La detección de óxido nítrico y el radical anión superóxido por espectroscopía de resonancia paramagnética de electrones de las células utilizando atrapadores

Soy Frederick Dina, y soy profesor asociado de farmacología en la Universidad Estatal de Ohio. En esta demostración, mostraremos la detección de óxido nítrico y superóxido provenientes de células utilizando EPR. Atrapamiento de espines.

Se ha implicado a las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno en el desarrollo de diversas enfermedades, por lo tanto, su detección en sistemas biológicos es de suma importancia. Solo unos pocos métodos confiables para la detección de especies reactivas se han empleado en sistemas biológicos, pero están limitados por la especificidad y sensibilidad. Sin embargo, la técnica de captura de espines se utiliza comúnmente para la identificación de radicales libres e implica la reacción de adición de un radical a un agente capturador de espines nitroso o a complejos metálicos, formando un aducto de espín persistente, que puede detectarse mediante espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica o EPR; los diversos aductos de radicales exhiben un espectro distintivo que puede utilizarse para identificar los radicales generados y puede proporcionar una gran cantidad de información sobre la naturaleza y la cinética de la producción de radicales.

La óxido nítrico sintasa cataliza la conversión de L-arginina a L-citrulina utilizando NADPH para producir óxido nítrico. Bajo condiciones de estrés oxidativo, la eNOS puede cambiar de la producción de óxido nítrico a superóxido en un proceso denominado desacoplamiento, que se cree que es causado por la oxidación del grupo hemo o del cofactor tetrahidrobiopterina. La regulación del óxido nítrico en sistemas biológicos es importante, ya que desempeña un papel crítico en la señalización celular, lo que resulta en funciones fisiológicas beneficiosas como la vasodilatación, pero su sobreproducción se asocia frecuentemente con condiciones inflamatorias. Por lo tanto, la detección de óxido nítrico en sistemas biológicos es importante.

Otra clase importante de moléculas señalizadoras en los sistemas biológicos son las especies reactivas de oxígeno como el óxido nítrico; las especies reactivas de oxígeno en bajas concentraciones desempeñan un papel fundamental en la regulación de la función celular, la señalización y la respuesta inmunitaria, pero en concentraciones no reguladas pueden provocar daño oxidativo celular que conduce al estrés oxidativo. El anión radical superóxido es una de las especies reactivas de oxígeno más importantes y es el precursor principal de algunas de las especies más fuertemente oxidantes que se conocen en los sistemas biológicos, como el peróxido de nitrosilo y el radical hidroxilo. Por lo tanto, la detección y/o secuestración del superóxido en sistemas biológicos es importante, ya que su generación señala el primer indicio de un estallido oxidativo antes del inicio.

Este protocolo trata con tripsina ojos con cultivos de células endoteliales aórticas bovinas según lo descrito en el procedimiento escrito. Transfiera las células a una placa de seis pocillos etiquetada e incube durante la noche a 37 grados Celsius y 5%CO2 tras la incubación.

Retire la placa de seis pocillos del incubador y aspire el medio del primero. Lave las células dos veces con un mililitro de solución salina tamponada con fosfato de Delcos o DPBS. Prepare una solución de sulfato de hierro heptahidratado 1.9 milimolar añadiendo 0.8 miligramos de sulfato de hierro a un mililitro de DPBS con cloruro de calcio y cloruro de magnesio.

Y prepare la solución de MGD añadiendo 2,7 miligramos de MGD amónico a 500 microlitros de DPBS con cloruro de calcio y cloruro de magnesio. Añada 210 microlitros de sulfato ferroso heptahidratado recién preparado 1,9 milimolar y 210 microlitros de MGD recién preparado utilizando una relación molar de uno a siete y mezcle la suspensión resultante. Añada 4,6 microlitros de ion calcio cuatro y vuelva a mezclar la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Luego incube la muestra a 37 grados Celsius durante 36 minutos. Recolecte el sobrenadante que se deposita en un tubo eppendorf. Introduzca los parámetros de adquisición de EPR: campo central de 34,27 gauss, amplitud de seis gauss y frecuencia de 9,8 gigahercios.

Dado que los parámetros variarán según el instrumento y las condiciones experimentales, consulte el texto para conocer otros parámetros utilizados en este equipo. Transfiera el sobrenatante a una celda plana para RPE, séllela con parafina y colóquela en la cavidad del espectrómetro de RPE. Registre los espectros durante aproximadamente 21 minutos con 121 escaneos y 10,4 segundos por escaneo, una vez finalizado el experimento.

Utilice el procesamiento de EPR de Bruker WIN para corregir la línea de base e integrar los espectros 2D, lo que reduce el ruido de fondo. Cabe señalar que el tiempo de escaneo y el número de escaneos pueden variar de un experimento a otro. Además, los métodos para corregir la línea de base también pueden variar de un software a otro.

