Name: Análisis cuantitativo de la metástasis del cáncer utilizando un modelo de embrión aviar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-30T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende a evaluar cuantitativamente la metástasis de células tumorales humanas utilizando el modelo de membrana corioalantoica en embrión de pollo. Este método permite medir la diseminación metastásica mediante PCR específica.

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Queremos reconocer a Tyson Foods Inc. para ofrecer generosamente los huevos fertilizados. Shanna Arnold jugó un papel decisivo durante el rodaje de este protocolo. Trenis Palmer fue apoyada por los Institutos Nacionales de la Salud bajo el Premio Ruth L. Kirschstein Servicio Nacional de Investigación (F31 Instituto Nacional del Cáncer). Este trabajo fue parcialmente financiado por una beca # 700537 CCSRI a JDL y los NIH / NCI subvención # CA120711-01A1-01A1 y CA120711 a AZ.

1. La preparación de los huevos de xenoinjerto (metástasis espontánea) <ol><li> Recién puestos los huevos fertilizados de pollo se incuban en una incubadora de rotación de 10 días a 100 ° F y 60% de humedad. Los huevos se giran cuatro veces cada hora. </li><li> El día 10 en el desarrollo de los huevos se colocan a su lado en un bastidor de huevo. Una fuente de la lámpara cuello de ganso o de otro tipo de luz adecuada se utiliza para las velas de los huevos por el resplandor de la luz en la cáscara del huevo en el extremo romo del huevo donde se encuentra la sacos aéreos. </li><li> La vena corioalantoidea es ubicar y marcar. Esta vena se localiza en la parte superior de la cáscara del huevo donde se encuentra el cruce de varios grandes vasos sanguíneos. En este punto de ramificación de los vasos sanguíneos se despliega, lejos de la CAM y se une al embrión. Una caja cuadrada de 1 cm se dibuja con un lápiz en la cáscara del huevo de aproximadamente 1 cm de distancia desde el punto de ramificación de la vena. La zona, incluyendo alrededor de la plaza y se limpia con un algodón empapado en yodo. </li><li> Usando una herramienta de corte rotativo (Dremel) equipado con una piedra de carburo de silicio de molienda (parte Dremel # 84922) se perfora un agujero a través del extremo romo del huevo en la cámara de aire. El uso de este mismo instrumento se taladra un agujero en la plaza previamente dibujado en la parte superior del huevo, sin llegar a la membrana de la cáscara del huevo. Una aguja de la jeringa de calibre 25 con una fresa fina en la punta se utiliza para hacer un pequeño agujero en la membrana de la cáscara de huevo con cuidado de no romper el subyacente CAM. La CAM es posteriormente separado de la membrana de la cáscara del huevo en el área de la plaza con una suave succión creada con una pipeta automática de la ayuda provista de una pieza de ¼ "tubo Tygon colocado junto al agujero en la sacos aéreos. Al aplicar succión, una bolsa de aire debe debajo del agujero en la plaza que significa que la CAM se ha logrado caer fuera de la cáscara del huevo. Después de la CAM se ha caído, el agujero en el saco de aire y el agujero situado en la plaza cerca de la vena corioalantoidea se sella con un pedazo de cinta de la cinta de laboratorio. Los huevos se comercialicen posteriormente en una incubadora fija a 100 ° F y 60% de humedad en previsión de injerto de las células tumorales. Véase la figura 1 para una descripción secuencial. </li></ol> 2. La preparación de los huevos para la inyección intravenosa (metástasis experimental) <ol><li> Recién puestos los huevos fertilizados de pollo se incuban en una incubadora de rotación de 12 días a 100 ° F y 60% de humedad. Los huevos se giran cuatro veces cada hora. </li><li> El día 12 en el desarrollo de los huevos se colocan a su lado en un bastidor de huevo. Una fuente de la lámpara cuello de ganso o de otro tipo de luz adecuada se utiliza para las velas de los huevos por el resplandor de la luz en la cáscara del huevo en el extremo romo del huevo donde se encuentra la sacos aéreos. </li><li> La vena corioalantoidea es ubicar y marcar. Un rectángulo de 1 cm por 0,5 cm se dibuja con un lápiz en la cáscara de los huevos directamente sobre la vena. La zona, incluyendo alrededor de la plaza y se limpia con un algodón empapado en yodo. </li><li> Una pequeña ventana se crea en la cáscara del huevo en el lugar se dibuja con la broca Dremmel (# 118). La ventana se quita para exponer la membrana de la cáscara del huevo subyacente, que posteriormente se hizo transparente con una gota de aceite mineral. Vea la figura 5A para una representación gráfica. </li><li> En este punto, el agujero en el saco de aire y el agujero situado en la plaza cerca de la vena corioalantoidea se sella con un pedazo de cinta de la cinta de laboratorio. Los huevos se comercialicen posteriormente en una incubadora fija a 100 ° F y 60% de humedad a la espera de la inyección de las células tumorales. </li></ol> 3. Preparación de las células tumorales para el injerto o inyección. <ol><li> De xenoinjerto, las células tumorales se desprenden de los platos de su cultura a través de tripsina / EDTA y se lava con 10 volúmenes de tampón fosfato salino (PBS) para eliminar cualquier residuo de medios, la tripsina, o EDTA. </li><li> Para la inyección IV, las células cultivadas son separadas utilizando la disociación enzimática celular solución, y se lavaron con DMEM libre de suero. y) </li><li> Las células se contó con un hemocitómetro y se resuspendieron en PBS a 10-40 million células / ml para el injerto, o, alternativamente, se resuspendieron en DMEM libre de suero en 1 millón