Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos

La diabetes tipo uno es una enfermedad autoinmune en la cual las células beta pancreáticas productoras de insulina son destruidas por linfocitos T autoreactivos. Comprender los mecanismos implicados proporcionará información para desarrollar una cura efectiva para esta enfermedad. Aquí se demuestran dos métodos para observar in vitro la destrucción específica de células beta pancreáticas mediada por linfocitos T positivos para CD8: un ensayo de citotoxicidad linfocitaria mediada por células basado en cromo-51 y un ensayo visual de citotoxicidad linfocitaria mediada por células, ambos métodos.

Los linfocitos T efectoras CD8 positivas se preparan primero a partir de bazo de ratón para realizar un ensayo de LMC. Una o cuatro células beta diana se marcan con cromo 51 y se co-cultivan con células efectoras. Cuando las células beta diana son destruidas, se libera el cromo 51. Luego se recogen los sobrenadantes y los lisados celulares, y se miden los niveles de radioactividad, que indican el grado de muerte celular, utilizando un contador gamma para realizar un ensayo visual de LMC. Una y cuatro células beta diana se marcan con el colorante de potencial mitocondrial TM RM, y las células efectoras se marcan con pico verde.

Las células se combinan y se realiza un análisis de imagen en células vivas para examinar la tasa de muerte celular indicada por la disipación del potencial de la membrana mitocondrial. La principal ventaja de este ensayo frente a ensayos tradicionales como el ensayo de liberación de cromo es que podemos observar la muerte de células beta en tiempo real. Otras ventajas incluyen la capacidad de determinar si la muerte de células beta mediada por linfocitos T CD8 depende del contacto, y además, este ensayo puede ampliarse utilizando indicadores fluorescentes para trazar las vías de muerte de las células beta.

Este método puede responder preguntas clave en la patogénesis de cualquier enfermedad en la que las células T citotóxicas desempeñen un papel. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y posiblemente hacia el diagnóstico, ya que la función mitocondrial es esencial tanto para la supervivencia como para la fisiología de las células beta. Jing Chen y yo demostraremos este procedimiento.

Las células diana utilizadas en esta demostración son las líneas celulares de células beta de ratón, knit one y knit four, y la línea celular de linfocitos humanos jerk en CD tres más, que no reconoce ni destruye las células beta de ratón, se utiliza como control negativo. Las células efectoras utilizadas aquí son linfocitos T autoreactivos positivos para CD ocho obtenidos de los bazo de ratones nod AI cuatro alfa beta F1 de tres a cuatro semanas de edad. Para obtener las células, comience colocando los bazo en un homogenizador de vidrio de siete mililitros con fondo cónico que contenga cinco mililitros de HBSS frío con hielo. Homogenice los bazo utilizando un homogenizador de Dounce, luego transfiera la suspensión celular a un tubo cónico y centrifugue a 250 G durante cinco minutos. Tras la centrifugación, deseche el sobrenadante. A continuación, para eliminar los glóbulos rojos, resuspenda el sedimento en cinco mililitros de solución hipotónica por bazo. Incube durante cinco minutos en hielo.

Después de la incubación, lave el sedimento celular dos veces con 10 mililitros de HBSS frío a 4 °C, centrifugando entre cada lavado. Tras cada lavado, re suspenda las células en 10 mililitros de HBSS frío a 4 °C. Luego, utilizando un hemocitómetro, cuente las células tras haber determinado los recuentos celulares.

Centrifugue nuevamente, luego resuspenda las células en RPMI 1640 suplementado a una densidad de cinco veces 10 a la seis células por mililitro. Siembre las células a una densidad de cinco veces 10 a la seis por mililitro en un frasco T 75. Finalmente, para activar las células, añada AI cuatro myope e IL dos al frasco a concentraciones finales de 0,1 micromolar y 25 unidades por mililitro, respectivamente. Incube el frasco en una incubadora con 5% CO2 a 37 grados Celsius durante tres días. Las células activadas ya pueden utilizarse para un ensayo de LMC basado en ACROMIUM 51 o para un ensayo de LMC visual.

El ensayo de citotoxicidad linfocitaria mediada por células o CML utiliza la liberación de cromo 51 procedente de células diana como indicador de la muerte de células beta mediada por CD8. Para marcar células beta diana NIT-1 o NIT-4 con cromo 51, comience sembrándolas a una densidad de 5 × 10⁴ células por pocillo en una placa de 96 pocillos, en 200 microlitros de DMEM suplementado; incube a 37 grados Celsius y 5 %CO2 durante 24 horas. Al día siguiente, diluya el cromo 51 en DMEM suplementado hasta una concentración de un microcurio por 20 microlitros.

A continuación, agregue 20 microlitros del cromo 51 diluido a cada pocillo que contenga las células beta diana para obtener un microcurio por pocillo. Coloque la placa en un incubador húmedo a 37 grados Celsius con 5% CO2 e incube durante tres horas tras la incubación. Aspire el medio y lave las células tres veces con medio de cultivo fresco.

A continuación, agregue medio a las células efectoras CD8 positivas activadas de manera que el volumen final añadido a cada pocillo sea de 200 microlitros. Combine las células efectoras con cultivos de células beta diana en las relaciones E:T deseadas; aquí se utilizan relaciones de 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1 y 0,25:1 para preparar los controles de lisis espontánea. Añada medio fresco a seis pocillos de las células beta diana.

