Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

El objetivo general de este procedimiento es diferenciar células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas a lo largo de la línea eritroide y silenciar un factor de transcripción particular durante la eritropoyesis ex vivo. Esto se logra primero aislado células madre y progenitoras humanas positivas para CD 34 a partir de sangre de cordón, médula ósea o sangre periférica movilizada con GCSF. El segundo paso del procedimiento consiste en diferenciar estas células madre hematopoyéticas a lo largo de la línea eritroide mediante un procedimiento de cultivo celular en cuatro etapas que combina citocinas específicas y co-cultivo sobre una capa de células estromales para imitar el microambiente de la médula ósea.

A continuación, prepare partículas de vector lentiviral que expresen una molécula HRNA contra el factor de transcripción de interés, una molécula HRA aleatorizada como control negativo y la proteína GFP para controlar la eficiencia de la infección viral. El paso final del procedimiento consiste en infectar células eritroides humanas primarias en una etapa determinada de diferenciación con partículas lentivirales. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren la proliferación celular y la diferenciación eritroide mediante el análisis de la morfología celular, la capacidad de formación de colonias de los progenitores, la producción de hemoglobina y la expresión de marcadores específicos eritroides por citometría de flujo.

La eficiencia de la infección viral se analiza midiendo la expresión de GFP mediante citometría y el silenciamiento del factor de transcripción de interés se analiza mediante RT-q-PCR. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la hematopoyesis, como el mecanismo molecular por el cual cada factor de transcripción regula la expresión génica en un entorno no transformado proporcionado por células humanas primarias. Esto es importante para comprender los procesos fundamentales de la hematopoyesis, como la determinación de linaje, la proliferación de autorrenovación o la apoptosis.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las ROI normales y su regulación a nivel molecular, también puede utilizarse como un sistema modelo para estudiar terapias dirigidas contra enfermedades derivadas de desequilibrios, crecimiento excesivo y diferenciación, incluyendo trastornos mieloproliferativos como la policitemia vera y la leucemia mieloide. El protocolo para la eritropoyesis ex vivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas hacia glóbulos rojos maduros que contienen hemoglobina consta de dos pasos: el aislamiento de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas positivas para CD34, y la diferenciación eritroide libre de suero en cultivo celular. En el primer paso, las células positivas para CD34 se aíslan de sangre de cordón, médula ósea o sangre periférica humana movilizada con GCSF mediante inmuno-selección positiva.

El segundo paso de la diferenciación eritroide libre de suero implica cultivar células positivas para CD34 en cultivo líquido. De acuerdo con un protocolo de cuatro pasos adaptado del método desarrollado inicialmente por el laboratorio DU, desde el día cero hasta el día 11, las células hematopoyéticas se cultivan en mangas de hielo suplementadas, en medio ECCO modificado que contiene hidrocortisona, factor de células madre, interleucina-3 y eritropoyetina. Luego, desde el día 11 hasta el día 15, las células eritroides se cultivan en co-cultivo sobre células mesenquimales MS5 en medio IMDM suplementado que contiene EPO, en el paso tres.

Después de recolectar los glóbulos rojos de verano para uso futuro, las células restantes se cultivan en cocultivo sobre células MS5 en medio IMDM suplementado sin citoquinas. Por último, desde el día 18 hasta el día 26, los glóbulos rojos se concentran de tres a cuatro veces y se mantienen sobre una capa de células MS5 para permitir su maduración, y se añade 10 % de FBS al medio IMDM suplementado para una mejor conservación de los glóbulos rojos cultivados. Para los fines de este artículo en video, solo demostraremos el paso dos de la diferenciación eritroide: el cultivo en cocultivo de células eritroides sobre células mesenquimales con eritropoyetina.

El aspecto más difícil de este procedimiento consiste en realizar estos pasos a gran escala: lavar y reemplazar el medio del frasco que contiene cinco células AUS para el co-cultivo y posteriormente transferir células art trade a este frasco. Por lo tanto, procesamos un frasco a la vez y mantenemos simultáneamente 2%organ. Para iniciar el co-cultivo de células eritroides sobre células mesenquimales con EPO, cuente las células eritroides utilizando trian blue para excluir las células muertas.