de células / ml para inyección IV. </li></ol> 4. Injerto de las células tumorales a la recién expuesta CAM (metástasis espontánea) <ol><li> Los huevos son retirados de la incubadora y una pequeña ventana se reduce a la ubicación de la plaza previamente dibujadas en la bolsa de aire nuevo se ha formado. Esto se hace más fácilmente con una herramienta rotativa equipada con un disco de corte (herramienta Dremel con el # 409 de la rueda de corte circular). Un par de pinzas de punta de aguja se utiliza para eliminar la pequeña sección de la cáscara del huevo y exponer la CAM subyacente. </li><li> El uso de un aplicador de algodón (marca Fisher # 23-400-001) de la CAM es erosionada 5 veces. Un poco de sangre debe ser evidente en el algodón. Inmediatamente después de dañar la CAM, 25μl de la suspensión celular se coloca en la zona dañada. El número óptimo de las células es determinada empirically pero puede variar de 0.5x10 5 a 6 1X10. La ventana en el huevo es sellado herméticamente con cinta adhesiva y los pollos se deja reposar durante 10-15 minutos con el fin de permitir que las células se asienten. Después de 15 minutos los huevos se devuelven a la incubadora estacionaria. </li><li> Los tumores pueden crecer durante 5-8 días, dependiendo de la aplicación específica y la naturaleza de la línea de células tumorales utilizan. Véase la figura 1 para una descripción secuencial. </li></ol> 5. La inyección intravenosa de las células tumorales (metástasis experimental) <ol><li> El uso de un calibre 30 100μl jeringa de insulina de la suspensión celular se inyecta en la vena alantoideo de cada embrión, los huevos fueron devueltos a una incubadora inmóvil y permaneció allí por un período adicional de 1-7 días. </li><li> En momentos distintos, el pulmón o el menor CAM se recogen de cada embrión y tratados para la detección de células tumorales, como se describe a continuación. </li></ol> 6. Tumores de la cosecha y los tejidos de pollo <ol><li> Un área de disección se prepara. El ensayo detecta las células metastásicas mediante la cuantificación de ADN humano con un enfoque de PCR de alta sensibilidad. Por tanto, es muy importante para evitar la contaminación con ADN exógeno. Disecciones se realizan en un área específica y en las disecciones de las herramientas se limpian entre cada animal. Con el fin de evitar la contaminación cruzada de las muestras en todo el proceso de disección tres series distintas de herramientas se utilizan: uno para cortar los huevos, uno para la extracción del tumor primario y otro para la eliminación de los órganos internos. Además, cuatro contenedores de lavado se utilizan para la secuencia de enjuague de las herramientas entre cada animal. En la secuencia, estas soluciones son: 1) el agua doblemente destilada, 2) agua doblemente destilada, 3) de cloro, y 4) El 70% de etanol. </li><li> Los óvulos son retirados de la incubadora estacionaria y se coloca en hielo durante 15 minutos para anestesiar y practicar la eutanasia a los animales. Las ventanas se abren de tal manera que los tumores se hacen visibles. Abrir las ventanas más grandes mediante la eliminación de algunas de la cáscara del huevo puede ser necesario. Los tumores primarios se resecan de la CAM, se pesaron y se procesaron para histología. </li><li> La chica se retira de la cáscara de huevo mediante la reducción de la capa radialmente en dos mitades iguales. El embrión se decanta de la concha cortada y se transfiere a un lado del pecho limpio pesar bote. El animal se diseca con el uso de un conjunto fresco y limpio de herramientas. El animal se abre cortando a través del esternón. Una vez que el embrión está abierto, un trozo del hígado, ya sea en el lóbulo izquierdo o derecho se recoge. Los órganos internos son posteriormente eliminados por tirando suavemente del esófago adjunta a la molleja y el corte de la visera que se conectan los órganos. Con el fin de recoger los pulmones corte de la caja torácica se abre la placa de pecho se separa y se extrae el corazón. En este punto, es posible cortar alrededor de los cuatro lados de los pulmones (la parte superior más cercano a la cabeza del lado izquierdo a lo largo de la caja torácica, la parte inferior cerca del diafragma y la parte derecha a lo largo de la tráquea). En aras de la coherencia, el mismo pulmón se recoge en cada animal. Cosecha muestras de tejido se almacenan a -20 ° C para su uso posterior o pueden ser procesados ​​de inmediato para el aislamiento de ADN. </li></ol> 7. Aislamiento de ADN genómico y análisis de PCR cuantitativa <ol><li> ADN genómico se extrae de los tejidos utilizando el SYBR Green Extract-N-Amp PCR tejido Kit (Sigma-Aldrich Catálogo # XNATRG). El ADN extraído se pueden transferir a un tubo eppendorf limpio y se almacenan a -20 ° C o utilizarse de inmediato. Es importante para diluir el ADN 1:50 en agua libre de nucleasa antes de utilizarla en la posterior reacción de PCR. Por otra parte, el ADN puede ser extraído por medio de cualquier número de protocolos estándar de extracción de ADN (Zijlstra et al., 2002). </li><li> El ADN humano se detecta en los tejidos de pollo con PCR cuantitativa específica para el consumo humano secuencias Alu. PCR cuantitativa utilizando Alu primers específicos se realiza mediante la amplificación verde SYBR del kit Exract-N-Amp. El kit de PCR viene con una mezcla de reacción que contiene 2x SYBR verde, buffer, dNTPs sales, Taq polimerasa y el anticuerpo Jumpstart Taq. La mezcla de reacción se compone en un volumen final de 15μl, con 0.4μM de cada cebador. Para la mayoría de los casos utilizando el ADN extraído diluido 1:50 