Name: Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Aprende métodos para evaluar la citotoxicidad mediada por linfocitos T CD8+ en células beta pancreáticas usando ensayos de liberación de cromo-51 e imagen celular en tiempo real con potencial de membrana mitocondrial.

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Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud y DK074656 AI56374 (CEM), así como la Fundación de Investigación de Diabetes Juvenil.

1. Preparación de las células <ol><li> Objetivo el cultivo de células: la cultura de las líneas celulares de ratón beta, NIT-1 y NIT-4, fue de 1,2 se ha descrito anteriormente en DMEM suplementado con FBS al 10%, 0,02% de BSA, no de aminoácidos esenciales, 15 mM HEPES, 16,5 mm Glocose y penicilina / estreptomicina. El 51 Cr etiquetado, las células de las semillas en un fondo plano de 96 pocillos placa de cultivo de 5x10 4 células / pocillo en 200 l medio de cultivo. Para los experimentos de microscopía, las células de las semillas en un 8 y Lab-Tak cubreobjetos II de cámara en cámara de 5x10 4 por 500 en el medio de cultivo l, y dejar crecer durante 48 horas antes de usar en los experimentos de citotoxicidad. </li><li> El control de las células T cultura línea: Utilice la línea celular Jurkat (ATCC, CD3 + línea celular humana de linfocitos) como control negativo. Cultivo de células Jurkat en RPMI1640 complementado con 10% de SFB, 2 mM L-glutamina, 1,5 g / L de bicarbonato de sodio, 10 mM HEPES y 1,0 mM piruvato de sodio. </li></ol> 2. Recolección y la activación de efectores autorreactivos células T CD8 + NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] y NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] fueron adquiridos de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) y criados en nuestras instalaciones de ratón. Progenie híbrida F1 de cruces de NOD-AI4a con NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] desarrollar diabetes en 3-5 semanas de edad. Todos los ratones fueron alojados en libres de patógenos específicos y aprobados por las instalaciones de Cuidado de Animales de la institución en cuestión y el empleo. <ol><li> 3-4 semanas de edad, la eutanasia AI4a NOD-/ b ratones utilizando CO 2. </li><li> Recoger el bazo de los ratones. Los ratones sacrificados se preparan con spray de etanol y se abrió bajo el capó quirúrgica. Bazos se quitan y se ponen en helado buffer HBSS inmediatamente. </li><li> Recoger las células del bazo con un homogeneizador de vidrio de 7 ml. De dos a tres bazos cada uno se puso en 5 ml de HBSS frío y homogeneizados con un homogeneizador de 7 ml de vidrio. Homogeneizado se recoge y se centrifuga a 1200rpm durante 5 minutos a 4 ° C utilizando una centrifugadora Sorvall RT7 +. Gránulos de las células se recogen. </li><li> Eliminar las células rojas de la sangre mediante un tratamiento con una solución hipotónica. Los pellets son tratados con 5 ml de solución hipotónica / bazo en hielo durante 5 minutos, luego se neutraliza mediante la adición de un volumen igual de HBSS. Recoger las células por centrifugación, como el anterior, y resuspender en 50 ml de HBSS. Pase la suspensión de células a través de células colador y contar con un hemocitómetro con tinción TrypanBlue. </li><li> Activar las células. Resuspender las células en 5x10 6 / ml y activar mediante un cultivo de 3 días con 0,1 M AI4 mimotopo (YFIENYLEL secuencia de aminoácidos) y 25 U / mL de IL-2 en RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB, 2 mM L-glutamina, 1,5 g / L de bicarbonato de sodio, 10 mM HEPES y 1,0 mM piruvato de sodio. </li></ol> 3. Ensayo de liberación de 51 Cr para examinar CML <ol><li> Células etiqueta de destino: Agregar 51 Cr a las células diana en un Ci / pocillo y la cultura durante 3 horas, y lavar 3 veces con medio de cultivo. </li><li> Suspender las células efectoras en medio RPMI 1640 como se mencionó en el paso 2.5 para que el volumen final a cada pocillo es de 200 l. </li><li> Después del último lavado de las células diana marcada, añada activar las células efectoras de las culturas de las células diana a efector deseado al objetivo (E: T) ratios. Por lo general, el uso E: T ratios de 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 y 50:1. </li><li> Añadir nuevo modificado RPMI 1640 (véase el paso 2.5) a 6 pozos de las células diana para actuar como un control de lisis espontánea. </li><li> Co-cultivo las células efectoras y diana durante 16 horas. </li><li> Recoger el líquido sobrenadante en tubos de 6x50 mm de vidrio de cal </li><li> Lisis de las células mediante la adición de 100μl 2% de SDS y pipetear varias veces con suavidad. </li><li> Recoger lisado celular en otro juego de tubos de vidrio 6x50 mm de cal. </li><li> Lavar una vez con la limpieza de pozos H 2 O y añadir el lavado de las trompas de lisado celular. </li><li> Contar con los sobrenadantes y lisados ​​de células utilizando un contador gamma. </li><li> Calcular lisis específica de la siguiente manera: <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="La ecuación 1"></li></ol> 4. Tinción de las células de imágenes de células vivas Entre los más utilizados potencial de membrana mitocondrial colorantes, TMRM exhibe la menor toxicidad mitocondrial. 