Siete pasos para células estrelladas
10 de mayo de 2011
Aquí se describe un método para el aislamiento de las células estrelladas hepáticas del hígado de ratón. Para la purificación de células estrelladas, hígados de los ratones se digieren In situ Y In vitro Por el tratamiento pronasa colagenasa antes de la centrifugación en gradiente de densidad. Esta técnica produce células hepáticas estrelladas de alta pureza.
El objetivo general de este procedimiento es aislar células estrelladas hepáticas del hígado de ratón. Esto se logra primero mediante una perfusión en C de hígados de ratón con enzimas digestivas. Después de la perfusión, los hígados se cortan en trozos pequeños para aumentar la eficiencia de la digestión in vitro, que se realiza a continuación.
Como paso final, las células estrelladas hepáticas se separan de otros tipos de células hepáticas mediante centrifugación en gradiente de densidad. Finalmente, se obtienen las células estrelladas hepáticas y su pureza puede evaluarse mediante microscopía de luz y microscopía de inmunofluorescencia. El procedimiento será demostrado por Patrick Meyer, un estudiante de posgrado de un laboratorio. Como preparación para la perfusión NC dos de hígados de ratón, primero caliente las soluciones de tampón SC uno y de enzimas en un baño de agua a 37 grados Celsius.
A continuación, configure la bomba peristáltica para obtener un flujo laminar de 6,5 mililitros por minuto y equilibre el tubo de silicona de la bomba con la solución SC uno. Ahora confirme, mediante la pérdida de reflejos, que el ratón anestesiado se encuentra profundamente sedado. Luego, fije el ratón en posición supina sobre una base adecuada.
Utilice tijeras y fórceps para realizar una incisión longitudinal en la piel abdominal y exponer el peritoneo. Abra cuidadosamente el peritoneo y desplace los intestinos fuera de la cavidad abdominal hacia el lado izquierdo del animal con el fin de exponer la vena porta. El aspecto más difícil de este procedimiento es la perfusión en frío del hígado con enzimas digestivas, la cual será demostrada.
A continuación, es importante utilizar un microscopio estereoscópico al insertar la cánula y monitorear de cerca el cambio en las estructuras hepáticas durante la perfusión. Mientras trabaje bajo un microscopio estereoscópico, inserte la cánula del conjunto de infusión en la vena porta. Comience la perfusión del hígado con 30 mililitros de solución SC uno. Abra inmediatamente la vena cava inferior justo después de iniciar el flujo.
El lavado exitoso del hígado se indica por la pérdida de color del tejido hepático. A continuación, examine el hígado con 30 mililitros de solución de Pronase E. Los lóbulos hepáticos se hincharán y los lobulillos aparecerán distintos a través de la cápsula tras la perfusión con 30 mililitros de solución de colagenasa P. Cuando la perfusión con colagenasa P esté completa, recoja el hígado del ratón disecándolo cuidadosamente del diafragma y de los órganos circundantes, y guárdelo en 70 mililitros de solución SC dos sobre hielo.
En este punto, el hígado ha perdido su forma y presenta un aspecto atónico y amorfo. El procedimiento para la digestión de hígados de ratón debe realizarse bajo condiciones estériles. En un flujo laminar.
Utilice tijeras afiladas para cortar los hígados en trozos de aproximadamente dos por dos por dos milímetros cúbicos. Luego combine la suspensión de 70 mililitros de SC dos y los trozos de hígado con 50 mililitros de solución de colagenasa P proteasa E. Añada un mililitro de solución de ADN uno y digiera los hígados durante 20 minutos a 37 grados Celsius mientras agita.
Tras la digestión enzimática del tejido hepático, las células estrelladas se separan de otros tipos celulares hepáticos mediante centrifugación en gradiente de densidad. Para comenzar este procedimiento, filtre la suspensión celular a través de filtros celulares de 70 micrómetros en seis tubos cónicos de 50 mililitros y lave las células con tampón E2, centrifugando durante 10 minutos a 600 ×g y 4 grados Celsius. Tras la centrifugación, aspire cuidadosamente 40 mililitros del sobrenadante de cada tubo.
