Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la captación de nanopartículas en tumores mediante imágenes intra vitales. Esto se logra primero desvainando y cultivando embriones aviares. El segundo paso consiste en establecer tumores xenoinjertados en la membrana corioalantoidea o CAM, y permitir que crezcan durante aproximadamente una semana.

El tercer paso del procedimiento consiste en inyectar nanopartículas por vía intravenosa en el camundongo y realizar imágenes confocales intravital en tiempo real del tumor xenoinjertado. El paso final del procedimiento es extirpar y seccionar el tumor. En última instancia, la captación de nanopartículas por el tumor se cuantifica a partir de las imágenes y se puede realizar un análisis secundario del tumor.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que permite generar imágenes de alta resolución para evaluar la dinámica de la acumulación de nanopartículas en tumores a nivel microscópico. Además, mediante este sistema modelo, es posible que un solo investigador analice un número muy elevado de grupos experimentales en un plazo de dos semanas. Asimismo, la membrana corioalantoidea de los embriones de Shells es fácilmente accesible para manipulaciones físicas e imágenes no invasivas.

Nuestro laboratorio se centra en el desarrollo de nanopartículas para la obtención de imágenes moleculares dirigidas y la administración de fármacos en el cáncer. Nuestra búsqueda de un modelo de xenoinjerto rápido y económico para realizar análisis detallados de captación nos llevó a utilizar embriones de pollo con cáscara. Aquí empleamos imágenes intravitales de alta resolución para evaluar la captación de nanopartículas en xenoinjertos de tumores humanos mediante un modelo modificado de embrión de pollo con cáscara.

Para este protocolo, prepare y liste embriones de pollo fertilizados con cáscara al cuarto día. Utilizando el método estándar, asegúrese de que los embriones estén fertilizados y sean viables mediante la verificación de un latido cardíaco, e incúbelos a 38 grados Celsius con al menos 60 % de humedad relativa hasta el noveno día embrionario. En ese momento, los embriones estarán listos para la inoculación de células tumorales.

Arme un microinyector conectando una aguja de calibre 18 a una jeringa de un mililitro con un trozo de tubo de tigón de cinco a seis pulgadas de largo. Inserte cuidadosamente el bisel de la aguja en el tubo. Aproximadamente cuatro a cinco pulgadas del tubo deben sobresalir desde la punta de la aguja.

Ahora, aspire la suspensión de células tumorales a través del tubo hacia la jeringa e inviértala. Toque cuidadosamente el costado de la jeringa y presione el émbolo para eliminar cualquier burbuja de aire. A continuación, inserte una aguja de vidrio para microinyección en el extremo del tubo y presione el émbolo hasta que la suspensión celular alcance la punta de la aguja.

Ahora, bajo un microscopio de disección, inyecte lentamente y con cuidado entre 10.000 y 100.000 células cancerosas en el espacio intersticial dentro de la membrana corioalantoidea. Las células deben formar un bolo visible dentro de la membrana; las células depositadas sobre la superficie de la membrana pueden eliminarse limpiando suavemente con una toallita desechable o un aplicador de algodón. A continuación, devuelva los embriones a una incubadora a 38 grados Celsius con una humedad de al menos 60 %.

Se permitió que el tumor creciera y se vascularizara durante hasta siete días, alcanzando un diámetro de al menos cinco milímetros antes de la imagen. Las nanopartículas deben etiquetarse con un colorante fluorescente compatible con el microscopio intravital y almacenarse a cuatro grados Celsius en PBS, donde permanecen estables durante al menos un año. Luego, centrifugue las nanopartículas durante un minuto para sedimentar cualquier agregado antes de aspirarlas en la microjeringa. Ahora, usando PBS para diluir las nanopartículas, prepare una concentración de trabajo de un miligramo por mililitro para inyectar finalmente 50 microgramos de nanopartículas en un volumen de 50 microlitros.

Ahora proceda con las inyecciones en el día 16 del desarrollo embrionario. Verifique que los tumores estén suficientemente vascularizados para seleccionar los embriones portadores de tumor más adecuados para administración intravenosa. Inyecte una dextrina fluorescente de bajo peso molecular, espectralmente distinta de las células tumorales y las nanopartículas.

