Name: Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprende a cuantificar la absorción de nanopartículas en tumores mediante imagen intravital en tiempo real utilizando un modelo de embrión aviar. Esta técnica permite obtener imágenes de alta resolución para evaluar la acumulación dinámica en xenoinjertos.

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Este estudio fue apoyado por CCSRI # 700537 Grant y CIHR subvención n º 84535 de JDL y los NIH / NCI subvención # CA120711-01A1-01A1 y CA120711 a AZ. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con los reglamentos y directrices del animal de Atención Institucional y el empleo Comisión de la Universidad de California en San Diego, Cuidado de Animales y Uso de la Universidad de Western Ontario.

1. La inoculación del tumor en CAM de embriones aviar <ol><li> Prepare caparazón fecundado embriones de pollo como se describe 8. </li><li> El día 9 del desarrollo embrionario, montar una micro-inyección con una aguja de calibre 18 conectada a una jeringa de 1 ml. Corte un pedazo de 5.6 pulgadas de tubo Tygon (1 / 32 "de diámetro interior de 3 / 32" de diámetro exterior, 1 / 32 "espesor de pared) e inserte con cuidado el bisel de la aguja en el tubo. Aproximadamente 5.4 pulgadas de la tubería debe se extienden desde la punta de la aguja (Figura 1a). </li><li> Llene la jeringa y el tubo con la suspensión celular. A continuación, insertar una aguja de vidrio microinyección en el extremo del tubo y retirar con cuidado las burbujas de aire. </li><li> Día 9 inyectar embriones (Figura 1b) con un alcance de disección con un iluminador con 10.000-100.000 células cancerosas como un bolo dentro de la CAM (Figura 1c). Inyecte lentamente y con cuidado las células asegurar que la aguja está en el lugar correcto para que las células para formar un bolo visible dentro de la CAM. Las células que caiga agua sobre la superficie de la CAM se pueden limpiar con aplicador Kimwipe u otros. </li><li> Volver a los embriones humidificado incubadora a 38 ° C a 60% de humedad y permitir que el tumor crezca y vascularizan (hasta 7 días). </li></ol> 2. Preparación de nanopartículas <ol><li> Para preparar la etiqueta fluorescente nanopartículas CPMV para la inyección en el embrión de pollo, diluir las nanopartículas viral (sintetizado como en 8 en PBS, pH 7,4, a una concentración de la mezcla de Vortex 100 ug / ml antes de usar y centrifugar durante un minuto para eliminar cualquier. agregados. sonicación también puede ser útil en función de los conjugados y el grado de agregación. Las existencias de CPMVs marcados con fluorescencia son estables durante al menos 1 año cuando se almacenan a 4 ° C en la oscuridad. Revise periódicamente las existencias por poner un par de gotas en un portaobjetos de vidrio y la comprobación de la fluorescencia. Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) también se puede utilizar para determinar si las partículas se mantuvo intacta después de la conjugación. </li><li> En pocas palabras, un microgramo de nanopartículas viral (en un volumen final de 2 l) se pueden agregar a las redes de cobre recubierto. A continuación, agregue un volumen igual de acetato de uranilo al 2% durante 1 minuto a microscopio electrónico (Philips EM 410). </li></ol> 3. La inyección intravenosa de fluorescencia marcado con nanopartículas viral <ol><li> El día 16, ensamblar micro-inyector como se describió anteriormente. Elaborar volumen deseado de nanopartículas viral a través de la tubería en la jeringa (&gt; 200 l). Retire con cuidado las burbujas de aire. Inserte la aguja de microinyección de vidrio en el extremo de la tubería. Asegúrese de que la aguja es tan larga y afilada como sea posible (Figura 2a). Si la aguja es demasiado contundente, que no será capaz de penetrar a través del ectodermo y no podrá penetrar en el buque. Si la aguja es demasiado fuerte, la punta se derrumbará al penetrar los tejidos. </li><li> Por vía intravenosa se inyectan 100 l de una dextrano mg / ml de fluoresceína (MW 70.000 Da, Invitrogen) en embriones portadores de tumores distales del sitio que se desea visualizar (Figura 3d). La canalización de la vena CAM éxito es evidente por la limpieza de sangre en el camino de la inyección en flujo (Figura 2b). Evaluar