proporcionará datos cuantitativos, sin embargo, la cantidad óptima de ADN puede ser necesario optimizar empíricamente. Pollo primers GAPDH se utilizó como control interno de la PCR se ejecuta bajo las siguientes condiciones para las secuencias Alu: activación de la polimerasa a 95 º C durante 2 min seguido por 30 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 63 ° C durante 30 s. , 72 ° C durante 30 s. Las condiciones de reacción para el pollo GAPDH son idénticos a los descritos para Alu sin embargo, puede ser necesario ampliar la PCR a 40 ciclos. </li><li> El análisis cuantitativo de las metástasis se realiza utilizando el método ΔΔCt comparar los grupos experimentales con un grupo control (Schmittgen y Livak, 2008;. Zijlstra et al 2,002). Por otra parte una curva estándar se pueden generar mediante una serie de dilución de las células tumorales humanas extraídas con el kit de Extract-N-Amp (Zijlstra et al., 2002). La significación estadística se evaluó mediante prueba t de Student o el análisis de varianza de los grupos control y experimental. </li></ol> 8. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. El modelo de embrión de pollo metástasis. A) Un diagrama que ilustra el panel de cuatro aparición de la modelo en la sección transversal en los pasos clave: 1. Después de 10 días de incubación. La CAM ha alcanzado casi el tamaño máximo. Las arterias y las venas son claramente visibles con la vena alantoideo posicionado en contra de la parte superior del huevo. 2. El huevo inmediatamente después de perforar dos agujeros en la cáscara del huevo: una en el lado de sacos aéreos y el punto de unión de la vena alantoideo uno. 3. La aparición después de un leve vacío se ha utilizado para evacuar a los sacos aéreos y soltar la CAM. Las células tumorales (azul) se aplican a la CAM caído. 4. Después de permitir que el injerto de las células tumorales a crecer, el tumor, junto con los tejidos del embrión de pollo se cosechan para el análisis B) Una representación de serie del modelo. 1. La incubación de los huevos., 2. Marcar la ubicación de la vena alantoideo., 3. Taladrar agujeros en la cáscara del huevo., 4. Una caída del CAM., 5. Cortar una abertura para el injerto de las células tumorales., 6. La aplicación de las células tumorales., 7. De enfriamiento de los huevos en hielo antes de la recogida de tejidos., 8. La cosecha del tumor después de 7 días de crecimiento. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Histología de los tumores de la CAM. Tejidos tomados de la membrana corioalantoidea teniendo tumor se fijó en formalina, se cortaron y se procesaron con un tricrómico. A) HEp3 tumor después de siete días de crecimiento en la CAM. B y C muestran las regiones de una magnifica muestra tanto del tumor y el estroma. D) normales CAM. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. El análisis cuantitativo longitudinal de la metástasis. Variantes de la cabeza y el cuello con carcinoma HEp3 la capacidad metastásica de alta o baja (HEp3 M (Alta) y HEp3 M (bajo), respectivamente) fueron analizados por su capacidad para difundir el uso Alu PCR. Diez animales fueron analizados en cada momento durante la duración de 7 días. Estas muestras se cuantificó con una curva estándar y expresó posteriormente como # cells/50mg tejido. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. La inhibición de las células de metástasis espontánea en animales tratados con el anticuerpo 1A5 inhibir la metástasis. Los tumores se forman con 5x10 5 células HEp3 aplicada a la medicina complementaria y alternativa del día 10 embriones. Tres días después de la aplicación de las células tumorales la mitad de los animales fueron tratados con el anticuerpo anti-CD151 1A5. Los pulmones de los animales portadores de tumores se cosecharon dos días más tarde y se somete a la PCR cuantitativa en tiempo real de aluminio. Por el contrario cuantitativas PCR en tiempo real de chGAPDH se utilizó para confirmar la presencia de cantidades equivalentes de ADN genómico de acogida (El método ΔΔCt se utilizó para comparar los dos grupos cuantitativamente (B). <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Evaluación de la detención, el crecimiento y intravasation en la cascada metastásica. Fundamentalmente, la metástasis de un órgano secundario se define por las contribuciones de los tres aspectos: paro, tasa de crecimiento, y la tasa de intravasation. Estos pueden ser cuantificados usando una combinación de metástasis experimental (A) y la metástasis espontánea (B). Usando la metástasis experimental (A) la detención se define como el número de celular detecta después de la inyección 2h. Supervivencia y el crecimiento de células detenidas se determina como el cambio en la inyección de células de puesto: 24 horas. El crecimiento se define como la tasa de proliferación durante los días 3-7. Intravasation se determina mediante la metástasis espontánea (B), donde las células del número intravasated se define como la carga de presentar metástasis en el día 7 que supera el valor predicho por el crecimiento de la carga metastásica presente en el día 6. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Visualizar la expansión de la metástasis en el CAM. HEp3 células que expresan GFP se inyecta por vía intravenosa en 12 días de desarrollo. El día 1, 3 y 5 un huevo fue sacrificado y una sección de la CAM fue fotografiada con un microscopio estereoscópico fluorescente. El fondo de color verde oscuro se crea por la cáscara del huevo, los vasos se puede ver como las líneas de negro, y las células tumorales se ven como brillantes manchas verdes.

