Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

El objetivo general del siguiente procedimiento es generar rápidamente linfocitos T citotóxicos específicos de virus derivados de donante, o CTLs, que sean adecuados para transferencia adoptiva a receptores alogénicos de trasplante de células madre hematopoyéticas o HSCT. Esto se logra primero mediante la nucleofección de células dendríticas o DCs con plásmidos que codifican antígenos virales para preparar las células para la presentación de antígenos. Como segundo paso, las DCs nucleofectadas se utilizan para estimular linfocitos T específicos del antígeno, que luego se expanden en presencia de IL-4 e IL-7 en un dispositivo de cultivo permeable a los gases denominado GRE.

A continuación, tras siete días de cultivo, las células se dividen y se repasan, y su medio se renueva para mantener una expansión máxima de los CTL in vitro. Finalmente, en el día 12, las células se recolectan y se analizan en cuanto a pureza, potencia y seguridad, y se criopreservan para su uso clínico posterior. En definitiva, se pueden generar líneas de CTL con especificidad múltiple contra virus y reactividad alo inmune mínima, tal como lo demuestran la tinción intracelular de citoquinas, la producción de interferón gamma y la citotoxicidad.

La producción de líneas de linfocitos T citotóxicos específicos frente a múltiples virus lleva mucho tiempo y es complicada. Requiere el uso de líneas de células B transformadas por el virus Epstein-Barr (EP) y vectores adenovirales, y el procedimiento tarda aproximadamente tres meses. Nuestro nuevo método no utiliza vectores virales.

Las células crecen exponencialmente en cultivo con pérdida celular mínima y, por lo tanto, el procedimiento es rápido y rentable. Demostrando este procedimiento está Eureka Gerdeman, quien es becaria clínica en el laboratorio Harvest, que genera dc derivadas de monocitos en medios Cellgenic, suplementados con IL cuatro y G-M-C-S-F, y luego las madura durante 24 horas en citocinas de maduración mediante resuspensión suave con una pipeta de transferencia de tres mililitros. Utilice azul de tripano para contar las dc y luego transfiéralas a tres tubos de 15 mililitros con no menos de 0,5 × 10⁶ y no más de 2 × 10⁶ células por tubo.

A continuación, centrifugue el DCS durante 10 minutos a 200 veces G. Durante este tiempo, prepare seis mililitros de medio cell genix suplementado con la misma mezcla de citocinas para maduración de DC que antes, y agregue dos mililitros en tres pocillos de una placa de cultivo celular de 12 pocillos. Llene los pocillos no utilizados con dos mililitros de agua estéril. Transfiera la placa a un incubador a 37 grados Celsius con 5 %CO2 para precalentarla.

Una vez que las células hayan terminado de centrifugarse, aspire los sobrenadantes y agregue los plásmidos de ADN pertinentes a cada tubo a una concentración final de cinco microgramos de ADN por tubo. Aquí, se está agregando el plásmido que codifica IE uno PP 65 al tubo número uno, heon penton al tubo número dos y E BNA uno LMP dos BZ F1 al tubo número tres reus. Suspenda las DCS y el ADN con 100 microlitros de solución de transfección nuclear.

Mezcle bien y transfiera la mezcla a cubetas de afección nuclear NU. Coloque las cubetas en el efector nuclear cuádruple D. Seleccione el programa CB uno 50 y presione inicio inmediatamente después de la afección nuclear.

Añada 500 microlitros del medio de maduración de DC PREWARM CELLGENIC a cada vial, mezcle las células pipeteando suavemente de arriba abajo dos o tres veces y transfiera las DC afectadas por nucleótidos a la placa de 12 pocillos preparada que contiene los 1,5 mililitros restantes del medio de maduración de DC precalentado. Transfiera la placa al incubador durante otras 12 a 18 horas, coseche, cuente y luego irradie las DC afectadas por nucleótidos. Lave las células una vez con 10 mililitros de medio CTL y luego resuspenda a tres veces 10 a la quinta DC por mililitro de medio. Agrupe un mínimo de 7,5 veces 10 a la quinta o 2,5 mililitros y un máximo de 15 veces 10 a la quinta o cinco mililitros de DC procedentes de las tres infecciones por nucleótidos y transfiera las DC transfectadas con plásmido agrupadas al dispositivo G Rex.

