La secuenciación de la microflora bacteriana en la sangre periférica: Nuestra experiencia con pacientes infectados por VIH

Secuenciación de la microflora bacteriana que transloca en sangre periférica. Nuestra experiencia con pacientes infectados por VIH. Soy Marti junior y trabajo como profesora asistente en la Clínica de Enfermedades Infecciosas y Medicina Tropical de la Universidad de Milán en Italia. Y ahora les mostraremos experimentos sobre cómo detectar y secuenciar el ADN bacteriano a partir de sangre periférica de pacientes infectados por VIH.

El tracto gastrointestinal sano está colonizado por una gran variedad de microorganismos comensales que influyen en el desarrollo del sistema inmunitario humoral y celular. La microbiota queda protegida del sistema inmunitario mediante una barrera mucosa fuerte tras diversas afecciones clínicas como infecciones, tratamiento con antibióticos, complicaciones posoperatorias, así como en pacientes con carcinoma, pancreatitis y desnutrición. Se produce una alteración del tracto gastrointestinal.

La infección por VIH provoca una ruptura de la barrera gastrointestinal con una falla progresiva de la inmunidad mucosal y el paso a la circulación sistémica de bioproductos bacterianos, como el lipopolisacárido y fragmentos de ADN bacteriano, que contribuyen a la activación inmune sistémica, demostrando las fases experimentales de la detección y secuenciación del ADN bacteriano. Presentes en sangre periférica de pacientes infectados por VIH estarán Camilla ti, una especialista en enfermedades infecciosas Esther, yo, una estudiante de doctorado, y ju MariaI, una investigadora posdoctoral, todas asistentes en la clínica de Enfermedades Infecciosas y Medicina Tropical de la Universidad de Milán. Nuestro experimento tiene como objetivo identificar especies bacterianas en muestras de sangre periférica de pacientes infectados por VIH.

Vamos a utilizar sangre completa de sujetos infectados por VIH y de sujetos sanos, dado que los individuos sanos presentan una homeostasis intestinal normal. No esperamos observar microflora translocada en estos pacientes. Se recogerá sangre completa de los pacientes, seguida de la separación del plasma.

El ADN será extraído posteriormente para realizar una reacción de PCR amplia dirigida al gen ribosómico PCIC 16 s. A continuación, se realizará la purificación del producto de PCR, así como análisis de clonación y secuenciación. El primer paso de nuestro experimento es la recolección de sangre mediante venopunción, seguida de la separación del plasma.

Se extraen aproximadamente nueve mililitros de sangre completa que se depositan en tubos que contienen EDTA. Los tubos se colocan en una centrífuga a 2000 RPM durante 10 minutos. La centrifugación a temperatura ambiente permite la separación del plasma.

El ADN se extraerá ahora de nuestras muestras de plasma. Desinfecte adecuadamente la cabina, las pipetas y los materiales necesarios para el experimento con el fin de garantizar la esterilidad; coloque todos los materiales bajo luz UV durante al menos 30 minutos. Apague las luces UV, limpie los guantes con un desinfectante, remoje algunas toallas de papel en etanol y colóquelas bajo la cabina cada vez que se descarte una punta. Durante el procedimiento de extracción de ADN, limpie la pipeta sobre las toallas de papel húmedas.

Ya está listo para la extracción de ADN. El ADN se extrae utilizando un kit comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, 350 microlitros de plasma se colocan en un tubo de 2 ml con extremo cerrado.

Se utiliza agua ultrapura como control negativo. Se añaden 10 microlitros de lisosoma a una concentración final de 1 mg por ml a las muestras. Luego, las muestras se incuban durante 30 minutos.

A 37 grados Celsius, la solución A, cloroformo y la solución B se añaden luego a las muestras según las instrucciones posteriores a la centrifugación. Aparecerán tres fases distintas. Se recoge el sobrenadante y se añade al etanol, permitiendo la precipitación del ADN; la concentración de ADN se mide con un espectrofotómetro.

El siguiente paso consiste en una amplificación mediante reacción PCR que abarca un amplio rango del gen ribosómico PRIC 16 s. La PCR se realiza en una sala dedicada. Se prepara una mezcla de PCR utilizando estos reactivos. La mezcla de PCR se filtra durante 30 minutos a 500 ×g y cuatro grados Celsius con el fin de evitar posibles contaminaciones por polimerasa de bacterias ambientales.

La mezcla de PCR se divide entonces en alícuotas, según el número de muestras que necesiten amplificarse. Recuerde considerar alícuotas para los controles de reacción negativos y positivos.