3 Por lo tanto, elegimos TMRM para estos estudios de imágenes de células vivas. <ol><li> Prepare una solución de 40 mM de TMRM en DMSO y almacenar a -20 ° C. Haga un [25 nM] solución de trabajo fresca en rojo fenol libre de DMEM con todos los suplementos de NIT-1 cultivo celular 1. </li><li> Mancha objetivo NIT-1 con células TMRM 25 nM durante 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Vuelva a colocar los medios de comunicación con los medios de comunicación fresco que contiene 5 nM TMRM para mantener el equilibrio de distribución del colorante 4. </li><li> Conde activa las células T efectoras AI4 utilizando un hematocitómetro. </li><li> Mancha activa las células T efectoras AI4 con 1 l / mL para Picogreen5 minutos a temperatura ambiente y lavar con rojo fenol libre de medio de cultivo 3 veces. </li></ol> 5. La evaluación de los linfocitos T mediada por la muerte de las células beta usando imágenes de células vivas <ol><li> Monte la cámara cubre objetos con células NIT manchado en el escenario de un Zeiss LSM 510 microscopio confocal. Retire la lengüeta con una dremmel y gas esterilizar el vidrio con óxido de cámaras Etheline. El escenario está equipado con una cámara de imágenes de células vivas, que tiene la temperatura controlada a 37 ° C y 5% de CO 2 con la humedad. </li><li> Añadir activa y se tiñeron las células T a las cámaras designadas en diferentes E: T ratios. </li><li> Añadido el mismo número de células Jurkat manchado a las cámaras de control. </li></ol> 6. La obtención de imágenes de células vivas El microscopio está equipado con una platina motorizada que nos permite adquirir imágenes en repetidas ocasiones en diferentes lugares de las cámaras de iguales o diferentes de forma automática en el transcurso del experimento. <ol><li> El uso de un lente de 63x de aceite objetivo, capturar imágenes a intervalos de cada 3 minutos para un total de 300 cuadros por ubicación. </li><li> Detectar manchas TMRM con una longitud de onda de excitación de 543 nm y el conjunto de filtros para la emisión de 565-619 nm </li><li> Detectar manchas Picogreen con una excitación de 488 nm y un conjunto de filtros para la emisión de 500-630 nm. El video fue creado usando el software Zeiss LSM. </li></ol> 7. De conversión de vídeo para su publicación <ol><li> Usando el software LSM Zeiss, crear un archivo de película sin comprimir en formato AVI. </li><li> Para convertir el vídeo en el formato de publicación, importar el vídeo en el paquete de software FIJI ( <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), un ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / ij /</a> ) la distribución, usando el plugin Bioformats de loci ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li> Ajustar la configuración del brillo y el contraste para equilibrar las señales de color verde y rojo y la velocidad de fotogramas se establece en 2 fotogramas / segundo utilizando el menú de opciones de animación. </li><li> Recortar el vídeo a 512 x 512 píxeles y la exportación como un archivo AVI sin comprimir. </li><li> Abrir el archivo AVI en el software Quicktime 7 (ordenador de Apple, Cupertino, CA) y comprimir y exportar en el formato de archivo de vídeo abierto H264/MPEG-4 a 1200 kbs / segundo. </li></ol> 8. Los resultados representativos: <ol><li> Un resultado representativo de 51 Cr ensayo de LMC. La figura 1 muestra un resultado representativo de un ensayo de LMC en la lisis por ciento específica (eje Y) aumenta a medida que el efector: relación de destino (eje X) se incrementa. Las células diana son islotes aislados de primaria inmunodeficientes NOD Rag1-/ -. Ratones y etiquetados con 51 Cr. Esplenocitos de ratones transgénicos NOD.AI4α / β son aislados y se activa como se describe en el paso 2. Las metas y los efectores fueron co-cultivadas durante 16 horas. Lisis por ciento determinado se calcula como se describe en el paso por encima de 3,11. </li><li> Dos representantes (positivo y negativo) los resultados de una mediada por células T disipación de las células beta del potencial de membrana mitocondrial se presentan. Las células se tiñen y las reacciones se registran como se describe en los pasos 4, 5 y 6, los archivos de vídeo se crean como en el paso 7. Video 1: La versión beta del ratón línea celular NIT-1 se tiñó el potencial de membrana mitocondrial tinte TMRM (rojo). Activado, autorreactivos células T CD8 + AI4 (teñido de verde con Picogreen) fueron co-cultivadas con estas NIT-1 en las células en un E: T relación de 50:1. NIT-1 potencial de membrana mitocondrial se disipa poco a poco durante una duración de 400 minutos, pero sólo en los grupos que se interactúa con las células T AI4. Video 2: Como un experimento de control, NIT-1 células se tiñeron con TMRM y co-cultivadas con células Jurkat Picogreen manchada en un E: T relación de 50:1. Células Jurkat es un ser humano línea de células T que es MHC no coincidentes. NIT-1 células mantiene el potencial de membrana mitocondrial durante toda la duración de los 400 minutos de co-período de incubación. Células Jurkat no interactúan con NIT-1 clusters y por lo tanto, no provocar el asesinato. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1 resultado Representante de la LMC utilizando como células isletas objetivo principal aislado de inmunodeficiencia NOD.Rag1-/ -. Ratones y esplenocitos de ratones transgénicos NOD.AI4α / β. Las metas y los efectores fueron co-cultivadas durante 16 horas. Lisis porcentaje específico aumenta a medida que la unidad de efectos: aumenta la proporción de destino. Video 1. Beta ratón línea celular NIT-1 se tiñó el potencial de membrana mitocondrial TMRM colorante (rojo). Activado autorreactivos células T CD8 + AI4 (teñido de verde con Picogreen) fueron co-cultivadas con estas NIT-1 células en E: T relación de 50:1. NIT-1 membrana mitocondrial potencial de disipaciónTed gradualmente durante un período de 400 minutos, pero sólo en los grupos que se interactúa con las células T AI4 verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">Haga clic aquí para ver el video</a> . Video 2. NIT-1 las células se tiñeron mismo que se describe en el video 1 y co-cultivadas con Picogreen manchada Jurkat línea de células T humanas. NIT-1 células fueron capaces de mantener el potencial de membrana mitocondrial pensado la duración de 400 minutos. Células Jurkat no interactúan con NIT-1 clusters y por lo tanto no inducen muerte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">Haga clic aquí para ver el video</a> .

