Name: Un sistema de células de ensayo gratis Estimación de la capacidad de neutralización de GM-CSF recombinante soluble de anticuerpos con GM-CSF receptor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprende a establecer un ensayo libre de células para cuantificar la capacidad neutralizante de autoanticuerpos GM-CSF. Este método utiliza gusanos de seda transgénicos y demuestra alta reproducibilidad para evaluar la inhibición de unión al receptor.

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Estamos muy agradecidos a K. Nakagaki, el Dr. H. Ishii, el Dr. K. Suzuki, Yamagata A., Oofusa K. por su valiosa contribución.

1. Producción y purificación de sGMRα <ol><li> Amplificar cDNA de sGMRα de placenta humana biblioteca de cDNA por reacción en cadena de polimerasa (PCR). </li><li> Añadir 50 bases 5'-UTR secuencia de final de baculovirus polihedrina y 27 RGS base de codificación de su etiqueta en el extremo 3 'a la amplificación de PCR por otro PCR. </li><li> Inserte la amplificación de PCR en un pMSG1.1MG plásmido. </li><li> Inyectar el psGMR/M1.1MG construir con el vector de ayuda pHA3PIG en los huevos de gusanos de seda PND-w1 cepa. </li><li> Trasera del cascarón G0 larvas de las polillas a 25 ° C. Seleccionar embriones G1 obtenido en el apareamiento entre hermanos o con PND-w1 para la expresión MGFP en los ojos para obtener los gusanos de seda transgénicos que llevan el gen sGMRα. </li><li> Extracto recombinante sGMRα de los capullos de gusanos de seda transgénicos con tampón fosfato que contiene NaCl 500 mm y se agita a 4 ° C durante 24 horas. </li><li> Centrifugar la muestra a 20000 g durante 15 minutos para eliminar un precipitado. </li><li> Aplicar sobrenadante a una columna de afinidad de níquel. </li><li> Lavar la columna con 10 mM imidazol, NaCl 500 mm y fosfato de sodio 20 mM, pH6.3, y eluir con un gradiente lineal de imidazol de 10 mm a 250 mm. Piscina de las fracciones que contiene el sGMRα purificada y diálisis frente a tampón fosfato salino (pH 7,4) (PBS). </li></ol> 2. Biotinilación de GM-CSF recombinante <ol><li> Retire la preparación de sorbitol por diálisis contra PBS. </li><li> Añadir 1 ml de 20 mM de sodio frío meta-peryodato solución a 4 ° C a la solución en hielo. </li><li> Incubar la muestra durante 30 minutos sobre el hielo en la oscuridad. </li><li> Agregar a la solución de glicerol a una concentración final de 15 mm. </li><li> La solución de diálisis frente a tampón acetato de sodio 100 mM (pH 5,5) </li><li> Añadir biotina hidrazida a la solución a una concentración final de 5 mM y continuamente agitar la solución durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Retire el material que no ha reaccionado por diálisis contra PBS, pH 7,4. </li></ol> 3. Una célula sin GM-CSF receptor-ligando vinculante ensayo <ol><li> Un abrigo de placas de microtitulación con 50μl de anticuerpo monoclonal anti-anticuerpos polihistidina la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar cinco veces con 500μl de PBST. </li><li> Agregar 100μl de una solución de bloqueo y se incuba durante 3 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar cinco veces con 500μl de PBST. </li><li> Añadir 50μl de sGMRα en la solución de bloqueo y se incuba durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar cinco veces con 500μl de PBST. </li><li> Añadir 25μl de las muestras que contienen GM-CSF autoanticuerpos y 25μl de biotina GM-CSF. Incubar durante 1h a 4 ° C para formar sGMRα-GM-CSF complejo. </li><li> Lavar cinco veces con 500μl de PBST. </li><li> Añadir 50μl de 0,4 mm de fosfatasa alcalina estreptavidina durante 1 hora a 4 ° C para detectar la biotina GM-CSF obligado sGMRα. </li><li> Lavar cinco veces con 500μl de PBST. </li><li> Añadir 50μl de un sustrato quimioluminiscente para la solución y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> El uso de un lector de placas de quimioluminiscencia, detectar la actividad de quimioluminiscencia. </li></ol> 4. Los resultados representativos: El primer paso en la vía de transducción de GM-CSF receptor de señal es la unión de GM-CSF a la alfa del receptor de GM-CSF en la superficie celular. Debido a que GM-CSF autoanticuerpos se une específicamente al GM-CSF y bloquear su unión al receptor in vitro 16,17, la hipótesis de que los anticuerpos inhiben esta primera reacción uniéndose directamente a GM-CSF. Como se describió previamente (Ref. 9-15), se aplicó la tecnología de transgénicos del gusano de seda para obtener una gran cantidad de sGMRα recombinante de alta pureza. Cuando