<ol><li>Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li>
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<li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li>
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<li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li>
</ol>

El CAM de pollo se ha utilizado durante décadas como un sistema modelo para estudiar diversos aspectos de la biología del cáncer y la progresión metastásica. Evaluación de las habilidades principio metastásico se han realizado en este modelo por una variedad de grupos, incluyendo el análisis de latencia (Ghiso Aguirre et al, 1999;. Ossowski y Reich, 1983), la remodelación de tejidos (Deryugina et al, 2005;. Hahn-Dantona . et al, 1999) y metástasis (Zijlstra et al, 2008;. Zijlstra ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> 1X Dulbecco Eagle modificado (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco buffer fosfato salino (D-PBS) (1X), líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Tripsina, 0,05% (1X) con EDTA 4NA, líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Deportista nacedora </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td rowspan="2"> Estas incubadoras son algunos de los más fácilmente disponibles. Sin embargo, el vídeo se muestran los diferentes equipos. </td></tr><tr><td> Deportista incubadora </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Herramienta rotativa Dremel </td><td> Dremel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dremel ruedas de corte no. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Portable Ayuda pipeta </td><td> Pescador </td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td> Bastoncillos de algodón </td><td> Pescador </td><td> 23-400-001) </td><td></td></tr><tr><td> Los huevos fertilizados </td><td> Varios </td><td></td><td> Diferentes proveedores pueden usar muchos. Los huevos deben ser de aproximadamente 35-55 gramos. Las gallinas que establece que debe estar entre 36 y 55 semanas de edad. </td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> Hausser Científico, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> De fibra óptica de microscopio iluminador </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> 25 calibre de la aguja </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green Extract-N-Amp tejido PCR Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