El día 11, la densidad celular debe ser aproximadamente 1,5 veces 10 a la seis células por mililitro; reserve alrededor de 80 mililitros de la cultura de células eritroides para el co-cultivo con células mesenquimales MS5. Precaliente el medio IMDM suplementado con PBS y el medio IMDM suplementado que contiene EPO a 37 grados Celsius. A continuación, retire del incubador cuatro de los frascos previamente preparados con células MS5 confluentes.

Lave cada matraz con 20 mililitros de un XPBS e inmediatamente agregue 80 mililitros de medio IM DM suplementado fresco que contenga EPO a cada matraz. Mantenga las células en el incubador mientras se preparan las células eritroides. Ahora transfiera las células eritroides reservadas a dos tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 1500 RRP M durante 10 minutos.

Después de desechar el sobrenadante, lave cada uno de los dos pellets celulares con 20 mililitros de medio IMDM suplementado resus, suspenda cada pellet celular en 40 mililitros de medio IMDM suplementado que contenga EP. Luego distribuya 20 mililitros de esta suspensión celular en cada uno de los cuatro frascos que contienen células MS cinco y 80 mililitros de medio. En este momento, debe tener cuatro frascos con células MS cinco confluentes que contengan 100 mililitros de células eritroides a 0,3 × 10⁶ células por mililitro. Al día siguiente, cuente las células eritroides con azul de tripano para excluir las células muertas. La densidad celular debe ser de aproximadamente 0,6 × 10⁶ células por mililitro.

Recolecte el número necesario de células para realizar pruebas que verifiquen la proliferación celular adecuada y la diferenciación eritroide. Estudiar la eritropoyesis a nivel transcripcional también requiere la capacidad de sobreexpresar o silenciar factores específicos en células eritroides primarias. En este ejemplo, se utiliza un sistema de entrega génica mediado por lentivirus para silenciar el factor de transcripción en células eritroides humanas primarias.

El protocolo para la preparación de partículas de vectores lentivirales está disponible en el manuscrito. Este video demostrará el procedimiento para la infección lentiviral de células eritroides primarias con fines de transferencia génica. Las células eritroides nucleadas pueden infectarse eficazmente en cualquier etapa de diferenciación utilizando una multiplicidad de infección de 50 a 100.

Aquí se utilizará lentivirus que expresa una T uno o un S-H-R-N-A aleatorio para infectar células eritroides en los días ocho y nueve de diferenciación usando un MOI de 52 unidades por célula. Para comenzar este procedimiento, prepare tres tubos cónicos de 15 mililitros que contengan uno por diez a la sexta de células eritroides, un tubo para cada uno: inhibición de TAL uno, control negativo aleatorio y expresión de GFP. Lave las células control con cinco mililitros de medio IMDM suplementado que contiene EPO, centrifugue a 1000 RPM durante cinco minutos y retire la mayor cantidad posible de sobrenadante.

La infección debe realizarse con cantidades mínimas de medio para permitir la máxima absorción del lentivirus por las células. Añada polibrena a una concentración final de 40 microgramos por mililitro a cada tubo de lentivirus concentrados. Añada 100 microlitros del virus concentrado preparado que contiene polibrena a cada tubo de células.

Incubar durante una hora en el incubador a 37 grados Celsius, mezclando con golpecitos de los dedos cada 10 minutos. Esto permite una distribución uniforme del virus entre las células al finalizar la incubación de una hora con 1,9 mililitros de medio IMDM suplementado que contiene EPO en cada tubo. Transferir cada muestra a una placa de seis pocillos y colocar en el incubador a 37 grados Celsius durante 24 horas.

Después de 24 horas, recolecte las células en tubos separados de 15 mililitros. Centrifúgelos a 1000 RRP M durante cinco minutos y elimine el sobrenadante. Repita la infección, agregue el virus y polibrena e incube durante una hora a 37 grados Celsius con golpecitos con el dedo.

Luego, agregue medio IMDM suplementado que contenga EPO a las células. Transfiera cada muestra a una placa de seis pocillos e incube durante 24 horas a 37 grados Celsius. Al día siguiente, transfiera las células a tres tubos cónicos de 15 mililitros y lávelas mediante centrifugación, eliminación del sobrenadante y resuspensión de las células en medio fresco seguida de centrifugación.

