Name: Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Aprende a diferenciar células madre hematopoyéticas humanas en eritrocitos maduros mediante eritropoyesis ex vivo. Este protocolo utiliza vectores lentivirales para el silenciamiento del factor de transcripción TAL1 en células eritroides primarias.

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Agradecemos a L. Douay y MC Giarratana (Universidad de París VI, Francia) para el asesoramiento en la diferenciación eritroide ex vivo, D. Allan H. y Atkins (OHRI, Canadá) para proporcionar muestras de sangre (obtenida en el Hospital de Ottawa de Ética de Investigación de la Junta # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) para proporcionar a los vectores lentiviral y FJ Dilworth (OHRI, Canadá) para la lectura crítica del manuscrito. Este proyecto fue financiado por una subvención CIHR (MOP-82813) para MBCGP es un beneficiario de una investigación Ontario Fondo Computacional Becas de Formación Postdoctoral Regulomics. MB titular de la Cátedra de Investigación de Canadá en el Reglamento de la expresión génica.

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<li>Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3+has+a+nonapoptotic+function+in+erythroid+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation.</a> Blood. 103, 4310-4316 (2004).</li>
<li>Mazurier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+and+efficient+selection+of+human+transduced+primitive+hematopoietic+cells+using+the+humanized+S65T+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein.</a> Gene Ther. 5, 556-562 (1998).</li>
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</ol>

Una serie de métodos se han utilizado previamente para diferenciar las células eritroides en la cultura, con grados variables de éxito. Por ejemplo, algunos protocolos, sin co-cultivo de MS-5 permite la expansión de las células eritroides, pero no son eficientes en la producción de células completamente maduros enucleados rojos 12-17. Mientras que otros métodos permiten la enucleación eficiente, es a expensas de la proliferación de 18,19. El método que hemos utilizado aquí, inicialmente desarrollad...

lentiviral mediada por derribo durante ex vivo eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

La eritropoyesis es un sistema modelo utilizado para estudiar la diferenciación celular. Durante la eritropoyesis, pluripotentes humanas adultas células madre hematopoyéticas (HSC) se diferencian en células progenitoras oligopotent, precursores comprometidos y los glóbulos rojos maduros 1. Este proceso está regulado en gran parte a nivel de la expresión génica, en el que factores de transcripción específicos del linaje activar genes específicos, mientras que simultáneamente la represión de los genes que son específicos para otros tipos de células 2. Los estudios sobre factores de transcripción que regula la eritropoyesis se realizan a menudo con líneas celulares humanas y murinas que representan, en cierta medida, las células eritroides en las etapas de diferenciación dado 5.3. Sin embargo, líneas de células transformadas pueden imitar sólo parcialmente las células eritroides y lo más importante no permitir que un estudio de forma comprensible los cambios dinámicos que ocurren cuando las células de los avances a través de muchas etapas hacia su último destino eritroides. Por lo tanto, un reto actual sigue siendo el desarrollo de un protocolo para obtener una población relativamente homogénea de las CMH primario y las células eritroides en las diversas etapas de diferenciación en cantidades que sean suficientes para llevar a cabo la genómica y la proteómica experimentos. A continuación se describe una célula de ex vivo protocolo de cultivo para inducir la diferenciación eritroide de hematopoyéticas humanas células madre / progenitoras que han sido aislados de sangre del cordón umbilical o de médula ósea o sangre periférica movilizada para adultos con G-CSF (aféresis). Este sistema de cultivo, inicialmente desarrollado por el laboratorio de Douay 6, utiliza las citocinas y la cultura co-en las células mesenquimales para imitar el microambiente de la médula ósea. El uso de este protocolo de diferenciación in vivo ex, se observa una fuerte amplificación de los progenitores eritroides, la inducción de diferenciación exclusivamente hacia el linaje eritroide y una maduración completa a la etapa de enucleado los glóbulos rojos. Así, este sistema ofrece la oportunidad de estudiar el mecanismo molecular de la regulación transcripcional de las células madre hematopoyéticas progreso a lo largo del linaje eritroide. El estudio de la eritropoyesis en el nivel de la transcripción también se requiere la capacidad de los factores específicos de más de expresar o una caída en la enseñanza primaria las células eritroides. Para ello, se utiliza un sistema de genes lentivirus mediada por la entrega que permite que la infección eficiente de la división y que no se dividen las células 7. Aquí mostramos que somos capaces de caída de manera eficiente la TAL1 factor de transcripción en células primarias de eritroides humanos. Además, la expresión de GFP demuestra una eficiencia de la infección por lentivirus cerca del 90%. Por lo tanto, el protocolo ofrece un sistema muy útil para la caracterización de la red de regulación de factores de transcripción que la eritropoyesis control.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Protocolo para generar células maduras de la sangre humana rojo de madre hematopoyéticas / progenitores se describe. Además se describe una eficiente entrega lentiviral método para derribar el TAL1 factor de transcripción en las células eritroides primaria. La eficiencia de la administración de genes mediada por lentivirus se demuestra el uso de virus que expresan GFP.

