Placa Sólida basado en la restricción dietética Caenorhabditis elegans

El procedimiento realiza la restricción dietética en la placa abatida estándar en el mar para estudiar su efecto sobre la longevidad, la reproducción y el metabolismo. Esto se logra midiendo primero con precisión la concentración de las bacterias que se utilizarán como fuente de alimento. El segundo paso del procedimiento es diluir adecuadamente el cultivo de bacterias en concentraciones adecuadas.

A continuación, prepare placas SDR basadas con bacterias muertas. Por último, se establecieron experimentos de SDR con una población de gusanos sincronizada por edad. Los resultados de la producción de progenie y las mediciones de la esperanza de vida pueden mostrar un retraso y una reducción de la producción de la progenie, así como un aumento de la esperanza de vida media.

La principal ventaja de esta técnica sobre 60 métodos como Dian en medio AZA, es que todo el experimento se realizará en un juego sólido estándar basado en AGA que es utilizado por la mayoría de los laboratorios cálidos para experimentos de restricción dietética y ver la elegancia de establecer curvas de calibración separadas para cada cepa de bacteria utilizada como fuente de alimento. Elija una sola colonia de bacterias E. coli OP 50 de una veta fresca en agar lb e inocule tres mililitros de cultivo de caldo líquido lb en una coctelera a 37 grados Celsius durante la noche. Prepare la dilución doble en serie del cultivo durante la noche.

A continuación, mida la absorbencia de cada dilución a 600 nanómetros mediante espectrofotómetro por triplicado. Además, dute cada suspensión bacteriana, 1 millón de veces sembrar uniformemente 0,4 mililitros de suspensión bacteriana de cada dilución en una placa agrícola de 100 milímetros lb e incubar a 37 grados centígrados durante 18 a 24 horas. Cuente el número de colonias bacterianas cultivadas en cada placa para calcular las unidades formadoras de colonias por mililitro para cada muestra.

Ahora trace el OD 600 en función de la concentración bacteriana y realice un análisis de regresión lineal para establecer la relación entre los valores medidos del OD 600 y las concentraciones de bacterias OP 50. Para este método, se utiliza una concentración de bacterias de una por 10 a la 11ª UFC por mililitro en la condición de alimentación ad lido y una por 10 a la octava UFC por mililitro como la condición óptima de alimentación RD. Sin embargo, pueden ser necesarias de cuatro a seis concentraciones diferentes de bacterias para establecer una relación completa dependiente de la dosis.

Para los DEG y sus respuestas. Prepare un inóculo con una sola colonia de bacterias E. coli OP 50 en tres mililitros de caldo LB líquido, cultivado en un agitador a 37 grados Celsius durante seis a ocho horas. Transfiera el cultivo OP 50 a un nuevo matraz que contenga 500 mililitros de caldo LB y crezca durante la noche para que las bacterias alcancen la saturación si es necesario.

Prepare la dilución adecuada del cultivo OP 50 para la medición de la absorbencia a DO 600. Para determinar la concentración de bacterias, granule las bacterias por centrifugación a 1500 Gs durante 20 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las bacterias a una concentración de una vez 10 a de las 12 UFC por mililitro.

Ahora, prepare cultivos de bacterias de 10 mililitros en seis concentraciones diferentes, que van desde una vez 10 de la 12 hasta una vez 10 de la séptima UFC por pipeta de mililitro. Coloque dos mililitros de cultivo de bacterias en el centro de una placa de N GM solidificada de 60 milímetros. Evite tocar la superficie de la placa con la punta de la pipeta, ya que las muescas en la superficie permiten que los gusanos se introduzcan en los aires.

Coloque las placas en una incubadora a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, aplicar 10 microlitros de 100 miligramos por mililitro de soína carbónica y 10 microlitros de 50 miligramos por mililitro de micina en cada placa para un crecimiento de descanso de las bacterias. Guarde los platos con diferentes concentraciones de bacterias muertas por antibióticos a cuatro grados centígrados para su uso futuro hasta por un mes.

Es importante preparar y almacenar suficientes platos, preferiblemente el mismo lote para toda la planta. Experimente con al menos uno o dos días de anticipación para verificar la viabilidad de las bacterias. Raspe algunas bacterias de las placas SDR y extiéndalas en una placa GM de N vacía con carbónico, seína y antimicina.

Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante seis a ocho horas y confirme la ausencia de crecimiento bacteriano. Para la mayoría de los estudios relacionados con SDR, como el análisis de la esperanza de vida y el perfil de la producción de progenie, es esencial la preparación de una población de gusanos sincronizada con la edad. Use un recogedor de gusanos de platino para transferir de 20 a 30 adultos reproductivamente activos a varias placas NGM regulares.

Con OP 50. Dependiendo de la cantidad de huevos necesarios para los experimentos, es posible que se necesiten más adultos. Deje los platos a 20 grados centígrados durante cuatro horas para permitir la puesta de huevos.

Retire los adultos del plato e inspeccione visualmente los platos en busca de huevos. Continúe incubando las placas a 20 grados centígrados para permitir que la progenie se desarrolle hacia la etapa adulta tardía de cuatro días uno. Por lo general, esto toma tres días para N dos gusanos de tipo salvaje a 20 grados centígrados.

Para el análisis de la vida útil. Transfiera de 10 a 12 gusanos adultos del primer día a una placa SDR para iniciar la restricción dietética. Para obtener suficiente potencia estadística, utilice un total de 60 a 100 gusanos para cada condición SDR.

Evalúe la viabilidad de cada lombriz cada dos o tres días hasta que todas las lombrices hayan muerto. Es importante destacar que transfiera los gusanos a platos SDR frescos cada dos días para evitar la inanición. Esta curva de calibración representa la concentración de OP 50 en relación con el diámetro exterior de 600.

La ecuación generada por el análisis de regresión lineal se puede utilizar para todos los cálculos futuros de las concentraciones de bacterias OP 50. Este estudio analiza el efecto de los tratamientos crónicos con SDR sobre la vida media de diferentes cepas de gusanos en comparación con una respuesta normal dependiente de la dosis de los gusanos de tipo salvaje a la SDR. El efecto de la vida útil de SDR se suprime parcialmente por la sobreexpresión de DR dos, mientras que la mutación DAF 16 MU 86 no tiene efecto sobre la extensión de la vida inducida por SDR.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar Dian en el juego estándar basado en AGA en la elegancia del mar.