análisis cuantitativo de la metástasis del cáncer utilizando un modelo de embrión aviar

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

En las células de la metástasis del cáncer de difundir el tumor primario, invaden los tejidos circundantes, y se extendió a órganos distantes. La metástasis es un proceso complejo que puede involucrar a muchos tipos de tejido, los períodos de duración variable de tiempo, y con frecuencia se producen en lo profundo de los órganos, por lo que es difícil de investigar y cuantificar. Además, la eficacia del proceso de metástasis está influido por diversas etapas de la cascada metastásica lo que hace difícil evaluar la contribución de un solo aspecto de la conducta de las células tumorales. Como consecuencia de ello, los ensayos de metástasis se realiza con frecuencia en animales de experimentación para proporcionar un contexto necesariamente realista en el que para estudiar la metástasis. Desafortunadamente, estos modelos se complica aún más por su compleja fisiología. El embrión de pollo es un único modelo in vivo que supera muchas limitaciones para el estudio de la metástasis, debido a la accesibilidad de la membrana corioalantoidea (CAM), un bien vascularizado extra-embrionarios de tejido situado debajo de la cáscara del huevo que es receptivo a los xenoinjertos de células tumorales (figura 1). Por otra parte, desde el embrión de pollo es, naturalmente, inmunodeficientes, la CAM fácilmente compatible con el injerto de tejidos normales y tumorales. Lo más importante, la CAM aviar apoya exitosamente la mayoría de características de las células del cáncer, incluido el crecimiento, la invasión, la angiogénesis y la remodelación del microambiente. Esto hace que el modelo excepcional para la investigación de las vías que conducen a la metástasis del cáncer y para predecir la respuesta del cáncer metastásico de nuevas terapias potenciales. La detección de células diseminadas por especies específicas PCR Alu hace posible evaluar cuantitativamente la metástasis en órganos que son colonizados por tan sólo 25 células. Utilizando la línea Humanos epidermoide carcinoma de células (HEp3) que utilizan este modelo para analizar la metástasis espontánea de las células del cáncer a órganos distantes, como el hígado de pollo y de pulmón. Además, utilizando el protocolo de Alu-PCR se demuestra la sensibilidad y reproducibilidad de la prueba como una herramienta para analizar y cuantificar intravasation, el arresto, la extravasación y la colonización como elementos individuales de la metástasis.

El uso de PCR cuantitativa, se demuestra cómo la bien establecida chica modelo CAM se puede utilizar para analizar cuantitativamente la metástasis de células tumorales humanas a órganos distantes.

Análisis cuantitativo de la metástasis del cáncer utilizando un modelo de embrión aviar