el gusano de seda de origen recombinante sGMRα fue cargada en el SDS-PAGE en condiciones no reductoras, el sGMRα mostró tanto monomérica (45 kDa) y diméricas (90 kDa), las formas, mientras que sólo la forma monomérica se detectó en condiciones reductoras (fig. 1B) , lo que indica que la sGMRα recombinante era una mezcla de monómeros y reguladores disulfuro vinculados 18. Utilizando el sistema libre de células (Fig. 2A), se evaluó la inhibición de la GM-CSF unión a sGMRα por GM-CSF autoanticuerpos (Fig. 2B y 2C fig.). Estos métodos se describe en la referencia 19 por Urano et al. La inhibición del crecimiento se correlaciona estrechamente con la inhibición de la unión (r = 0,988, p = 0,002) en diversas concentraciones de los autoanticuerpos GM-CSF (Fig. 3) 19. Del mismo modo, la inhibición de la unión se correlacionó significativamente con la inhibición del crecimiento. La inhibición de la unión aumenta de manera dosis-dependiente de GM-CSF autoanticuerpos (Fig. 3B) 19. Estos dos parámetros para el suero de las fracciones IgG de los distintos pacientes se correlacionaron entre sí (r = 0,589 p = 0,006, fig. 3C). Ni inhibición de la unión ni la inhibición del crecimiento correlacionado con los valores de Kd, y por lo tanto, ambos parámetros no se vieron afectados por la afinidad de unión 19. Por lo tanto la reproducibilidad de los datos entre la unión y la grecimiento inhibición obtenidos a través de tres experimentos independientes en tres diferentes muestras se evaluó. El coeficiente de variación indica que el sistema libre de células fue más excelente que el de bioensayo (tabla 1). <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento para la producción de transgénicos sGMRα con gusanos de seda. A) Las estructuras de las 09.11 vectores de transformación. B) SDS-PAGE y Coomassie Brilliant Blue-tinción de la sGMRα purificada virtud de la reducción y las condiciones no reductoras. sGMRα, soluble GM-CSF receptor alfa; MGFP, el monstruo de la proteína verde fluorescente, BmNPVpol5'-UTR, 5 'no traducida secuencia de la región de Bombyx mori poliedrosis nuclear virus polihedrina; SV40 poliA, SV40 secuencia señal poliA; P 3xP3, 3xP3 promotor; P SER1, SER1 promotor; FiBL poliA, fibroína L-secuencia de la cadena de señal poliA, HR3, Bombyx mori poliedrosis nuclear virus HR3 potenciador. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esquema del sistema de ensayo libre de células. A) Un ensayo de unión competitiva con sGMRα producida por gusanos de seda. B) Efecto de los anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes en la inhibición de la unión de células sin sistema. C) La diferencia de la inhibición de la unión entre las diferentes concentraciones de anticuerpos neutralizantes y los anticuerpos no neutralizantes. GM-CSF, granulocitos y macrófagos factor estimulante de colonias; sGMRα, soluble GM-CSF receptor alfa, Su, RGS-Su-etiqueta; AP, la fosfatasa alcalina. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. GM-CSF inhibición de la unión de sGMRα por efecto de GM-CSF anticuerpos policlonales o el suero de las fracciones IgG de los pacientes con PAP autoinmunes. A) Relación entre la inhibición de la unión y la inhibición del crecimiento de GM-CSF autoanticuerpos. B) inhibición de la unión a varias concentraciones de GM-CSF autoanticuerpos. C) La relación entre IC 50 por ciento de inhibición de unión y la inhibición del crecimiento por ciento en el suero de las fracciones IgG 19. IC 50, 50% de la concentración inhibitoria; GM-CSF, granulocitos y macrófagos factor estimulante de colonias. <table border="1"><tbody><tr><td> Muestra </td><td> A </td><td> B </td><td> C </td></tr><tr><td colspan="4"> Inter-ensayo </td></tr><tr><td> Número de determinaciones </td><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> El valor medio (% inhibición de la unión) </td><td> 61.6 </td><td> 63.8 </td><td> 69.7 </td></tr><tr><td> El valor medio (% de inhibición del crecimiento) </td><td> 21.0 </td><td> 73.4 </td><td> 82.8 </td></tr><tr><td> Coeficiente de variación (%) (% inhibición de la unión) </td><td> 6.0 </td><td> 5.6 </td><td> 8.3 </td></tr><tr><td> Coeficiente de variación (%) (% de inhibición del crecimiento) </td><td> 64.4 </td><td> 18.3 </td><td> 10.4 </td></tr></tbody></table> Ambos ensayos se realizaron a 5 ng / ml de GM-CSF y una concentración igual a GM-CSF autoanticuerpos. Tabla 1. Comparación de coeficiente de variación entre el enlace por ciento y las inhibiciones del crecimiento obtenida a través de tres experimentos independientes.