Luego coloque el dispositivo en el incubador para la preparación de las células respondedoras. Utilice las células mononucleares no adherentes que quedan después de la selección de las DC. Transfiera los respondedores a la solución de cultivo precalentada.

Lávese una vez con medio CTL reutilizable. Suspender las células en medio CTL. Contar las células y ajustarlas a una concentración de dos veces 10 a la seis células por mililitro.

Tome 15 veces 10 a la seis células o 7,5 mililitros y suplemente con las citoquinas IL-4 e IL-7. Transfiera 7,5 mililitros de PBMC al G Rex y complete el biorreactor con medio CTL hasta un volumen total de 30 mililitros. Finalmente, coloque el G REX en el incubador durante seis a siete días; en el día seis a siete, aspire 10 mililitros del medio.

Luego, mezcle los 20 mililitros restantes de medio con una pipeta de 10 mililitros. Use azul de tripano para contar las células si hay menos de 50 veces 10 a la seis células. Reponga el cultivo con medio fresco y citocinas.

Si hay más de 50 veces 10 a la seis células, retire 10 mililitros de la suspensión celular, transfiera las células a un nuevo G rex y luego agregue medio CTL fresco con citoquinas a ambos G rex y cultive las células durante cuatro a seis días adicionales para expandir las células en número suficiente, coseche y cuente las células. Luego, criopresérvese cualquier célula que no se utilice para análisis fenotípicos o funcionales para uso futuro. Resultados representativos que muestran que los plásmidos de ADN multicitónicos inducen células T específicas frente a múltiples virus, medido mediante el ensayo de manchas de interferón gamma, y que la frecuencia de células reactivas es superior a la de las líneas generadas utilizando plásmidos convencionales PHU que expresan los mismos antígenos.

La proporción óptima de DC respecto a PBMC es importante para una estimulación potente de linfocitos T, como se muestra en esta figura, donde una proporción de uno a 50 produce una reactivación subóptima en comparación con una proporción de uno a 20 entre células estimuladoras y responderoras. El cultivo de CTL en el G rex, como se observa en esta figura, favorece una expansión superior de linfocitos T en comparación con las placas convencionales de 24 pocillos. La adición de IL-4 e IL-7 a los cultivos incrementa el repertorio y la especificidad de las células expandidas, como se muestra aquí, donde la frecuencia de linfocitos T reactivos frente al péptido NLV restringido por HLA-A2 derivado de la proteína PP65 del CMV se evaluó en cultivos generados en presencia o ausencia de IL-4 y/o IL-7. Esta figura muestra una muestra representativa del fenotipo de los CTL policlonales contra múltiples virus expandidos rápidamente, que son policlonales con una mezcla de linfocitos T positivos para CD4 y positivos para CD8, de los cuales la mayoría expresan los marcadores de memoria CD45RO y CD62L. Los CTL expandidos son específicos frente a todos los antígenos estimuladores y son polifuncionales, como se evaluó mediante tinción intracelular de citocinas para detectar la producción de interferón gamma y TNF-alfa tras la estimulación con antígeno, evaluado mediante el ensayo de liberación de cromo.

Los CTL expandidos son capaces de matar específicamente dianas virales, pero no muestran actividad inespecífica contra dianas no virales con incompatibilidad de HLA, una consideración crucial de seguridad. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar rápidamente líneas de células T citotóxicas específicas para múltiples virus, compatibles con GMP y adecuadas para la transferencia adoptiva en pacientes con enfermedades asociadas a virus. La simplificación de este procedimiento debería facilitar su extensión más allá de instalaciones especializadas de fabricación y permitir que el procedimiento se convierta en el estándar de atención para pacientes inmunocomprometidos y altamente susceptibles a enfermedades asociadas a virus.