De nuevo, aspire el sobrenadante y resuspenda las células a una concentración de 0,2 veces 10 a la seis células por mililitro en IMDM suplementado que contiene EPO. A continuación, continúe con el procedimiento para la diferenciación eritroide; las células se cuentan cada dos días durante el protocolo de diferenciación eritroide ex vivo. Un resultado representativo en escala logarítmica muestra que las células son altamente proliferativas, como lo ilustra la amplificación de 10.000 veces.

Además, se puede observar la gema de Grunwald, por lo que la tinción para morfología se realiza cada dos días utilizando 0,05 veces 10 de las seis células desde el día cero hasta el día ocho y 0,2 veces 10 de las seis células para los demás días. Como se ilustra en esta figura, las células en etapas específicas de diferenciación muestran tamaños y morfologías reconocibles. Obsérvese el proceso de enucleación que ocurre al final de la diferenciación, a partir del día 20.

Al día 26, todas las células han perdido sus núcleos. Los ensayos de formación de colonias se utilizan para detectar progenitores hematopoyéticos tempranos y tardíos durante los primeros días de diferenciación, y los resultados se muestran aquí al día cero. Además de los progenitores eritroides, los progenitores de granulocitos y macrófagos están significativamente representados dentro de las primeras células positivas para CD34.

A medida que avanza la diferenciación, se observa que algunos GM disminuyen significativamente, y al sexto día han sido completamente reemplazados por precursores eritroides, BAUE y CAUE. También es importante destacar que del cuarto al sexto día, los precursores eritroides tempranos, BAUE, son progresivamente reemplazados por sus contrapartes más diferenciadas, CAUE. Al día 10, las células eritroides han perdido esencialmente su capacidad de formar colonias.

Se muestran aquí imágenes típicas de BFUE y CFUE. El color rojo marrón se debe a la hemoglobina presente en BFUE y CFUE. La eritropoyesis se monitorea durante la diferenciación ex vivo mediante la recolección de células en los puntos de tiempo indicados y su análisis mediante citometría de flujo o microscopía para evaluar la expresión de marcadores de superficie celular.

Aquí, las barras representan porcentajes de células positivas. Las observaciones significativas incluyen la pérdida progresiva del marcador de progenitor de células madre hematopoyéticas CD 34, la adquisición y pérdida progresivas del marcador de progenitor CD 36, la adquisición y pérdida progresivas del marcador eritroide, de progenitor y de reticulocito CD 71, y el aumento del marcador de precursor eritroide y eritrocito GPA. Otros marcadores de diferenciación eritroide incluyen la síntesis de hemoglobina a partir del día ocho, medida mediante tinción con benzidina, y la enucleación celular a partir del día 20.

Mediada por la pérdida del colorante de ADN LDS, se muestran a continuación los resultados de la transferencia génica mediada por lentivirus en proeritroblastos primarios humanos tras la inhibición del factor de transcripción. T uno, mediada por lentivirus que expresan anti T uno SHRA o un control aleatorizado SHRA. La medición de la cinética del nivel de transcritos de ARNm de T uno mediante RT qPCR R y la expresión del transcripción de T uno en relación con 18. Srna mostró que el 75 % de los transcritos de T uno se inhibieron con éxito en células eritroides primarias.

El aumento del nivel de transcripción de T uno desde el día nueve hasta el día 12 y el control aleatorizado resaltan la importancia de este factor de transcripción durante la diferenciación eritroide. Finalmente, en otro experimento, las células eritroides fueron infectadas con un lentivirus que expresa la proteína GFP. Esta figura muestra que tres días después de la infección, la mayoría de las células eritroides están expresando GFP, medido mediante fluorescencia al microscopio y mediante citometría de flujo.

Esto indica una eficiencia de infección en células eritroides primarias cercana al 100 % tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la hematopoyesis exploraran la regulación de la transcripción en la eritropoyesis humana. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diferenciar células madre y progenitoras hematopoyéticas en eritrocitos en cultivo, así como de cómo utilizar la transferencia génica mediada por lentivirus para inducir una interrupción génica eficiente en cualquier etapa de este proceso de diferenciación.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.