<ol><li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIT-1%2C+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD%2FLt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li>
<li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li>
<li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+immune-mediated+%28type+1%29+diabetes+mellitus%3A+potential+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li>
<li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+resistance+of+ALR%2FLt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction%3A+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li>
<li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li>
<li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+membrane+potential+%28deltapsi%28m%29%29+in+apoptosis%3B+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li>
<li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li>
<li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li>
</ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad de Florida Cuidado de Animales institucional y el empleo.

Células T citotóxicas mediadas por muerte de las células beta es la fisiopatología principal de DT1 5. Ensayos de CML con 51 Cr liberación nos permite estudiar el grado de respuesta del efector objetivo 6. Sin embargo, el proceso detallado y las vías de las células T mediada por la muerte de las células beta aún no está totalmente entendido. Dado que las mitocondrias son esenciales para la función celular beta y la muerte de siete, nos hemos centrado en cambios en las mitocond...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> CR-51 </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrametil rodamina éster metílico (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotopo </td><td> mimotopes.com </td><td> secuencia de aminoácidos: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> I + D </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> MEM no aminoácidos esenciales </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Géminis </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> Rojo fenol libre de DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora de CO2 </td><td> Thermo Fisher </td><td> HeraCell 150i </td><td> Mantenerse estéril para el cultivo celular </td></tr><tr><td> Cabina de seguridad biológica </td><td> Thermo Fisher </td><td> Forma 1440 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos desechables cultura, 6x50 mm de vidrio de cal </td><td> Pescador </td><td> 14 a 958-A </td><td></td></tr><tr><td> Gamma Contador </td><td> Perkin Elmer </td><td> Asistente de contador automático de Gamma 1470 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 Meta Confocal </td><td> Con platina motorizada y una cámara de células vivas </td></tr><tr><td> Pipeta (1 ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubos (ámbar) </td><td> Pescador </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífugo </td><td> Sorvall Legend RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio vertical </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ ratones </td><td> El Laboratorio Jackson </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ ratones </td><td> El Laboratorio Jackson </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / ratones F1 β </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Criados en instalaciones para animales UF </td></tr></tbody></table>

métodos para evaluar la beta mediada por la muerte celular por linfocitos t citotóxicos