Luego, agregue 150 microlitros de la solución de ADN, una solución por cada tubo, y resuspenda las células. Reúna las suspensiones celulares en cuatro tubos Falcon de 50 mililitros y lávelas mediante centrifugación G-B-S-S-P durante 10 minutos a 600 G y 4 grados Celsius. Aspire cuidadosamente la mayor cantidad posible del sobrenadante sin perturbar el sedimento y agregue 150 microlitros de la solución de ADN uno a cada tubo.
Suspendemos los pellet celulares en 10 mililitros de G-B-S-S-B por tubo. Reunimos las células en dos tubos cónicos de 50 mililitros y agregamos G-B-S-S-B hasta un volumen total de 36 mililitros por tubo. Añadimos 14 mililitros de solución den por tubo y mezclamos bien.
A continuación, transfiera 10 mililitros de la suspensión celular a un tubo de centrifugación en gradiente de 12 mililitros, obteniendo un total de 10 tubos. Superponga suavemente la suspensión celular con 1,5 mililitros de G-B-S-S-B por tubo. Centrifugue los gradientes durante 15 minutos a 1500 Gs y cuatro grados Celsius sin freno.
Posteriormente, los hepatocitos se sedimentarán en el fondo del tubo, mientras que las células estrelladas se encontrarán en la interfase como un anillo blanco. Utilizando una pipeta de cinco mililitros, recolecte cuidadosamente la interfase que contiene las células estrelladas y transfiera a un tubo de 50 mililitros. Lave las células añadiendo G-B-S-S-B y centrifugando durante 10 minutos a 600 Gs y cuatro grados Celsius.
Aspire el sobrenadante y resuspenda las células en 20 mililitros de DMEM con suplementos. Después de contar las células, transfiéralas a frascos de cultivo celular a una concentración de dos veces 10 a la cuarta células por centímetro cuadrado, e incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Aproximadamente dos horas después de su preparación, las células estrelladas hepáticas deben estar adheridas; cambie el medio para eliminar las células muertas y los restos celulares.
Devuelva las células al incubador. Los resultados representativos de la preparación de células estrelladas hepáticas a partir de hígados de ratón utilizando este protocolo se muestran aquí. Las células en el día uno y el día tres de cultivo in vitro muestran la morfología característica de las células estrelladas hepáticas. Tienen forma de astro liquen y exhiben almacenamiento de vesículas lipídicas.
En sitios perinucleares, la pureza de las células estrelladas hepáticas aisladas también se puede verificar mediante la expresión de la proteína ácida fibrilar glial o GFAP. Estas imágenes muestran una tinción inmunofluorescente representativa para GFAP, mostrada en rojo en células estrelladas hepáticas, que han sido cultivadas durante tres días tras el aislamiento celular. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células estrelladas hepáticas a partir de hígado normal para obtener un rendimiento adecuado de células estrelladas puras.
Es importante asegurar una digestión eficiente durante la perfusión hepática. Finalmente, es fundamental determinar la integridad adecuada de las células aisladas mediante la evaluación de la morfología y el fenotipo de las células hepáticas.
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Resumen
Este artículo describe un método para aislar células estrelladas hepáticas del hígado de ratón. El proceso implica perfusión con enzimas digestivas, seguida de digestión in vitro y centrifugación en gradiente de densidad para obtener una alta pureza de las células.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Biología celular
- Investigación hepática
- Aislamiento de células madre
Antecedentes
- Las células estrelladas hepáticas desempeñan un papel crucial en la fisiología hepática.
- El aislamiento de estas células es esencial para diversas aplicaciones de investigación.
- Los métodos tradicionales pueden producir poblaciones celulares impuras.
- Este método tiene como objetivo mejorar la pureza de las células aisladas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para el aislamiento de células estrelladas hepáticas.