vascular fuga una hora después de la inyección. </li><li> Por vía intravenosa inyectar 50 l de 1 mg / ml de solución de CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV AF-647) o pegilado CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) en embriones que contienen los tumores con fuga vascular distal desde el sitio deseado ser visualizado. </li><li> Tumores de la imagen de inmediato y cada hora después de la inyección con un Zeiss examinador Z1 microscopio vertical equipado con un disco giratorio Yokogawa, Hamamatsu Imagen 9100-12 EM-CCD de la cámara. </li></ol> 4. En tiempo real intravital de imágenes <ol><li> Para montar la unidad de imagen embrión, aplique una fina capa de grasa de vacío alrededor de la circunferencia de la imagen del puerto en la parte inferior de la tapa de la unidad de imagen de embriones, y monte un cubreobjetos de 18 mm de vidrio en el puerto. </li><li> La posición del embrión de tal manera que el cubreobjetos se cubra el área deseada para la imagen. Baje lentamente la tapa hasta que el cubre sólo se pone en contacto con el embrión, y luego el tornillo de la tapa sobre la unidad para mantenerla en su lugar (figura 2c). </li><li> Agregar agua caliente a 37 ° C en la unidad de imagen embrión fuera de la cápsula que contiene el embrión, y luego poner el equipo completo en el escenario de un microscopio confocal en posición vertical con la cámara en el interior del medio ambiente equilibrado a 37 ° C. </li><li> La posición de la unidad de imagen que contiene el embrión con el microscopio de fluorescencia confocal de disco giratorio (Figura 2e). La unidad de imagen tendrá el embrión en su lugar y mantener el campo de vista fijo, mientras que la captura de imágenes, teniendo en cuenta tanto en tres dimensiones pilas Z y las imágenes con lapso de tiempo para ser capturado. Nos adquirir y analizar en tres dimensiones del tiempo-lapso imágenes utilizando Perkin Elmer (antes Improvisación) paquete de software Volocity (Figura 3a). Adquirir una alta resolución en tres dimensiones de la pila de tumor y los vasos sanguíneos circundantes para visualizar detailed análisis estructurales en determinados puntos de tiempo. Adquirir en tres dimensiones las pilas a intervalos regulares de tiempo a los puntos de mapa detallado los cambios estructurales en la vasculatura tumoral. Imágenes de tumores cada hora después de la inyección. </li><li> Cuantificar la absorción de las nanopartículas viral mediante el cálculo de la media Alexa Fluor (AF) 647 de la señal dentro de las regiones seleccionadas en el tumor o en el estroma (tejido no tumoral del área) utilizando software de cuantificación de imágenes como Volocity (Perkin Elmer). El tumor de estroma relación se calcula dividiendo la media de la señal AF 647 en el tumor durante la media de la señal de AF 647 en el estroma. Una relación tumor / estroma superior a 1 indica que las nanopartículas se está tomando por el tumor. </li></ol> 5. Los resultados representativos: En el ejemplo descrito aquí, se inyectó células HT-29 de cáncer de colon para formar un bolo de aproximadamente 1 mm de tamaño dentro de la CAM de embriones de pollo 9 días (Figura 1b). Después de la inoculación, los embriones se cultivaron durante 7 días en un incubador humidificado para permitir el crecimiento del tumor y la vascularización suficiente (Figura 1c). Los embriones fueron inyectados por vía intravenosa con un dextrano de bajo peso molecular para confirmar la vascularización del tumor, y los tumores se visualizaron con un microscopio Zeiss AxioExaminer Z1 en posición vertical (Figura 2d). Tras la administración intravenosa de CPMV AF-647 o CPMV-PEG-AF nanopartículas 647 (Figura 3a yb), de alta resolución en tiempo real microscopía confocal (Figura 2e) reveló que los dos CPMV y PEG-CPMV nanopartículas rápidamente la etiqueta de la vasculatura todo, pero la captación de CPMV-PEG por el tumor fue de aproximadamente 3 veces mayor que CPMV después de 12 horas (Figura 3a). La captación del tumor en relación de las nanopartículas se determinó utilizando el software de análisis de imagen (Volocity de Perkin Elmer). Las regiones de interés fueron seleccionados dentro y fuera del tumor (en el compartimiento del estroma) y la media de intensidad de fluorescencia de cada determinó. Los datos se expresan como la relación tumor / estroma. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Microinyección de los tumores en la CAM de un embrión aviar. (A) El aparato de microinyección se ensambla a partir de los componentes como se indica. (B) embriones de aves en el día 9 están listos para ser inoculados con el tumor cuando la CAM se ha extendido para cubrir toda la superficie. (C) En el día 16, el tumor ha crecido a un máximo de 1 cm de diámetro (línea discontinua) y está listo para la inyección de nanopartículas. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Inyección de nanopartículas y de imagen intravital. Inyección debajo de un microscopio de disección que muestran (a) la punta de la aguja microinyector lista para ser inyectada en la vena CAM y (b) la aguja microinyector inserta en la vena (indicado por la flecha) y nanopartículas inyectadas en el flujo de sangre (se observa en la limpieza de de la sangre). (C) Unidad de imagen que contiene embrión aviar con el cubreobjetos interconectados directamente con la CAM. (D) Antes de la inyección de nanopartículas, la vascularización del tumor se evaluó a través de imágenes intravital después de la inyección de fluoresceína dextrano. (E) Unidad de imagen que contiene el embrión situado en la platina de un microscopio confocal en posición vertical dentro de una temperatura regulada conjunto recinto a 37 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Intravital visualización de la absorción de nanopartículas en los tumores humanos. Los tumores se visualizan siete horas después de la inyección de (a) CPMV-AF647 y (b) CPMV-PEG-AF647. d) Escisión de tumor de embrión aviar para su posterior análisis.

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<li>Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPMV+nanoparticles+target+surface+vimentin+on+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells.</a> Nanomedicine. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

La membrana corioalantoidea (CAM) del embrión aviar es un modelo útil para evaluar la dinámica vascular y la farmacocinética de los tumores humanos. La estructura y la posición de la CAM permite la adquisición de imágenes de alta calidad y capacidad de muchos tipos de xenoinjertos de cáncer, sin procedimientos quirúrgicos invasivos. Por otra parte, xenoinjertos de cáncer de tumor implantado en la membrana corioalantoidea ser vascularizado dentro de 7 días, que ofrece un medio rápido, barato y semi-alto rendimiento-para evaluar la acumulación de nanopartículas en el tejido tumoral. Desde xenoinjertos de cáncer de implantado en el CAM de embriones de pollo sin caparazón se puede acceder a la óptica de alta resolución de un microscopio de epifluorescencia vertical o confocal, la información contextual y temporal en relación con la absorción de nanopartículas en los vasos sanguíneos del tumor se pueden obtener fácilmente. Xenoinjertos de cáncer en este modelo tienden a crecer lateralmente a través de la CAM, dando lugar a tumores que son grandes sin dejar de ser menos de 200 m de profundidad. Esto los hace especialmente adecuado para la imagen intravital porque estándar de los microscopios de epifluorescencia efectivamente puede penetrar en la masa tumoral completa. Por el contrario, los tumores implantados en cualquiera de los sitios superficiales o ortotópico en el ratón proliferan en tres dimensiones, lo que hace difícil localizar con precisión las nanopartículas en lo profundo de estos tumores por técnicas no invasivas. Hemos utilizado este modelo para evaluar la absorción de los puntos cuánticos, liposomas, nanopartículas de óxido de hierro y en una serie de xenoinjertos de tumores humanos, destacando el potencial de este modelo es adecuado para el análisis in vivo de una amplia gama de formulaciones de nanopartículas.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo Nombre / Equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Fecundado los huevos Leghorn </td><td> Criadero de Frey `s, St. Jacobs </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Herramienta rotativa Dremel </td><td> Dremel </td><td></td><td> Se puede usar cualquier modelo </td></tr><tr><td> Dremel ruedas de corte no. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Deportista nacedora </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td></td></tr><tr><td> Deportista incubadora </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td></td><td></td><td> 70% (vol / vol) </td></tr><tr><td> Poliestireno pesan barcos </td><td> VWR </td><td> 12577-01 </td><td></td></tr><tr><td> Plaza de Petri </td><td> Simport, VWR </td><td> 25378-115 </td><td></td></tr><tr><td> Rubbermaid un recipiente con tapa de goma </td><td> Guillevin </td><td> RH3-228-00-BLU </td><td> agujeros perforados en los lados </td></tr><tr><td> Vertical tirador de la pipeta </td><td> David Kopf Instruments </td><td> modelo 720 </td><td> Ajustes: 16,3 (calefacción) y 2.3 (solenoide) </td></tr><tr><td> Borosilicato de sodio tubos capilares </td><td> Sutter Instrumento </td><td> BF100-58-10 </td><td> (OD, 1,0 mm; ID 0,58 mm, 10 cm de longitud) </td></tr><tr><td> 1X Dulbecco Eagle modificado (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> De buffer fosfato salino (D-PBS) (1X), líquido </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tripsina, 0,05% (1X) con EDTA 4NA, líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 12483-020 </td><td> El calor inactiva </td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> Hausser Científico, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífugo </td><td> Eppendorf modelo 5810R </td><td> 5811 000.010 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas de punta fina </td><td> VWR </td><td> 25607-856 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon R-3603 tubos </td><td> VWR </td><td> 63009-983 </td><td> (50 pies de diámetro 1/32-inch interior, diámetro exterior 3/32-inch, espesor de la pared 1/32-inch </td></tr><tr><td> Agujas hipodérmicas para las inyecciones de calibre 18 agujas </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td> Caja de 100 </td></tr><tr><td> Jeringas de 1 ml para inyección </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> Caja de 100 </td></tr><tr><td> De fibra óptica de microscopio iluminador </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> VWR </td><td> 10805-905 </td><td></td></tr><tr><td> V. unguiculata semillas (California negro de ojos no. 5) </td><td> Burpee </td><td> 51771A </td><td></td></tr><tr><td> Las luces interiores del crecimiento </td><td> SunLite, suministro del jardinero </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metil-éster-NHS PEO4 </td><td> Atravesar </td><td> PI22341 </td><td></td></tr><tr><td> mPEG-NHS, el PEG succinimidil éster, 2000 MW </td><td> NANOCS </td><td> PEG1-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 carboxílico (succinimidil éster) </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 éster de succinimidilo * 6-isómero * </td><td> Invitrogen </td><td> O-6149 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Dibásico monohidrógeno fosfato </td><td> Sigma </td><td> 379980 </td><td> K2HPO4 (para el tampón phopshate) </td></tr><tr><td> Monobásico dihidrogenofosfato </td><td></td><td> P5655 </td><td> KH2PO4 (para el tampón phopshate) </td></tr><tr><td> Superose 6 columna de exclusión por tamaño </td><td> GE Healthcare ciencias de la vida </td><td> 17-0673-01 </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA Explorer 100 cromatógrafo </td><td> GE Amersham Pharmacia </td><td> WS-AKTA100 </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA kit de alto flujo </td><td> GE Healthcare ciencias de la vida </td><td> 18-1154-85 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrífuga </td&gt; <td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SW 28 Ti rotor </td><td> Beckman </td><td> 342204 </td><td> Basculantes </td></tr><tr><td> 50.2 Ti rotor </td><td> Beckman </td><td> 337901 </td><td> Ángulo fijo </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 unidades de filtración centrífuga </td><td> Millipore </td><td> UFC910008 </td><td> 100 kDa cortar </td></tr><tr><td> Gradiente de ex </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> dextrano, fluoresceína, 70.000 MW, aniónicos </td><td> Invitrogen </td><td> D1823 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning microscopio de fluorescencia confocal de disco </td><td> Quórum, Yokogawa CSU 10, Yokogawa </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescencia amplio campo del microscopio </td><td> Quórum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Imagen 9100-12 EM-CCD de la cámara </td><td> Quórum; Hamamatsu </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura de la unidad de caja microscopio </td><td> Plásticos de precisión </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Grasa de vacío </td><td> VWR </td><td> 59344-055 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos de vidrio circular no. 1 (18 mm) </td><td> VWR </td><td> 16004-300 </td><td></td></tr><tr><td> Volocity software </td><td> Perkin Elmer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polluelo recinto embrión </td><td></td><td> fabricados a medida </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras delicadas </td><td> VWR </td><td> 25608-203 </td><td></td></tr><tr><td> Formalina </td><td> Bioshop </td><td> FOR201.500 </td><td> Su uso en fumehood </td></tr><tr><td> De corte óptimo </td><td> Fisher, Tissue Tek </td><td> 1437365 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura (OCT) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Moldes de plástico </td><td> Pescador </td><td> 22-038217 </td><td></td></tr><tr><td> VWR VistaVision HistoBond adhesivo Diapositivas </td><td> VWR </td><td> 16004-406 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar oro con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cuchillas desechables de criostato </td><td> Pescador </td><td> 12-634-2 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica CM 3050 S </td><td> 14047033518 </td><td></td></tr></table>

evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Las tecnologías actuales para obtener imágenes de tumores, tales como ultrasonido, resonancia magnética, PET y la TC, no son capaces de producir imágenes de alta resolución para la evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores a nivel microscópico 1,2,3, destacando la utilidad de un modelo de xenoinjerto adecuado en el que llevar a cabo análisis detallados de la absorción. Aquí, nosotros usamos imágenes de alta resolución intravital para evaluar la absorción de nanopartículas en xenoinjertos de tumores humanos en una versión modificada, el modelo de embrión de pollo sin caparazón. El modelo de embrión de pollo es particularmente adecuado para estos análisis in vivo, ya que favorece el crecimiento de tumores humanos, es relativamente barato y no requiere anestesia o cirugía 4,5. Las células tumorales forma totalmente xenoinjertos vascularizados plazo de 7 días cuando se implanta en la membrana corioalantoidea (CAM) 6. Los tumores resultantes se visualizan imágenes no invasivo en tiempo real de alta resolución que puede mantenerse hasta por 72 horas con poco impacto en el host o sistemas de tumor. Las nanopartículas con una amplia gama de tamaños y formulaciones administradas distal al tumor se pueden visualizar y cuantificar, ya que el flujo a través del torrente sanguíneo, extravasación de la vasculatura del tumor con goteras, y se acumulan en el sitio del tumor. Se describe aquí el análisis de las nanopartículas derivadas de virus del mosaico del caupí (CPMV), decorado con el infrarrojo cercano tintes fluorescentes y / o polímeros de polietilenglicol (PEG) 7, 8, 9,10,11. Tras la administración intravenosa, estas nanopartículas virales son rápidamente internalizados por las células endoteliales, lo que resulta en el etiquetado global de la vasculatura, tanto fuera como dentro del tumor 7,12. PEGilación de las nanopartículas viral aumenta su vida media en plasma, extiende su tiempo en la circulación, y en última instancia, aumenta su acumulación en los tumores a través del aumento de la permeabilidad y retención (EPR) Efecto 7, 10,11. La velocidad y el grado de acumulación de nanopartículas en un tumor se mide con el tiempo el uso de software de análisis de imagen. Esta técnica proporciona un método para visualizar y cuantificar tanto la dinámica de las nanopartículas en los tumores humanos.

Se presenta un nuevo enfoque para cuantificar la localización de las nanopartículas en los vasos sanguíneos de los tumores humanos transplantados con dinámica y en tiempo real de imágenes intravital en un modelo de embrión aviar.

