Un sistema de células de ensayo gratis Estimación de la capacidad de neutralización de GM-CSF recombinante soluble de anticuerpos con GM-CSF receptor

El objetivo general de este experimento es establecer un ensayo libre de células que cuantifique la capacidad neutralizante del autoanticuerpo contra G-M-C-S-F. Comenzamos obteniendo gusanos de seda transgénicos. Introducimos el gen humano SGMR alfa para producir SGMR alfa recombinante y procedemos a marcar la G-M-C-S-F humana recombinante mediante bioTE.

A continuación evaluamos la correlación entre el sistema libre de células y un bioensayo convencional mediante un estudio de la inhibición de la unión de G-M-C-S-F al receptor alfa de SGMR por autoanticuerpos contra G-M-C-S-F. Los resultados obtenidos demuestran una correlación significativa entre la inhibición del crecimiento en el bioensayo y la inhibición de la unión en el sistema libre de células por fracciones de IgG sérica y autoanticuerpos purificados contra G-M-C-S-F. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el bioensayo TF-1 es que este sistema permite un alto análisis con buena reproducibilidad para medir la capacidad neutralizante de los autoanticuerpos contra GM-CSF.

Dado que el autoanticuerpo contra GM-CSF causa un pronóstico primario autoinmune general, las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico. También puede aplicarse a ensayos competitivos de unión a tib utilizando receptores citocinéticos recombinantes, como los receptores para BEGF y TNFA. La demostración del procedimiento será presentada por ano, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Él desarrolló por primera vez este sistema libre de pH.

Este video muestra el gusano de seda utilizado para la producción de SGMR alfa recombinante. El primer paso consiste en amplificar el ADNc para SGMR alfa a partir de una biblioteca de ADNc de placenta humana mediante la reacción en cadena de la polimerasa con el amplicón de PCR resultante. Realice una segunda PCR para añadir una secuencia de 50 bases del extremo cinco prima del UTR del poliheatrón del virus ULA al extremo cinco prima.

Y para etiquetar un RRG, añada su etiqueta al extremo tres prima, clone el producto R de PCR amplificado en el plásmido P MSG uno uno mg, coinyecte el constructo PS GMR/línea M1 uno mg junto con el vector auxiliar PHA tres pig en huevos de la cepa de gusano de seda PNDW uno. Críe las larvas G cero emergidas hasta convertirse en mariposas a 25 grados Celsius. Luego, seleccione embriones G uno ya sea mediante apareamiento entre hermanos o con PNDW uno, basándose en la expresión de MG FP en los ojos, indicativa de gusanos de seda transgénicos portadores.

El gen alfa SGMR procede a extraer el SGMR alfa recombinante de los capullos de los gusanos de seda transgénicos con tampón fosfato que contiene 500 milimolares de cloruro de sodio y agitar a cuatro grados Celsius durante 24 horas. Centrifugar las muestras a 20.000 ×g durante 15 minutos. Para eliminar los precipitados, aplicar el líquido sobrenadante a una columna de afinidad por níquel.

Lave la columna y diluya las proteínas con un gradiente lineal de ole del 10 milimolar al 250 milimolar. Reúna las fracciones que contienen el SGMR alfa purificado y diализelas frente a solución salina tamponada con fosfato. Dialice primero las muestras con PBS.

Para eliminar el sorbitol de la preparación G-M-C-S-F, agregue un mililitro de solución fría de metadato de sodio 20 milimolar e incube la muestra durante 30 minutos en hielo y a oscuras. A continuación, agregue glicerol hasta una concentración final de 15 milimolar y realice diálisis frente a tampón de acetato de sodio 100 milimolar. Para continuar, agregue azida de biotina a la solución hasta una concentración final de cinco milimolar y mezcle durante dos horas a temperatura ambiente.

Finalmente, elimine el material no reactivo mediante diálisis frente a PBS. Recubra una placa de microtitulación con 50 microlitros de anticuerpo monoclonal anti-polihis durante la noche a cuatro grados Celsius. Lave cinco veces con PBST. A continuación, agregue 100 microlitros de una solución bloqueadora e incube durante tres horas a cuatro grados Celsius.

Nuevamente, lave cinco veces con PBST. Añada 50 microlitros de SGMR alfa en la solución de bloqueo e incube durante toda la noche a cuatro grados Celsius tras cinco lavados con PBST. Añada 25 microlitros de las muestras que contienen autoanticuerpo G-M-C-S-F y luego 25 microlitros de G-M-C-S-F biotinilado; incube durante una hora a cuatro grados Celsius.

Para formar el complejo SGMR alfa G-M-C-S-F. Continúe lavando cinco veces con PBST y luego agregue 50 microlitros de estreptavidina fosfatasa alcalina durante una hora a cuatro grados Celsius para detectar el G-M-C-S-F biotinilado unido a SGMR alfa. Lave cinco veces con PBST y agregue 50 microlitros de un sustrato de quimioluminiscencia a la solución. Incube durante una hora a temperatura ambiente y determine la actividad de quimioluminiscencia utilizando un lector de placas. En el análisis por SDS-PAGE, el SGMR alfa recombinante derivado del gusano de seda está presente tanto en formas monomérica como DME bajo condiciones no reductoras, pero únicamente en la forma monomérica bajo condiciones reductoras.

Esta mezcla recombinante de monómeros y dímeros unidos por enlaces disulfuro de SGMR alfa es funcional en un ensayo de unión competitiva. El complejo de G-M-C-S-F biotinilado con SGMR alfa muestra especificidad, ya que puede disociarse mediante la adición de diversas concentraciones de anticuerpo neutralizante, pero no de anticuerpo no neutralizante. Además, concentraciones crecientes de anticuerpos neutralizantes contra G-M-C-S-F se correlacionan positivamente con un mayor porcentaje de inhibición de la unión de manera dependiente de la dosis.

Como era de esperar, la inhibición del enlace de los anticuerpos no neutralizantes de G-M-C-S-F no fue dependiente de la dosis. Este sistema libre de células demuestra una estrecha correlación entre la inhibición del enlace de G-M-C-S-F al SGMR alfa por los autoanticuerpos contra G-M-C-S-F y los valores calculados de r igual a 0.988 y un valor de P de 0.002. La inhibición del enlace aumentó de manera dependiente de la dosis mediante los autoanticuerpos contra G-M-C-S-F.

De manera similar, la inhibición de la unión se correlacionó significativamente con la inhibición del crecimiento de la importación. Este ensayo tiene utilidad y análisis de las fracciones de IgG sérica de pacientes con PAP autoinmune, como se demuestra aquí mediante la relación entre la IC50 para el porcentaje de inhibición de unión y el porcentaje de inhibición del crecimiento por las fracciones de IgG sérica. Además, el coeficiente de variación entre experimentos indica una ventaja del sistema libre de células frente al bioensayo de inhibición del crecimiento.

Una vez dominado, este ensayo de unión de ligandos al receptor GM GSF libre de células puede completarse con éxito en 38 horas. Es importante recordar mantener la reacción, la temperatura y el tiempo de incubación. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo pudieran realizar cribados de las actividades biológicas de fármacos basados en anticuerpos nobles en lugar de utilizar bioensayos convencionales.