Durante la metástasis, las células cancerosas se diseminan desde el tumor primario, invaden los tejidos circundantes y se propagan a órganos distantes. La metástasis es un proceso complejo...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar cuantitativamente la capacidad metastásica de células cancerosas utilizando la membrana corioalantoidea o CAM como modelo de xenoinjerto. Esto se logra primero incubando huevos fertilizados hasta que desarrollen una CAM madura. El segundo paso del procedimiento consiste en inyectar intravenosamente o xenoinjertar tópicamente células tumorales en la CAM.Después de un intervalo de tiempo definido experimentalmente, se recoge el tejido para su análisis, luego se cuantifica la metástasis mediante PCR específica para humanos dirigida a la secuencia del alelo humano y se analizan los resultados. Mi nombre es Trent Palmer. Soy estudiante de posgrado en el laboratorio del Dr. Andre Zilstra.Voy a demostrar el xenoinjerto y el modelo de metástasis espontánea, mientras que mi mentor, el Dr. Zilstra, demostrará la inyección intravenosa y el modelo de metástasis experimental. La principal ventaja de esta técnica frente a los modelos existentes es la rapidez y facilidad con que un investigador puede realizar estudios cuantitativos. La metástasis de células tumorales humanas puede evaluarse cuando los investigadores preparan aproximadamente 120 animales y completan todo el protocolo desde el inicio hasta el final en un período de dos semanas.Debido a la accesibilidad del embrión de pollo y a la facilidad de manipulación, el sistema se puede extender fácilmente a otras aplicaciones ex ovo. Esto lo hemos logrado en los últimos años y es el tema de otros verticales de JoVE. Los huevos de gallina fertilizados recién puestos se incuban en una incubadora rotatoria cuatro veces por hora durante 10 días.El día 10, coloque los huevos de lado sobre una rejilla para huevos e ilumine con una fuente de luz intensa y directa la cáscara del huevo en el extremo romo, donde se encuentra la bolsa de aire. A continuación, localice el punto de bifurcación de la vena corioalantoidea. Se identifica más fácilmente rotando el huevo dentro de un ángulo de 20 grados respecto a su eje longitudinal.Para visualizar el punto en el que el vaso sanguíneo se separa del cascarón, dibuje un cuadro cuadrado de un centímetro a un centímetro de distancia del punto de bifurcación de la vena coroidea. Luego limpie el área alrededor del cuadro con un hisopo empapado en yodo. Utilizando una Dremel equipada con una piedra de molienda de carburo de silicio, primero perfore un orificio a través del extremo romo del huevo hasta llegar a la cámara de aire, y luego haga un orificio dentro del cuadrado deteniéndose antes de alcanzar la membrana del cascarón. Ahora, utilice con cuidado una aguja de 25 gauge con una rebaba fina en el extremo para retirar la membrana del cascarón correctamente. Esto no rasgará la membrana subyacente al separarla de la membrana inferior. Utilice un pipeteador automático equipado con un trozo de tubo de tigón de un cuarto de pulgada.Aplique succión suave al orificio de la bolsa de aire y verifique la presencia de un bolsillo de aire debajo del orificio en el cuadrado, lo que indica éxito. Si el émbolo se daña durante la interrupción de la membrana del cascarón, la lata no caerá de forma evidente. Cuando se realiza succión en la bolsa de aire durante la rotación del huevo, el aire que es visible justo debajo del cascarón es el que se introduce y pasa por debajo del émbolo dañado.Estos huevos no pueden utilizarse después de que se suelte la leva. Tape ambos orificios con un trozo de cinta de laboratorio y devuelva los huevos a un incubador estacionario. Los huevos ya están listos para el xenoinjerto.Comience por preparar las células tumorales para el xenoinjerto. En primer lugar, desprenda las células de sus placas de cultivo utilizando tripsina-EDTA. Termine de preparar las células midiendo su densidad con un hemocitómetro y resuspendiéndolas en PBS a una concentración de 10 a 40 millones de células por mililitro.Ahora, tras esterilizar la cabina y la herramienta Dremel con etanol, retire los huevos del incubador. Abra una ventana en la parte superior del cascarón y, utilizando un aplicador con punta de algodón, pase el algodón sobre la CAM cinco veces; debe observarse algo de sangre en el algodón sobre el área dañada. Inmediatamente, inyecte 25 microlitros de la suspensión celular, entre la mitad y un millón de células.Ahora selle la ventana con cinta de laboratorio y deje que