Para iniciar la desacoplación de Enos, retire el medio del segundo pocillo de la placa de seis pocillos y lave las células dos veces con un mililitro de DPBS. A continuación, agregue 100 microlitros de la solución preparada de Syn uno 0,5 milimolar y complete el volumen hasta dos mililitros con DPBS que contenga 10 % de FBS. Incube las células durante dos horas a 37 grados Celsius y 5 % de CO₂ tras la incubación.

Lave las células con DPBS dos veces. A continuación, añada 210 microlitros de sulfato ferroso heptahidratado recién preparado al 2,8 milimolar y 210 microlitros de MGD al 19,6 milimolar preparado recientemente según el procedimiento anterior. Después, añada 4,6 microlitros de ion calcio cuatro al 1,9 milimolar y mezcle nuevamente la solución.

Como antes, incubar las células a 37 grados Celsius durante 36 minutos. Después de 36 minutos, recoger el sobrenadante que se deposita en un tubo einor y transferirlo a una celda plana EPR. Registrar los espectros de EPR utilizando los mismos parámetros de adquisición que antes, tras la adquisición.

Procese los datos de la misma manera antes del inicio de este protocolo. Prepare una solución stock de DMPO unimolar y PBS que contenga DTPA 0,1 milimolar. Luego, prepare una solución de un miligramo por mililitro de cuatro por 12.

Acetato de miringostato 13 o PMA en DMSO: prepare alícuotas de un mililitro de la solución stock de PMA diluyéndola a 10 microgramos por mililitro en PBS en un tubo eppendorf que contenga D-glucosa al un miligramo por mililitro y un miligramo por mililitro de albúmina. Prepare aproximadamente cinco a seis millones de células de PMN por mililitro pipeteando hacia arriba y hacia abajo en un tubo eppendorf de 1,5 mililitros. Prepare una mezcla con un volumen final de 60 microlitros que contenga aproximadamente 1,6 veces 10 a la seis células de PMN, 10 milimolar de DMPO y 0,2 microgramos por mililitro de PMA.

En este experimento, utilizaremos un espectrómetro de banda X Bruker ESP 300. Transfiera la solución a una celda plana de EPR y luego coloque la celda plana en la cavidad de EPR. Ingrese los parámetros de adquisición de EPR: campo central de 3.486 gauss, amplitud de modulación de 0,5 gauss y frecuencia de 9,8 gigahercios.

Dado que los parámetros variarán según el instrumento y las condiciones experimentales, consulte el texto para conocer los demás parámetros utilizados en este experimento para adquirir los espectros. En esta demostración, mostramos la detección de radicales de óxido nítrico y de peróxido SU utilizando dos trampas de espín diferentes: el hierro MGD y el DNPO.

Mostramos que la estimulación de las células endoteliales con ion calcio cuatro produce óxido nítrico y que el tratamiento con visto uno. Un donador de nitrito perínico puede disminuir la producción de óxido nítrico, una estimulación de neutrófilos, sin embargo, con PMA en presencia de un atrapador de espinas nitroso da un radical hidroxilo ADDA en lugar del óxido S debido a la inestabilidad del aducto de superóxido inicialmente formado. Aunque los mecanismos de atrapamiento de espinas por los nitrosos de hierro mg d son fundamentalmente los mismos, la adición de óxido nítrico al hierro MGD implica una velocidad de reacción pasada y que la forma del aducto de óxido nítrico de hierro MGD es muy estable.

De hecho, se puede congelar la solución a menos 80 grados centígrados para la adquisición posterior del espectro de RPE sin una disminución significativa en la intensidad de su señal de RPE. Por otro lado, la detección del óxido mediante la trampa de espín nitro es lenta, lo que requiere concentraciones más altas de la trampa de espín en comparación con el equivalente hierro MGD cuatro para la detección de óxido nítrico.

Se han empleado varios enfoques para detectar con éxito la forma del aducto de superóxido, que ya no demostramos en este video. El uso de una celda plana, por ejemplo, puede proporcionar una mayor intensidad de la señal del aducto de superóxido debido a una mayor densidad celular. Le animo a consultar el texto sobre este tema.

Además, en lugar de utilizar DMPO, se puede emplear un captador de espín certificado como BMPO y VMP o el MPO Nitro DAP fosforilado, lo que puede generar aductos de peróxido SU más persistentes. También se ha utilizado ciclodextrina para estabilizar los aductos de peróxido SU al emplear la captura de espines para la detección de US. Se recomienda encarecidamente adquirir inmediatamente el espectro de EP tras la generación de superóxido SU.

Por lo tanto, la detección de óxido nítrico utilizando MGD férrico es mucho más eficiente, y el principal desafío actual que enfrenta el atrapamiento de espín por PR del superóxido es alcanzar las características observadas en la formación del aducto de óxido nítrico con MGD férrico. Es decir, reactividad rápida hacia el superóxido y formación de aductos estables. Actualmente, se están llevando a cabo esfuerzos en el desarrollo de atrapadores de espín con reactividad rápida hacia el superóxido y formación de aductos de espín estables en nuestro laboratorio y también por otros grupos.