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

La eritropoyesis es un sistema modelo comúnmente utilizado para estudiar la diferenciación celular. Durante la eritropoyesis, las células madre hematopoyéticas humanas adultas pluripotentes...

El objetivo general de este procedimiento es diferenciar células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas a lo largo de la línea eritroide y silenciar un factor de transcripción particular durante la eritropoyesis ex vivo. Esto se logra primero aislado células madre y progenitoras humanas positivas para CD 34 a partir de sangre de cordón, médula ósea o sangre periférica movilizada con GCSF. El segundo paso del procedimiento consiste en diferenciar estas células madre hematopoyéticas a lo largo de la línea eritroide mediante un procedimiento de cultivo celular en cuatro etapas que combina citocinas específicas y co-cultivo sobre una capa de células estromales para imitar el microambiente de la médula ósea.A continuación, prepare partículas de vector lentiviral que expresen una molécula HRNA contra el factor de transcripción de interés, una molécula HRA aleatorizada como control negativo y la proteína GFP para controlar la eficiencia de la infección viral. El paso final del procedimiento consiste en infectar células eritroides humanas primarias en una etapa determinada de diferenciación con partículas lentivirales. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren la prolifer

lentiviral-mediated-knockdown-during-ex-vivo-erythropoiesis-human

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, demostramos un método para realizar la transducción de vectores lentivirales de shRNA para obtener líneas celulares knockdown estables en células madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas (iHSPCs).

Knockdown de genes mediados por ARN de horquilla corta en iHSPCs in vitro: un sistema de expresión de shRNA basado en lentivirus que se entrega en iHSPCs para la eliminación de la expresión de genes específicos

Presentamos un ratón sistema de cultivo in vitro fetal eritroblasto hígado que disecciona las etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal. Este sistema facilita el análisis funcional de genes específicos en diferentes etapas de desarrollo.

Ratón Sistema Cultura Hígado Fetal de diseccionar las funciones de genes objetivo en las primeras y últimas etapas de la Terminal de la eritropoyesis

La manipulación de la expresión génica temporal en la diferenciación de células madre embrionarias (ESC) se puede lograr utilizando sistemas de genes inducibles. Sin embargo, la generación de estas líneas celulares es costosa y requiere mucho tiempo. Este protocolo logra la expresión rápida de un transgén en la diferenciación de células derivadas de ES y el posterior análisis de la diferenciación hematopoyética posterior.

Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética

Este protocolo describe la inducción eficiente de endotelio hemogénico y progenitores hematopoyéticos multipotenciales a partir de células madre pluripotentes humanas a través de la expresión forzada de factores de transcripción.

La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos

Presentamos nuestro protocolo para producir inducida por progenitores eritroides (iEPs) de fibroblastos adultos ratón usando transcripción basada en el factor dirigen linaje reprogramación (DLR).

Directo linaje reprogramación de fibroblastos de ratón adulto a progenitores eritroides

Se describen protocolos para la edición del genoma altamente eficiente de células madre hematopoyéticas murinas (HSPC) por el sistema CRISPR/Cas9 para desarrollar rápidamente sistemas de modelos de ratón con modificaciones genéticas específicas del sistema hematopoyético.

Edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9 para el estudio de células hematopoyéticas en modelos de enfermedades

Aquí proporcionamos un protocolo para el cribado de posibles factores de transcripción implicados en el desarrollo de células dendríticas (DC) mediante la transducción lentiviral de shRNA para obtener líneas celulares de derribo estables para la diferenciación in vitro de DC.

Estudio del desarrollo de células dendríticas mediante la eliminación de genes mediados por ARN de horquilla corta en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas in vitro

Utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilenimina (PEI), producimos partículas lentivirales para la expresión estable de shRNAs en células madre embrionarias humanas H9 (hESC) y células progenitoras neurales derivadas de H9 (NPC) transducidas transitoriamente con alta eficiencia.

Administración mediada por lentiviral de shRNAs a hESCs y NPCs usando polietileno de polímero catiónico de bajo costo (PEI)

El presente protocolo describe un procedimiento optimizado de cultivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para el injerto robusto de células editadas genéticamente in vivo.

Edición génica CRISPR/Cas9 de células madre y progenitoras hematopoyéticas para aplicaciones de terapia génica

El modelado de la eritropoyesis proporciona una valiosa oportunidad para comprender la importancia biológica de los actores en este proceso y para evaluar nuevos enfoques terapéuticos que puedan aliviar los defectos de diferenciación. Aquí, describimos un método simple y confiable para diferenciar de manera eficiente las células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34+ ex vivo.

Un proyecto exhaustivo para evaluar la eficacia de la eritropoyesis humana in vitro y ex vivo

Aprende a diferenciar células madre hematopoyéticas humanas en eritrocitos maduros mediante eritropoyesis ex vivo. Este protocolo utiliza vectores lentivirales para el silenciamiento del factor de transcripción TAL1 en células eritroides primarias.

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

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