tubo en pocillos por triplicado en cada placa. Etiquete estos pocillos como TP o estimulación alógena de terceros. A continuación, agregue 100 microlitros de células estimuladoras de TP irradiadas a los pocillos etiquetados como estimulación alógena TP.

Para probar aún más la especificidad de las respuestas aloreactivas frente a patógenos, se miden las respuestas después de la estimulación de PBMC de donantes con respuestas proliferativas previamente establecidas frente al CMV. Etiquetar 3 placas de 96 pocillos para la M-L-R-C-M-V secundaria los días tres, cinco y siete, y transferir cinco mililitros de cada una de las culturas control masivas y de culturas de células estimuladas aloreactivamente a tubos de 15 mililitros. Luego, lavar, contar y resuspender las células a un millón por mililitro en medio completo. Pipetear 100 microlitros de la suspensión celular de cada tubo en tres pocillos de cada placa, y etiquetar estos pocillos como estimulación con CMV.

Luego, agregue 0,1 microlitros de lisado de CMV en 100 microlitros de medio completo a los pocillos etiquetados como estimulación con CMV. A continuación, agregue 200 microlitros de medio completo a seis pocillos en cada placa como controles negativos. Finalmente, agregue 200 microlitros de PBS a todos los pocillos vacíos para reducir la evaporación y coloque las placas en el incubador para medir la proliferación en MLR primario y secundario.

Añada un microcurio de timidina tritiada a los controles negativos y a los pocillos que contienen células, 16 horas antes de cosechar las placas. Recolecte la timidina en un tapete de filtro por cada placa utilizando un cosechador TomTec o un sistema de aire similar. Seque los tapetes de filtro durante una hora.

Luego colóquelos en bolsas de muestra individuales. Añada cinco mililitros de líquido de centelleo a cada una y séllelas. Mida la incorporación de tri timidina en las últimas 16 horas del experimento leyendo las membranas de filtro con un contador de centelleo Wallach Micro Beta, o equipo similar, utilizando PBMC estimuladores y respondedores con desajuste de HLA.

Puede observarse en esta figura que la presencia de bloqueo coestimulador en el MLR primario reduce la proliferación aloinmune media de los PBMC respondedores al día cinco a aproximadamente el 30 % de la observada en el MLR primario control en ausencia de bloqueo coestimulador. Esto equivale a una inhibición media de la proliferación aloinmune primaria de alrededor del 70 % al día cinco. Como se observa en esta figura.

Puede observarse en esta figura que en el MLR secundario, la proliferación alógena de primer partido de PBMC activadas alógenamente al día cinco es típicamente del 10 al 15 % de la observada con PBMC de control. Esto equivale a una inhibición media de la proliferación del 85 al 90 %, lo que demuestra que las PBMC activadas alógenamente son hiporresponsivas frente a estimuladores alógenos de primer partido. Como se observa en esta figura, una vez dominada, la preparación de cultivos colectivos masivos con células mononucleares de sangre periférica del donante activadas alógenamente puede realizarse en dos o tres horas.

El enfoque puede estandarizarse fácilmente para uso clínico con el fin de generar linfocitos T donantes con una reactividad aloinmune reducida, pero con inmunidad específica contra patógenos conservada. Dichas células pueden transferirse adoptivamente en el contexto del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas para mejorar la reconstrucción inmunitaria sin provocar una enfermedad del injerto contra el huésped excesiva. Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar rápidamente.

Esto ayuda a preservar la viabilidad de las células y evitar la activación no específica o la pérdida de células presentadoras de antígenos. Si se utilizan PBMC criopreservados como estimuladores o respondedores, debe emplearse un protocolo validado para la recuperación de células congeladas que proporcione rendimientos consistentemente altos de células viables. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aloinizar células mononucleares de sangre periférica de donante humano y cómo realizar ensayos para evaluar la eficacia y especificidad de este procedimiento; esta estrategia puede utilizarse para generar linfocitos T de donante humano con respuestas aloinmunes reducidas, que pueden emplearse clínicamente para mejorar la reconstitución inmune tras el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.