El TERMOCICLADO se programa en las siguientes condiciones: 94 grados Celsius durante cinco minutos. 94 grados Celsius, 55 grados Celsius, 72 grados Celsius durante un minuto por 40 ciclos, 72 grados Celsius durante 10 minutos. La duración promedio es de tres horas.

Los productos de PCR se visualizan en un gel de agarosa al 2 %. Este es un gel de agarosa al 2 % que muestra los productos de PCR. La primera banda contiene una escalera de 100 pares de bases.

La segunda banda, un control positivo de PCR. La tercera banda contiene un control negativo de PCR. La cuarta banda muestra muestras de un paciente positivo para VIH y la quinta banda contiene una muestra de agua.

Seis muestra muestras de un individuo sano y una reacción PCR negativa. La banda siete contiene agua. La PCRIFICACIÓN es el siguiente paso.

Los productos de PCR se purifican utilizando un kit comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizan muchas columnas que contienen filtros para este paso. Los resultados de la PCR se registran en una hoja de trabajo.

Ahora vamos a proceder con la clonación utilizando la selección azul-blanca, una técnica molecular que permite detectar la inserción exitosa de ADN en un vector. El vector se transforma en células competentes bacterianas.

Las células competentes se cultivan en presencia de xal. Si la transformación tiene éxito, la colonia bacteriana será blanca. Si no, la colonia será azul.

Xal se utiliza para indicar si una célula expresa la enzima beta galactosidasa y para visualizar la transformación de colonias de E. coli; el IPTG induce la expresión de beta galactosidasa. Xal e IPTG se dispersan sobre placas que contienen ampicilina. Se prepara una mezcla de clonación que contiene productos de PCR, SALT y un vector de clonación siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se piensa que las células de E coli están sobre hielo. Luego se agrega la mezcla de clonación a las células, que posteriormente, tras una choque térmico, se siembran en placas y se incuban durante la noche a 37 grados Celsius. Tras la incubación, se desarrollan colonias blancas y azules en las placas.

Las colonias blancas son positivas para los productos de PCR. Las colonias azules son negativas para la inserción del producto de PCR. Se seleccionan 10 colonias blancas y una colonia azul.

Cada colonia se coloca en dos mililitros de caldo LB líquido. Las colonias en medio con adición de ampicilina se incuban durante la noche a 37 grados Celsius. Tras la incubación, las colonias crecidas durante la noche se utilizan para la extracción de plásmidos mediante un kit comercial de mini prep.

Se utilizan columnas mini que contienen filtros para la etapa posterior a la extracción del plásmido; los plásmidos se visualizan en un gel de AROS al 0,7%. Este es un gel de AROS al 0,7% que muestra los productos de una mini prep. La primera hendidura contiene una escala de un kilobase.

La segunda banda contiene la colonia control azul. Las bandas tres a doce contienen colonias blancas. Los resultados se registran con una hoja de trabajo; a continuación, se realiza la secuenciación y se amplifican los plásmidos.

Se prepara una mezcla utilizando estos reactivos. La mezcla de PCR se divide en alícuotas según el número de muestras que deben amplificarse. El termociclado se programa bajo las siguientes condiciones: 96 grados Celsius durante un minuto, 96 grados Celsius durante 10 segundos, 50 grados Celsius durante cinco segundos y 60 grados Celsius durante cuatro minutos.

Para 25 ciclos. La duración promedio es aproximadamente una hora. Después de la amplificación, los productos de PCR se purifican utilizando columnas que contienen filtros.

Los productos purificados se cargan en una placa, que luego se coloca en un secuenciador. Una vez que se obtiene una secuencia, se realiza un análisis mediante blast y se identifican las especies bacterianas de cada colonia. Se consideran positivas las colonias que muestran una homología de secuencia del 98 % al 100 %.

Este es un ejemplo de secuenciación bacteriana en plasma de un individuo positivo para el VIH. Nuestros resultados muestran que la translocación microbiana en la enfermedad por VIH implica una flora polimicrobiana. Hemos demostrado así que los pacientes infectados con el VIH presentan una microflora microbiana polimicrobiana elevada en la circulación sistémica.

El ADN bacteriano en sangre periférica estaba por debajo del límite de detección en nuestros individuos sanos negativos para el VIH, lo que posiblemente refleja la integridad del tracto gastrointestinal. Nuestra investigación ahora se centra en comprender e investigar el posible papel de la microflora en sangre periférica, en la inmunopatogénesis del VIH y, posiblemente, en la respuesta al tratamiento.