las células se asienten durante 10 a 15 minutos. Después de 15 minutos, devuelva los huevos al incubador estacionario, donde los tumores crecerán durante cinco a ocho días. Utilizando la misma incubación demostrada en la sección dos, recoja huevos de 12 días de edad.Coloque un huevo frente a la fuente de luz para localizar y marcar la vena corioalantoidea directamente por encima del vaso. Dibuje un cuadro de un centímetro por 0,5 centímetros y limpie el área con un hisopo empapado en yodo. A continuación, utilizando un drmo equipado con una broca, haga una pequeña ventana en el cascarón del huevo en el rectángulo.Retire cuidadosamente la ventana del cascarón del huevo para exponer la membrana subyacente. Añada una gota de aceite mineral sobre la membrana expuesta, haciendo que esta se vuelva transparente. Recupere los huevos del incubador y utilice una jeringa de insulina de calibre 30.Inyecte 100 microlitros de suspensión celular en la vena aútica de cada embrión. Luego coloque un trozo de cinta adhesiva de laboratorio sobre las membranas expuestas y devuelva los huevos a una incubadora estacionaria durante los próximos uno a siete días. El pulmón o la cámara inferior se recolecta para la detección de células tumorales, como se muestra en la siguiente sección.Es fundamental realizar este paso del procedimiento en un área destinada a disecciones y con una probabilidad mínima absoluta de contacto con ADN. Para prevenir la contaminación cruzada de las muestras, utilice tres juegos separados de instrumentos para cortar el huevo, retirar el tumor primario y extraer los órganos internos antes de comenzar y entre cada disección. Lave cada juego de instrumentos una vez con lejía, una vez con etanol al 70 % y dos veces con agua doblemente destilada.Los huevos se retiran del incubador estacionario y se colocan sobre hielo durante 15 minutos. Para anestesiar y sacrificar a los animales, se abren las ventanas de modo que los tumores queden visibles. Puede ser necesario agrandar las ventanas para exponer completamente los tumores.Ahora corte los tumores primarios del cam. Utilizando un juego limpio de instrumentos, pese los tumores y prepárelos para histología. A continuación, continúe con la recolección de los órganos.Comience por retirar el pollo del cascarón. Para ello, corte el cascarón radialmente en dos mitades iguales. Luego vierta con cuidado el embrión de pollo desde el cascarón cortado.Shell también extrae dos fragmentos de membrana corioalantoidea de cada lado del cascarón del huevo utilizando una herramienta punzón y los coloca en un tubo eppendorf. Transfiera el pollito a un recipiente tipo bote sobre el esternón. Utilizando un juego limpio de instrumentos de disección, abra el embrión cortando el abdomen y el esternón, y exponga la cavidad abdominal.Primero, recolecte un trozo de hígado de cualquiera de los lóbulos derecho o izquierdo. Ahora se pueden extraer cuidadosamente los órganos mientras se cortan las vísceras que los conectan. Seleccione un pulmón y corte alrededor de sus cuatro lados para liberarlo de la caja torácica.Para mantener la consistencia, recolecte el mismo pulmón de cada animal. Si alguno de los órganos no se procesa inmediatamente, guárdelos a menos 20 grados celsius.Tras la eliminación de un xenoinjerto de tumor hepático, se aplicó un análisis histológico. Esta es una tinción tri RME del tumor Hep tres. El componente estromal del tumor es claramente evidente entre los lóbulos distintos del tumor.Aquí, las células hepáticas tres inyectadas por vía intravenosa que expresan GFP se visualizan mediante microscopía fluorescente. Un día después de la inyección intravenosa, solo son visibles células tumorales individuales dispersas; tres días después de la inyección, es evidente que el número de células está aumentando y que se están formando pequeñas colonias de células metastásicas. El grado de metástasis durante los siete días posteriores al injerto se ha cuantificado mediante PCR en tiempo real para la secuencia humana A LU.La técnica que hemos demostrado aquí hoy es un modelo de alto valor altamente cuantitativo. Una vez dominada, un experimentador puede preparar aproximadamente 30 animales por hora, y además, en un período de dos semanas, se puede analizar cuantitativamente la metástasis utilizando el modelo de embrión aviar tras su desarrollo. Esta técnica permitió a los investigadores en el campo de la biología del cáncer analizar cuantitativamente la metástasis mediante un modelo naturalmente inmunodeficiente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