Luego, coloque la placa en el incubador y realice el co-cultivo de las células efectoras y diana durante 16 horas. Al día siguiente, utilice una pipeta multicanal para transferir el sobrenadante a seis tubos de vidrio de cal de 50 milímetros. A continuación, para lisar las células, añada cien microlitros de SDS al 2% a la placa y pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces.

Transfiera el lisado celular a un nuevo conjunto de seis tubos de vidrio de cal de 50 milímetros. Luego, para asegurar que se recoge todo el lisado celular, agregue cien microlitros de agua estéril a cada pocillo, pipetee hacia arriba y hacia abajo, y añádalo a los tubos de lisado celular para determinar el grado de destrucción de las células beta. Mida la radioactividad en el sobrenadante y en el lisado utilizando un contador gamma una vez que se hayan realizado las cuentas.

Determine la lisis específica restando el porcentaje de cuentas en los sobrenadantes del control de lisis espontánea del porcentaje de cuentas en los sobrenadantes experimentales, como se muestra en esta ecuación. Para examinar la muerte de células beta mediada por linfocitos T en tiempo real. El potencial de membrana mitocondrial se monitorea mediante imágenes en tiempo real de cultivos colectivos de células diana y efectoras.

Para prepararse para la microscopía, observe las células beta diana sobre un cubreobjetos con cámara de ocho pocillos modificado y esterilizado, con una densidad de cinco veces 10 a la cuarta células por pocillo. Coloque las cámaras en un incubador a 37 grados Celsius y 5 %CO₂ y deje que las células crezcan durante 48 horas. El día del experimento, agregue el colorante para el potencial de membrana mitocondrial, tetrametilrodamina metil éster (TMRM), a 25 nanomolares y el medio DMEM suplementado libre de rojo de fenol e incube durante 30 minutos.

Una vez que las células hayan sido teñidas con TMRM, reemplace el medio con medio fresco que contenga cinco nanomolares de TM RM para mantener la distribución en equilibrio del colorante. A continuación, cuente las células T efectoras activadas AI cuatro o las células de control jerk it utilizando un hemocitómetro, y re suspenda las células en DMEM suplementado libre de rojo de fenol en tubos cónicos de 15 mililitros a la concentración adecuada. A continuación, agregue pico green a las células efectoras activadas o a las células de control jerk it hasta una concentración final de un microlitro por mililitro.

Envuelva el tubo con papel de aluminio para protegerlo de la luz, luego incube durante cinco minutos a temperatura ambiente tras la incubación. Lave las células tres veces añadiendo DMEM sin rojo de fenol, mezclando brevemente y centrifugando a 250 ×g durante cinco minutos. Para recolectar las células para la obtención de imágenes, coloque la cámara portaobjeto sobre la platina de un microscopio confocal equipado con una platina motorizada y una cámara humidificada para imágenes de células vivas a 37 grados Celsius y 5 %CO₂.

Añada las células efectoras teñidas con pico verde activadas a las cámaras en la proporción de efector a blanco que se evaluará aquí. La proporción ET que se imaginará será de 50 a 1; configure el software de imagen para adquirir imágenes en cuatro pocillos con tres ubicaciones cada uno, cada tres minutos, con 300 cuadros por ubicación y excitación ex utilizando los conjuntos de filtros adecuados para TMRM y Pico Verde. Una vez que se hayan adquirido todas las imágenes, deben convertirse para su publicación aquí.

Fiji e ImageJ se utilizan con un complemento de formatos bio de loci. Se pueden encontrar más detalles sobre la conversión de videos en el texto escrito adjunto. Se realizó un ensayo de linfocitotoxicidad mediado por células o CML utilizando cromo-51, como se describe en este video.

Como se muestra aquí, el porcentaje de lisis específica indicado en el eje Y aumenta a medida que la relación de efector a blanco indicada en el eje X aumenta. Para evaluar la muerte celular mediante imágenes de células vivas, la línea celular de células beta murinas knit one fue marcada con un colorante de potencial de membrana mitocondrial, TMRM, mostrado en rojo. Las células T CD8 positivas autorreactivas I cuatro activadas fueron marcadas en verde con pico verde, y ambos tipos celulares fueron cultivados conjuntamente a una relación E:T de 50:1, como puede observarse aquí. El potencial de membrana mitocondrial de knit one se disipó gradualmente durante un periodo de 400 minutos, pero únicamente en los grupos que estaban interactuando con las células T I cuatro verdes. Como experimento de control, las células knit one marcadas fueron cultivadas en cambio con células T humanas jerkat con desajuste de MHC marcadas con pico verde, como puede verse aquí.

Las células de tipo tejido uno fueron capaces de mantener el potencial de membrana mitocondrial durante toda la duración de 400 minutos. Las células del circuito no interactuaron con los agregados de tejido uno y, por lo tanto, no indujeron la muerte celular. Una vez dominado.

Esta técnica requiere aproximadamente cinco días, incluyendo la preparación de las células. Tras observar este video, debería tener una buena comprensión de cómo cambia el potencial de membrana de las células beta cuando están bajo ataque por linfocitos T autoreactivos. No olvide que trabajar con radioisótopos puede ser peligroso y que se debe obtener la capacitación adecuada y tomar las precauciones necesarias al realizar este procedimiento.