- Mejorar la pureza de las células aisladas con fines de investigación.
- Proporcionar un protocolo detallado para investigadores en el campo.
Métodos Utilizados
- Perfusión de hígados de ratón con enzimas digestivas.
- Digestión in vitro de tejido hepático.
- Centrifugación en gradiente de densidad para la separación de células.
- Evaluación de la pureza celular mediante técnicas de microscopía.
Resultados principales
- Se logró una alta pureza de células estrelladas hepáticas.
- El método permite una separación eficaz de otros tipos de células hepáticas.
- La pureza celular puede evaluarse mediante microscopía óptica y de inmunofluorescencia.
- El protocolo es reproducible y puede ser utilizado por otros investigadores.
Conclusiones
- El método descrito es eficiente para aislar células estrelladas hepáticas.
- Proporciona una herramienta valiosa para la investigación hepática.
- Estudios futuros pueden basarse en esta técnica para diversas aplicaciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de células estrelladas hepáticas permite la reducción mecanicista de riesgos en la investigación de la fibrosis hepática y la inmuno-metabolismo al proporcionar un sistema purificado y relevante para la enfermedad, útil para la validación de dianas. El método respalda el desarrollo de modelos preclínicos y la estandarización de ensayos, mejorando la confianza predictiva en la selección terapéutica. Este flujo de trabajo sitúa la preparación de células estrelladas como un paso fundamental para el descubrimiento traslacional de biomarcadores y el análisis de vías en la investigación de fármacos enfocada en hepatología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de las vías de fibrosis mediadas por células estrelladas y sus funciones como presentadoras de antígenos para la comprobación de hipótesis sobre dianas.
- Valor operativo: Proporciona una población celular homogénea para reducir la variabilidad en estudios iniciales de interacción con dianas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce células estrelladas con morfología de gotas lipídicas preservada y expresión de GFAP para lecturas funcionales en ensayos.
- Valor operativo: Proporciona preparaciones celulares reproducibles adecuadas para cribado de alto contenido y perfilado de bibliotecas de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización relevante para enfermedades de la fibrosis hepática y la modulación inmunitaria en la validación preclínica.
- Valor operativo: Permite la producción escalable de células estrelladas para estudios longitudinales de farmacocinética y farmacodinamia.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar células estrelladas validadas para la validación de dianas, el desarrollo de ensayos y la reducción de riesgos mecanicistas antes de la identificación de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías y la validación funcional de objetivos mediante el aislamiento de células estrelladas purificadas.
- Selección: Permite la preparación de ensayos mediante suspensiones celulares estandarizadas y puras para pruebas de compuestos.
- Análisis: Apoya la evaluación cuantitativa de la pureza celular y de los estados de activación mediante tinción de GFAP y análisis de imágenes de gotas lipídicas.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica a través de modelos de fibrosis mediada por células estrelladas e interacciones inmunitarias.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de aislamiento reutilizable para programas de descubrimiento enfocados en hepatología en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de dianas mediante la reducción de la heterogeneidad celular en estudios de células estrelladas.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad del aislamiento de células estrelladas, lo que permite la consistencia entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al reducir los riesgos de las dianas en fibrosis e inmunología al inicio del descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de terapéuticos dirigidos al hígado basada en datos mecanicistas de células estrelladas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de perfusión, digestión enzimática y centrifugación en gradiente de densidad.
- Depende del acceso a equipos de perfusión, filtros para células, centrífugas y preparación de gradientes de Nycodenz.
- Necesita la estandarización de las concentraciones de enzimas, tiempos de digestión y parámetros de centrifugación entre diferentes equipos.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen tasas de perfusión específicas de la especie y la potencia de la colagenasa para modelos no murinos.
- Las limitaciones prácticas incluyen la duración del protocolo de múltiples pasos y la sensibilidad a la sobredigestión enzimática, que afecta el rendimiento y la viabilidad celular.