<ol><li>Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neutralizing+capacity+of+GM-CSF+reflects+disease+severity+in+a+patient+with+pulmonary+alveolar+proteinosis+successfully+treated+with+inhaled+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF.</a> Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).</li>
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</ol>

El ensayo libre de células calcula la capacidad de neutralización de GM-CSF autoanticuerpos con una excelente reproducibilidad y rapidez. La inhibición de la unión de GM-CSF o fracciones de autoanticuerpos en suero de los pacientes IgG se evaluó en este ensayo. Los datos mostraron una correlación entre la inhibición de la unión de la prueba libre de células y la inhibición del crecimiento de un bioensayo con células TF-1, respectivamente. El bioensayo ha sido ampliamente utilizado, pero albergaba las dificultades en la ...

un sistema de células de ensayo gratis estimación de la capacidad de neutralización de gm-csf recombinante soluble de anticuerpos con gm-csf receptor

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

ANTECEDENTES: Anteriormente, hemos demostrado que la capacidad de neutralizar, pero no la concentración de GM-CSF autoanticuerpos se correlaciona con la severidad de la enfermedad en pacientes con proteinosis alveolar pulmonar autoinmune (PAP) 1-3. Como la derogación de GM-CSF en la bioactividad de pulmón es la causa probable de PAP 4,5 autoinmune, es prometedor para medir la capacidad de neutralización de anticuerpos GM-CSF para evaluar la gravedad de la enfermedad en cada paciente con PAP. Hasta ahora, la capacidad de neutralización de anticuerpos GM-CSF ha sido evaluado mediante la evaluación de la inhibición del crecimiento de las células de la médula ósea o la TF-1 las células estimuladas con GM-CSF 6-8. En el sistema de bioensayo, sin embargo, es a menudo problemático obtener datos fiables, así como para comparar los datos de diferentes laboratorios, debido a las dificultades técnicas en el mantenimiento de las células en un estado constante. OBJETIVO: Para imitar GM-CSF unión a receptores de GM-CSF en la superficie celular utilizando células libres de unión al receptor-ensayo. Métodos transgénicos gusano de seda se ha aplicado la tecnología para la obtención de una gran cantidad de soluble recombinante alfa del receptor de GM-CSF (sGMRα) de alta pureza 13.09. El sGMRα recombinante estaba contenido en las capas sericina hidrofílico de hilos de seda sin ser fusionadas a las proteínas de la seda, y por lo tanto, es fácil extraer de los capullos de buena pureza con soluciones acuosas neutras 14,15. Afortunadamente, las estructuras de oligosacáridos, que son críticos para la unión con GM-CSF, son más similares a las estructuras de sGMRα humanos que las producidas por otros insectos o levaduras. Resultados: El sistema de ensayo libre de células con sGMRα dado los datos con alta plasticidad y la fiabilidad. Unión a sGMRα GM-CSF fue dosis-dependiente inhibido por policlonal GM-CSF autoanticuerpos en una forma similar a los bioensayos con la TF-1 en las células, lo que indica que nuestra libre de células nuevo sistema de ensayo utilizando sGMRα es más útil para la medición de la actividad neutralizante de GM-CSF autoanticuerpos que el sistema de bioensayo con TF-1 de células o células humanas de médula ósea. Conclusiones: Se estableció un ensayo libre de células cuantificar la capacidad de neutralización de GM-CSF autoanticuerpos.