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Este video describe un método de microinyección para la administración de células de cáncer de mama en el espacio perivitelino de embriones transgénicos de pez cebra. Después de la incubación, visualizamos el embrión bajo un microscopio fluorescente para observar la invasión, diseminación y metástasis de las células cancerosas.

zPDX-Análisis de invasividad: investigación del comportamiento invasivo de células de cáncer metastásico en xenoinjertos de embriones de pez cebra

En este video, describimos la implantación de células cancerosas en una membrana corioalantoidea de pollo para generar un modelo in ovo. El modelo injerta con éxito las células de cáncer de ovario para estudiar la progresión del cáncer ginecológico.

Modelado de cáncer basado en membrana corioalantoidea de pollo: un modelo in ovo para estudiar la tumorigénesis y la metástasis de las células cancerosas

Este video muestra el procedimiento de inyectar células cancerosas por vía intravenosa en la vasculatura de la membrana corioalantoidea del pollo para generar un modelo de metástasis de cáncer CAM. Las células inyectadas eventualmente forman colonias dispersas de células cancerosas individuales, lo que permite el estudio de la invasión del cáncer y la metástasis.

Inyección intravenosa de células cancerosas en la vasculatura de la membrana corioalantoidea de pollo: un procedimiento para establecer un modelo de cáncer de membrana corioalantoidea para estudiar la invasión y metástasis del cáncer

Aquí, la monitorización en tiempo real del metabolismo de las células tumorales, combinada con un modelo de metástasis de membrana corioalantoidea (CAM) de embrión de pollo in vivo, se utiliza para evaluar nuevos objetivos/agentes anticancerígenos por su capacidad para sensibilizar las células tumorales a los quimioterapéuticos que dañan el ADN.

Evaluación de la efectividad del medicamento para el cáncer Sensibilización<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

A continuación, describimos los modelos de pez cebra de xenoinjerto utilizando dos sitios de inyección diferentes, es decir, espacio perivitelino y el conducto de Cuvier, para investigar el comportamiento invasivo y para evaluar el potencial intravasación y la extravasación de células de cáncer de mama humano, respectivamente.

El comportamiento invasivo de las células del cáncer de mama humano en embriones de pez cebra

El carcinoma metastásico de células renales de células claras es una enfermedad sin un modelo animal completo para una investigación preclínica exhaustiva. Este protocolo ilustra dos nuevos modelos animales para la enfermedad: el modelo de ratón implantado ortopédicamente y el modelo de membrana corioalantoica de pollo, que demuestran metástasis pulmonar similar a los casos clínicos.

Comparación de metastática célula sin fin renal Modelo establecido en el riñón del ratón y en la membrana chorioalantoica del pollo

Presentamos el modelo de membrana corioalantoica de pollo como un modelo alternativo, trasplantable, in vivo para el injerto de líneas celulares de cáncer ginecológico y urológico y tumores derivados del paciente.

Uso de la membrana chorioalantoica de pollo en vivo modelo para estudiar cánceres ginecológicos y urológicos

El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

La inyección intravenosa de células cancerosas se usa a menudo en la investigación de metástasis, pero la carga tumoral metastásica puede ser difícil de analizar. Aquí, demostramos un modelo de metástasis de inyección en la vena de la cola e incluimos un enfoque novedoso para analizar la carga tumoral de pulmón metastásica resultante.

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Este es un método eficaz para detectar supresores o impulsores de metástasis del cáncer. Las células, transducidas con una biblioteca de expresión, se inyectan en la vasculatura de la membrana corioalantoica del pollo para formar colonias metastásicas. Las colonias que han disminuido o aumentado la invasividad se extirpan, se expanden, se reinyectan para confirmar su fenotipo y, finalmente, se analizan mediante secuenciación de alto rendimiento.

Descubrimiento de reguladores metastásicos utilizando un modelo de membrana corioalantoica intravital de pollitos rápido y cuantitativo

El ensayo CAM-Delam para evaluar la capacidad metastásica de las células cancerosas es relativamente rápido, fácil y barato. El método se puede utilizar para desentrañar los mecanismos moleculares que regulan la formación de metástasis y para la detección de fármacos. Un ensayo optimizado para analizar muestras de tumores humanos podría ser un método clínico para el tratamiento personalizado del cáncer.

Ensayo CAM-Delam para puntuar las propiedades metastásicas mediante la cuantificación de la delaminación y la capacidad de invasión de las células cancerosas

Aprende a evaluar cuantitativamente la metástasis de células tumorales humanas utilizando el modelo de membrana corioalantoica en embrión de pollo. Este método permite medir la diseminación metastásica mediante PCR específica.

Análisis cuantitativo de la metástasis del cáncer utilizando un modelo de embrión aviar

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