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Las tecnologías actuales para la obtención de imágenes de tumores, como la ecografía, la RM, la PET y la TC, son incapaces de generar imágenes de alta resolución para la evaluación de nanopartículas...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la captación de nanopartículas en tumores mediante imágenes intra vitales. Esto se logra primero desvainando y cultivando embriones aviares. El segundo paso consiste en establecer tumores xenoinjertados en la membrana corioalantoidea o CAM, y permitir que crezcan durante aproximadamente una semana.El tercer paso del procedimiento consiste en inyectar nanopartículas por vía intravenosa en el camundongo y realizar imágenes confocales intravital en tiempo real del tumor xenoinjertado. El paso final del procedimiento es extirpar y seccionar el tumor. En última instancia, la captación de nanopartículas por el tumor se cuantifica a partir de las imágenes y se puede realizar un análisis secundario del tumor.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que permite generar imágenes de alta resolución para evaluar la dinámica de la acumulación de nanopartículas en tumores a nivel microscópico. Además, mediante este sistema modelo, es posible que un solo investigador analice un número muy elevado de grupos experimentales en un plazo de dos semanas. Asimismo, la membrana corioalantoidea de los embriones de Shells es fácilmente accesible para manipulaciones físicas e imágenes no invasivas.Nuestro laboratorio se centra en el desarrollo de nanopartículas para la obtención de imágenes moleculares dirigidas y la administración de fármacos en el cáncer. Nuestra búsqueda de un modelo de xenoinjerto rápido y económico para realizar análisis detallados de captación nos llevó a utilizar embriones de pollo con cáscara. Aquí empleamos imágenes intravitales de alta resolución para evaluar la captación de nanopartículas en xenoinjertos de tumores humanos mediante un modelo modificado de embrión de pollo con cáscara.Para este protocolo, prepare y liste embriones de pollo fertilizados con cáscara al cuarto día. Utilizando el método estándar, asegúrese de que los embriones estén fertilizados y sean viables mediante la verificación de un latido cardíaco, e incúbelos a 38 grados Celsius con al menos 60 % de humedad relativa hasta el noveno día embrionario. En ese momento, los embriones estarán listos para la inoculación de células tumorales.Arme un microinyector conectando una aguja de calibre 18 a una jeringa de un mililitro con un trozo de tubo de tigón de cinco a seis pulgadas de largo. Inserte cuidadosamente el bisel de la aguja en el tubo. Aproximadamente cuatro a cinco pulgadas del tubo deben sobresalir desde la punta de la aguja.Ahora, aspire la suspensión de células tumorales a través del tubo hacia la jeringa e inviértala. Toque cuidadosamente el costado de la jeringa y presione el émbolo para eliminar cualquier burbuja de aire. A continuación, inserte una aguja de vidrio para microinyección en el extremo del tubo y presione el émbolo hasta que la suspensión celular alcance la punta de la aguja.Ahora, bajo un microscopio de disección, inyecte lentamente y con cuidado entre 10.000 y 100.000 células cancerosas en el espacio intersticial dentro de la membrana corioalantoidea. Las células deben formar un bolo visible dentro de la membrana; las células depositadas sobre la superficie de la membrana pueden eliminarse limpiando suavemente con una toallita desechable o un aplicador de algodón. A continuación, devuelva los embriones a una incubadora a 38 grados Celsius con una humedad de al menos 60 %.Se permitió que el tumor creciera y se vascularizara durante hasta siete días, alcanzando un diámetro de al menos cinco milímetros antes de la imagen. Las nanopartículas deben etiquetarse con un colorante fluorescente compatible con el microscopio intravital y almacenarse a cuatro grados Celsius en PBS, donde permanecen estables durante al menos un año. Luego, centrifugue las nanopartículas durante un minuto para sedimentar cualquier agregado antes de aspirarlas en la microjeringa. Ahora, usando PBS para diluir las nanopartículas, prepare una concentración de trabajo de un miligramo por mililitro para inyectar finalmente 50 microgramos de nanopartículas en un volumen de 50 microlitros.Ahora proceda con las inyecciones en el día 16 del desarrollo embrionario. Verifique que los tumores estén suficientemente vascularizados para seleccionar los embriones portadores de tumor más adecuados