Se diseñó un ensayo de receptor de la célula-unión libre con el fin de estimar la unión de granulocitos y macrófagos factor estimulante de colonias (GM-CSF) a los receptores. Que nos permite evaluar la inhibición competitiva de biotina GM-CSF unión a los receptores alfa soluble GM-CSF por GM-CSF autoanticuerpos con una excelente reproducibilidad.

Un sistema de células de ensayo gratis Estimación de la capacidad de neutralización de GM-CSF recombinante soluble de anticuerpos con GM-CSF receptor

ANTECEDENTES: Previamente, demostramos que la capacidad neutralizante, pero no la concentración del autoanticuerpo contra el GM-CSF, estaba correlacionada con la enfermedad...

El objetivo general de este experimento es establecer un ensayo sin células que cuantifique la capacidad neutralizante del autoanticuerpo contra G-M-C-S-F. Comenzamos obteniendo gusanos de seda transgénicos. Introducimos el gen humano SGMR alfa para producir SGMR alfa recombinante y procedemos a marcar la G-M-C-S-F humana recombinante mediante bioTE.A continuación evaluamos la correlación entre el sistema libre de células y un bioensayo convencional mediante un estudio de la inhibición de la unión de G-M-C-S-F al receptor alfa de SGMR por autoanticuerpos contra G-M-C-S-F. Los resultados obtenidos demuestran una correlación significativa entre la inhibición del crecimiento en el bioensayo y la inhibición de la unión en el sistema libre de células por fracciones de IgG sérica y autoanticuerpos purificados contra G-M-C-S-F. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el bioensayo TF-1 es que este sistema permite un alto análisis con buena reproducibilidad para medir la capacidad neutralizante de los autoanticuerpos contra GM-CSF.Dado que el autoanticuerpo contra GM-CSF causa un pronóstico general autoinmune primario, las implicaciones de esta técnica se extie

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, demostramos un ensayo colorimétrico in vitro para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes contra vectores del virus adenoasociado recombinante 6 (rAAV6) que expresan fosfatasa alcalina en muestras de suero de ovejas. El ensayo utiliza la reacción entre el AAV que codifica un gen de fosfatasa alcalina de la placenta humana y su sustrato para generar un producto púrpura insoluble.

Ensayo de anticuerpos neutralizantes AAV basado en células: una técnica colorimétrica para detectar anticuerpos neutralizantes contra virus adenoasociados específicos en suero

Este video demuestra la diferenciación in vitro del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos o de las células T auxiliares productoras de GM-CSF (THGM). Las células T vírgenes aisladas se estimulan para su diferenciación en THGM, lo que se confirma mediante la detección de una alta producción intracelular de GM-CSF y una baja expresión de otras citocinas específicas de las células T auxiliares.

Una técnica in vitro para diferenciar las células T auxiliares productoras de GM-CSF de las células T vírgenes

Este video muestra ensayos de microneutralización para medir anticuerpos neutralizantes utilizando células de riñón canino Madin-Darby que sobreexpresan ácido siálico ligado a α2,6 en sueros humanos. Este ensayo se utiliza a menudo para la serología humana de la...