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad mediada por células T autoinmunes. Durante la patogénesis, los pacientes se vuelven cada vez más insulinopenia como la producción de insulina se pierde, probablemente esto se debe a la destrucción de las células beta del páncreas por las células T. Comprensión de los mecanismos de la muerte de las células beta en el desarrollo de DT1 proporcionará información para generar una cura efectiva para esta enfermedad. Mediada por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se han utilizado históricamente el radionúclido cromo 51 (51 Cr) para etiquetar las células diana. Estos objetivos se exponen a las células efectoras y la liberación de 51 Cr de las células diana se lee como una indicación de la muerte celular mediada por linfocitos. Los inhibidores de la consecuencia de muerte celular en menor liberación de 51 Cr. Como células efectoras, se utilizó una población activa autorreactivos clonal de las células CD8 + linfocitos T citotóxicos (CTL) aislado de un ratón transgénico de valores, tanto para las cadenas alfa y beta del receptor de la célula AI4 T (TCR). Activa las células T AI4 fueron co-cultivadas con 51 Cr células diana marcadas NIT durante 16 horas, la liberación de 51 Cr se registró para el cálculo de lisis específica Las mitocondrias participar en importantes eventos fisiológicos, tales como la producción de energía, la regulación de la transducción de señales, y la apoptosis. El estudio de las células beta mitocondrial cambios funcionales durante el desarrollo de DT1 es una nueva área de investigación. Utilizando el potencial de membrana mitocondrial colorante tetrametil rodamina éster metílico (TMRM) y confocal de imágenes microscópicas de células vivas, que supervisó el potencial de membrana mitocondrial en el tiempo en la línea de células beta NIT-1. Para los estudios de imagen, las células T efectoras AI4 fueron marcadas con el colorante fluorescente tinción nuclear Picogreen. NIT-1 en las células y las células T fueron co-cultivadas en cubreobjetos y cámaras montadas en la platina del microscopio equipado con una cámara de células vivas, controlada a 37 ° C, con 5% de CO 2, y húmedo. Durante estos experimentos se tomaron imágenes de cada grupo cada 3 minutos durante 400 minutos. Más de un curso de 400 minutos, se observó la disipación del potencial de membrana mitocondrial en NIT-1, donde grupos de células AI4 las células T se adjunta. En el experimento de control simultáneo donde NIT-1 células fueron co-cultivadas con MHC mal emparejado las células Jurkat de linfocitos, el potencial de membrana mitocondrial se mantuvo intacta. Esta técnica se puede utilizar para observar en tiempo real los cambios en el potencial de membrana mitocondrial en las células bajo el ataque de los linfocitos citotóxicos, citocinas u otros reactivos citotóxicos.

Mediadas por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se pueden utilizar para evaluar las respuestas autorreactivas y los mecanismos de estudio de la muerte celular in vitro. Sin embargo, utilizando células vivas, las técnicas de microscopía confocal microscópicos con tintes fluorescentes, el tipo y la cinética de muerte celular, así como las rutas utilizadas se pueden estudiar con mayor detalle.

Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos

La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad autoinmune mediada por células T. Durante la patogénesis, los pacientes presentan una insulinopenia progresiva a medida que la insulina...

La diabetes tipo uno es una enfermedad autoinmune en la cual las células beta pancreáticas productoras de insulina son destruidas por linfocitos T autoreactivos. Comprender los mecanismos implicados proporcionará información para desarrollar una cura efectiva para esta enfermedad. Aquí se demuestran dos métodos para observar in vitro la destrucción específica de células beta pancreáticas mediada por linfocitos T positivos para CD8: un ensayo de citotoxicidad linfocitaria mediada por células basado en cromo-51 (CML) y un ensayo CML visual para ambos métodos.Los linfocitos T efectoras CD8 positivas se preparan primero a partir de bazo de ratón para realizar un ensayo de LMC. Una o cuatro células beta diana se marcan con cromo 51 y se cultivan en co-cultivo con células efectoras. Cuando las células beta diana son destruidas, se libera el cromo 51. Luego se recogen los sobrenadantes y los lisados celulares, y se miden los niveles de radioactividad, que indican el grado de muerte celular, mediante un contador gamma para realizar un ensayo visual de LMC. Una y cuatro células beta diana se marcan con el colorante de potencial mitocondrial TM RM, y las células efectoras se marcan con pico

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El ensayo de liberación de cromo, un ensayo común para la detección de la actividad de células T citotóxicas, tiene varias limitaciones. El uso de células T CD8 específicas de antígeno y la línea tumoral de cáncer de mama humano, SKBR3, en el presente artículo, un enfoque basado en impedancia se examinó por la capacidad de detección de muerte celular.