para administración intravenosa. Inyecte una dextrina fluorescente de bajo peso molecular, espectralmente distinta de las células tumorales y las nanopartículas.Luego, visualice la dextrina bajo un microscopio fluorescente y seleccione los embriones con tumores más vascularizados. Una vez seleccionados los embriones, utilice un microinyector preparado para agregar al menos 200 microlitros de las nanopartículas preparadas. Invierta la jeringa.Toque cuidadosamente el costado y presione el émbolo para eliminar cualquier burbuja de aire. Ahora, inserte una aguja larga de vidrio cónica para microinyección en el extremo del tubo y presione el émbolo hasta que la solución de nanopartículas alcance la punta de la aguja. Una aguja roma no atravesará el ectodermo, y una aguja excesivamente fina y afilada se romperá al insertarse en el tejido.A continuación, inyecte por vía intravenosa entre 30 y 200 microlitros de nanopartículas en embriones situados en el lado opuesto al que se desea visualizar, inmediatamente después de la inyección de las nanopartículas realice la imagen. Los tumores, como se describen en la siguiente sección, comienzan con la preparación de la unidad de imagen del embrión. Primero, aplique una capa fina de grasa al vacío alrededor de la circunferencia del puerto de imagen en la parte inferior de la tapa.Luego, coloque un cubreobjetos de vidrio de 18 milímetros en el puerto. Ahora cargue el embrión en la unidad de modo que el cubreobjetos quede por encima del área deseada para la obtención de imágenes. Baje lentamente la tapa de la unidad hasta que el cubreobjetos haga contacto justo con el embrión y fije la tapa en su lugar con tornillos.Ahora llene el recipiente que contiene el embrión en la unidad de imagen con agua a 37 grados Celsius. Esta unidad mantendrá al embrión en su lugar bajo el microscopio confocal de disco giratorio en el microscopio de fluorescencia confocal de disco giratorio. Verifique que la cámara ambiental esté a 37 grados Celsius.Ahora, coloque la unidad de imagen en la platina de modo que la ventana del cubreobjetos quede directamente debajo del objetivo del microscopio y continúe con la adquisición de imágenes. Adquiera series de imágenes de alta resolución del tumor y de la vasculatura circundante inmediatamente después de la inyección y a intervalos horarios.Posteriormente, las imágenes reflejarán cambios estructurales detallados que ocurren en la vasculatura tumoral. El embrión puede ser observado continuamente durante hasta 36 horas sin necesidad de cambiar el baño de agua. Para cuantificar la captación de nanopartículas virales a partir de las imágenes, utilice un paquete de software como velocity.Primero, seleccione el tumor y delimítelo del estroma circundante. La selección se facilita mediante la etiquetación del tumor con dextrina fluorescente. Ahora calcule la señal fluorescente media de las nanopartículas en el tumor y en áreas representativas del estroma adyacente.A continuación, calcule la relación de la señal media. Refuerce la selección del tumor respecto a la señal media. Refuerce la selección del estroma.Una proporción mayor que uno indica que las nanopartículas se localizan preferentemente en el tumor. Se inyectaron células de cáncer de colon HT 29 para formar un bolo de aproximadamente un milímetro de diámetro dentro de la membrana corioalantoidea del día nueve. A embriones de pollo, tras siete días de incubación, se les inyectó por vía intravenosa dextrina de bajo peso molecular para confirmar la vascularización tumoral.La administración intravenosa de nanopartículas de CPMV LOR 6 47 o CPMV LOR 6 47 pegilado, seguida de imágenes confocales en tiempo real de alta resolución, reveló que tanto las nanopartículas de CPMV como las de CPMV pegilado marcaron rápidamente todo el sistema vascular. Doce horas después de la inyección, la cuantificación de la señal fluorescente en las regiones tumorales frente a las estromales reveló que la captación del CPMV pegilado en el tumor fue aproximadamente tres veces mayor que la del CPMV. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes intravital de alta resolución para evaluar la captación de nanopartículas en xenoinjertos tumorales en un modelo de embrión aviar, desde la preparación de los embriones aviares hasta el injerto de células tumorales, la inyección intravenosa de nanopartículas y la evaluación de la captación de nanopartículas en tumores mediante imágenes confocales intravitales en tiempo real.

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