Un ensayo de microneutralización para medir los títulos de anticuerpos neutralizantes en el suero humano

Durante los últimos años, los ensayos basados ​​en células vivas se han utilizado con éxito para detectar anticuerpos contra antígenos de superficie y conformacionales. Aquí se describe un método que utiliza el flujo de alto rendimiento citometría permite el análisis de grandes cohortes de pacientes. La detección de nuevos anticuerpos será mejorar el diagnóstico y el tratamiento de trastornos del sistema inmune-mediada.

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Se describe un método para medir la activación de funciones efectoras Fc-mediada por anticuerpos dirigidos la hemaglutinina del virus de la gripe. Este análisis también pueden ser adaptado para evaluar la capacidad de inducir Inmunidad mediada por Fc de anticuerpos monoclonales o sueros policlonales dirigidos a otras glicoproteínas virales de superficie.

Un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por Fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe

Hemos expresado ectopically subunidad NR1 del receptor NMDA etiquetada con proteína verde fluorescente en células embrionarias humanas (HEK293) como antígeno para detectar autoanticuerpos contra el receptor de NMDA en la sangre de pacientes con encefalitis autoinmune. Este sencillo método puede ser adecuado para la detección de propósitos en contextos clínicos.

Un análisis de la inmunofluorescencia celular Simple para detectar autoanticuerpos contra el Receptor N-metil-D-Aspartato (NMDA) en sangre

Aquí presentamos un método de citometría de flujo basadas en células para detectar anticuerpos neutralizantes u otros factores que interfieren con la absorción celular de terapias de reemplazo de la enzima en una matriz humana, tales como líquido cefalorraquídeo (LCR) o suero humano.

Detección de anticuerpos que neutralizan la absorción celular de terapias de reemplazo enzimático con un ensayo basado en células

Aquí, presentamos un protocolo para distinguir murino granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM) linfocitos de células T CD4 + de ingenuo, incluyendo el aislamiento de las células CD4 + T de ingenuo, diferenciación de THGM, y Análisis de las células THGM diferenciadas. Este método puede ser aplicado a los estudios de la regulación y función de las células THGM.

In Vitro Diferenciación del Factor del Granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF) de ratón-producción de linfocitos de T (THGM)

Este estudio describe un método para aislar vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factores estimulantes de colonias de macrófagos de granulocitos inmunoestimulantes a partir de células madre embrionarias.

Aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos a partir de células madre embrionarias

El uso de reactivos de referencia para el ensayo de liberación de citocinas permite obtener perfiles de seguridad in vitro más reproducibles y estandarizados de los anticuerpos monoclonales inmunoterapéuticos. En este artículo describimos cómo se pueden utilizar los ensayos de liberación de citocinas junto con un panel de reactivos de referencia para predecir la seguridad de algunos anticuerpos monoclonales terapéuticos.

Uso de reactivos de referencia para confirmar la solidez de los ensayos de liberación de citocinas para la predicción de la seguridad de los anticuerpos monoclonales

Describimos una plataforma de inmunoensayo recientemente desarrollada basada en los principios de la biología sintética libre de células y la técnica dot-blot para la detección personalizable de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales.

Cell-free dot blot como plataforma de inmunoensayo práctica y adaptable para la detección de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales

Aprende a establecer un ensayo libre de células para cuantificar la capacidad neutralizante de autoanticuerpos GM-CSF. Este método utiliza gusanos de seda transgénicos y demuestra alta reproducibilidad para evaluar la inhibición de unión al receptor.

Un sistema de células de ensayo gratis Estimación de la capacidad de neutralización de GM-CSF recombinante soluble de anticuerpos con GM-CSF receptor (Video) | JoVE Journal

Un sistema de células de ensayo gratis Estimación de la capacidad de neutralización de GM-CSF recombinante soluble de anticuerpos con GM-CSF receptor

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