Luego, visualice la dextrina bajo un microscopio fluorescente y seleccione los embriones con tumores más vascularizados. Una vez seleccionados los embriones, utilice un microinyector preparado para agregar al menos 200 microlitros de las nanopartículas preparadas. Invierta la jeringa.

Toque cuidadosamente el costado y presione el émbolo para eliminar cualquier burbuja de aire. Ahora, inserte una aguja larga de vidrio cónica para microinyección en el extremo del tubo y presione el émbolo hasta que la solución de nanopartículas alcance la punta de la aguja. Una aguja roma no atravesará el ectodermo, y una aguja excesivamente fina y afilada se romperá al insertarse en el tejido.

A continuación, inyecte por vía intravenosa entre 30 y 200 microlitros de nanopartículas en embriones situados en el lado opuesto al que se desea visualizar, inmediatamente después de la inyección de las nanopartículas realice la imagen. Los tumores, como se describen en la siguiente sección, comienzan con la preparación de la unidad de imagen del embrión. Primero, aplique una capa fina de grasa al vacío alrededor de la circunferencia del puerto de imagen en la parte inferior de la tapa.

Luego, coloque un cubreobjetos de vidrio de 18 milímetros en el puerto. Ahora cargue el embrión en la unidad de modo que el cubreobjetos quede por encima del área deseada para la obtención de imágenes. Baje lentamente la tapa de la unidad hasta que el cubreobjetos haga contacto justo con el embrión y fije la tapa en su lugar con tornillos.

Ahora llene el recipiente que contiene el embrión en la unidad de imagen con agua a 37 grados Celsius. Esta unidad mantendrá al embrión en su lugar bajo el microscopio confocal de disco giratorio en el microscopio de fluorescencia confocal de disco giratorio. Verifique que la cámara ambiental esté a 37 grados Celsius.

Ahora, coloque la unidad de imagen en la platina de modo que la ventana del cubreobjetos quede directamente debajo del objetivo del microscopio y continúe con la adquisición de imágenes. Adquiera series de imágenes de alta resolución del tumor y de la vasculatura circundante inmediatamente después de la inyección y a intervalos horarios.

Posteriormente, las imágenes reflejarán cambios estructurales detallados que ocurren en la vasculatura tumoral. El embrión puede ser observado continuamente durante hasta 36 horas sin necesidad de cambiar el baño de agua. Para cuantificar la captación de nanopartículas virales a partir de las imágenes, utilice un paquete de software como velocity.

Primero, seleccione el tumor y delimítelo del estroma circundante. La selección se facilita mediante la etiquetación del tumor con dextrina fluorescente. Ahora calcule la señal fluorescente media de las nanopartículas en el tumor y en áreas representativas del estroma adyacente.

A continuación, calcule la relación de la señal media. Refuerce la selección del tumor respecto a la señal media. Refuerce la selección del estroma.

Una proporción mayor que uno indica que las nanopartículas se localizan preferentemente en el tumor. Se inyectaron células de cáncer de colon HT 29 para formar un bolo de aproximadamente un milímetro de diámetro dentro de la membrana corioalantoidea del día nueve. A embriones de pollo, tras siete días de incubación, se les inyectó por vía intravenosa dextrina de bajo peso molecular para confirmar la vascularización tumoral.

La administración intravenosa de nanopartículas de CPMV LOR 6 47 o CPMV LOR 6 47 pegilado, seguida de imágenes confocales en tiempo real de alta resolución, reveló que tanto las nanopartículas de CPMV como las de CPMV pegilado marcaron rápidamente todo el sistema vascular. Doce horas después de la inyección, la cuantificación de la señal fluorescente en las regiones tumorales frente a las estromales reveló que la captación del CPMV pegilado en el tumor fue aproximadamente tres veces mayor que la del CPMV. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes intravital de alta resolución para evaluar la captación de nanopartículas en xenoinjertos tumorales en un modelo de embrión aviar, desde la preparación de los embriones aviares hasta el injerto de células tumorales, la inyección intravenosa de nanopartículas y la evaluación de la captación de nanopartículas en tumores mediante imágenes confocales intravitales en tiempo real.