La determinación óptima de la actividad citotóxica de las células T específicas Her2Neu CD8 Humanos comparando el Ensayo de liberación de Cr51 al Sistema xCELLigence

Fuente: Heidbuechel, J. P., et al.. Paramixovirus para la inmunomodulación dirigida a tumores: diseño y evaluación ex vivo. J. Vis. Exp. (2019).Este video demuestra un ensayo celular para evaluar la actividad inmunomoduladora específica frente al blanco de un enganchador bispecífico de células T (BTE) codificado por un virus. El BTE une células tumorales que expresan un receptor diana con células T, desencadenando la lisis tumoral y la liberación de enzimas. Una lectura colorimétrica, basada en...

Evaluación de la actividad inmunomoduladora de un enganchador de células T bispecífico codificado viralmente

El video muestra un ensayo basado en citometría de flujo para analizar la inmunodominancia en linfocitos T citotóxicos o respuestas CTL. Las células diana fluorescentes inyectadas exhiben una fluorescencia variable correspondiente a epítopos inmunogénicos. La recolección y clasificación posterior al bazo revela una reducción de las células fluorescentes de alta intensidad, lo que confirma la inmunodominancia en las respuestas a CTL.

Ensayo para evaluar la inmunodominancia en las respuestas citotóxicas de los linfocitos T

Este video muestra un ensayo in vitro que utiliza β-glucanos para activar las células microgliales para la producción de radicales superóxido, una especie reactiva de oxígeno. En las células de cáncer cerebral, los oxidantes reactivos generados suprimen activamente la proliferación de células tumorales e inducen la muerte celular.

Un ensayo para analizar el β-glucano de prueba como estrategia de inmunoterapia contra las células de cáncer cerebral

Se describe una sola célula de alto rendimiento de ensayo para medir la citotoxicidad de las células T cuando se incuba con las células diana tumorales. Este método emplea una matriz densa, elastómero de sub-nanolitros pozos (~ 100.000 pozos / matriz) para confinar espacialmente las células T y las células diana en proporciones definidas, y está acoplado a la microscopía de fluorescencia para monitorizar efector-diana conjugación y posterior apoptosis.

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Este protocolo describe un ensayo de citotoxicidad sensible basado en células. Al enumerar la disminución de la frecuencia de linfocitos T CD4+ diana vivos en presencia de un número cada vez mayor de linfocitos T CD8+ efectores, este ensayo permite la evaluación directa de la actividad citolítica de los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno.

Ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica

Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

El objetivo de este protocolo es permitir la detección de en vivo matando de una célula de la blanco en un modelo murino de específica de antígeno.

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

Describimos aquí un protocolo para investigar la citotoxicidad de CD8 pre-activado+ T las células contra las células cancerosas mediante la detección de apoptosis cáncer células vía en tiempo real la microscopia. Este protocolo puede investigar los mecanismos detrás de la supresión de la célula de T inducida por la célula mieloide y evaluar compuestos destinados a reposición de T las células vía bloqueo de células mieloides supresores inmunes.

Tiempo real detección de Vitro Tumor de la célula apoptosis inducida por CD8+ T las células para el estudio de las funciones inmunológicas de supresores de Tumor infiltrante de células mieloides

Describimos aquí un ensayo de matanza in vivo basado en citometría de flujo que permite el examen de inmunodominancia en las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) a un antígeno tumoral modelo. Proporcionamos ejemplos de cómo este ensayo elegante se puede emplear para estudios mecaniísticos y para pruebas de eficacia de fármacos.

Confección de ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar inmunodominancia en respuestas de células T CD8+ específicas de tumores

Aprende métodos para evaluar la citotoxicidad mediada por linfocitos T CD8+ en células beta pancreáticas usando ensayos de liberación de cromo-51 e imagen celular en tiempo real con potencial de membrana mitocondrial.

Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos

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