Name: La secuenciación de la microflora bacteriana en la sangre periférica: Nuestra experiencia con pacientes infectados por VIH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Aprenda el análisis de secuenciación del ADN bacteriano en sangre periférica de pacientes con infección por VIH. Este método permite identificar especies microbianas translocadas y comprender su impacto en el sistema inmunológico.

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Estamos muy agradecidos a Scimone Gianni por su excelente asistencia con la fabricación de video.

Manejo de las muestras de sangre infectada por VIH requiere de algunas recomendaciones importantes. Todas las muestras de sangre deben ser transportados en robusta a prueba de fugas de contenedores. Se debe tener cuidado en la recogida de la muestra para evitar la contaminación del exterior del recipiente y de cualquier documentación que acompaña la muestra. Todas las personas de procesamiento de la sangre infectada debe usar guantes. Los guantes deben ser cambiados y lavarse las manos después de la finalización del procesamiento de las muestras. Procesamiento de muestras de sangre infectadas con el VIH deben realizarse en una campana de clase II cámara de bioseguridad. Mecánicos de pipeteo debe utilizarse. El uso de agujas u otros objetos punzantes (como por ejemplo las pipetas de vidrio o tubos capilares) debe limitarse a situaciones en las que no hay otra alternativa. Superficies de laboratorio deben ser descontaminados con un desinfectante químico apropiado después de un derrame de sangre y cuando las actividades son el trabajo realizado. Los materiales contaminados utilizados deben ser descontaminados antes de su reutilización o deben ser eliminados correctamente por la vía de desechos clínicos. Todos los incidentes de exposición ocupacional a sangre o fluidos potencialmente infecciosos (es decir, aquellos que requieren precauciones universales) y debe ser tratada como una emergencia médica ya que las intervenciones deben iniciarse pronto posible para ser eficaz. El protocolo requiere 5 días para su finalización. El plazo se detalla en la Figura 1. Las especies bacterianas se identifican utilizando los métodos descritos en la Figura 2. 1. Recogida de muestras <ol><li> 9 ml de sangre entera se extrae en los tubos que contienen EDTA. </li><li> Tubos se centrifugan a 2000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente para obtener el plasma. </li><li> Plasma se recoge en un estéril de 2 ml Eppendorf-tubo. </li></ol> 2. Extracción de ADN de muestras de plasma <ol><li> Desinfectar adecuadamente cubierta, pipetas y materiales necesarios para el experimento con el fin de garantizar la esterilidad. </li><li> Posición de todos los materiales bajo luz UV por lo menos durante 30 minutos. </li><li> Limpie los guantes con un desinfectante. </li><li> Remojar algunas toallas de papel en etanol y colocarlos bajo el capó. Cada vez que un extremo se descarta limpiar la pipeta sobre las toallas de papel húmedo. </li></ol> Se extrae el ADN utilizando un kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante (Easy-ADN Kit, Invitrogen, Carlsbad CA, EE.UU.). <ol start="5"><li> 350 L de plasma se colocan en un tubo estéril de 2 ml eppendorf. </li><li> 350 L de agua ultra pura filtrada se utilizó como control negativo. </li><li> Añadir 10 l de lisozima (1mg/ml) a las muestras. </li><li> Incubar durante 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Añadir 500 l de solución de lisis y mezclar suavemente con las muestras. </li><li> Incubar durante 7 minutos a 65 ° C. </li><li> Añadir 900 l de cloroformo para las muestras. </li><li> Agitar vigorosamente hasta que las muestras están uniformemente viscosa. </li><li> Añadir 200 l de solución de precipitación y agitar vigorosamente. </li><li> Centrifugar las muestras a 10.500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente para separar las fases y formar la interfase. </li><li> Transferir la fase acuosa superior a un tubo de microcentrífuga fresco que contiene 1 ml de etanol al 100%. </li><li> Centrifugar las muestras a 10.500 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Eliminar el etanol. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 70%. </li><li> Centrifugar las muestras a la máxima velocidad durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Eliminar el etanol. El etanol residual debe ser eliminado con un pipettator. </li><li> Resuspender el precipitado en 50 L de agua ultrapura. </li><li> Lea la concentración de ADN con un espectrofotómetro. </li></ol> 3. Gen 16S rRNA PCR Amplificación por PCR se lleva a cabo como se describió previamente 9. <ol><li> Amplificar el ADN en una mezcla de reacción 100 L consta de 10 l de buffer 10X PCR, 5 l de 25 mM MgCl2, 5 l de dNTPs 2 mM totales, 1 l de imprimación M 50 RW01 (AACTGGAGGAAGGTGGGGAT), 1 l de imprimación M 50 DG74 (AGGAGGTGATCCAACCGCA), 34 L de H20 y 0,5 l de Taq polimerasa (AmpliTaq Gold, Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). </li><li> La transferencia de la mezcla de PCR en los filtros a fin de evitar la posible contaminación por bacterias de Taq polimerasa. </li><li> Filtros de centrífuga (Microcon, Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) durante 30 minutos a 500 fcr a 4 ° C. </li><li> Alícuota de la mezcla de PCR en función del número de muestras que deben ser amplificado (PCR controles positivos y negativos, y las muestras de agua que se extrae). </li><li> Use las siguientes condiciones termociclador: 94 ° C durante 10 minutos, 40 veces durante 1 minuto cada vez que a 94 ° C, 55 ° C y 72 ° C, y 10 min a 72 ° C. </li><li> Visualizar el producto de PCR en un 2% en gel de agarosa. Use escalera de 100 bp de ADN. Tamaño del producto de PCR es de alrededor de 360 ​​pb (Figura 3). </li></ol> 4. PCR Purificación del producto Sólo las muestras positivas de PCR debe ser purificado. Purificación se realiza medianteun fabricante de equipo comercial de las instrucciones siguientes (PCR PureLink MICROKIT, Invitrogen, Carlsbad CA, EE.UU.). <ol><li> Agregar 4 volúmenes de tampón de unión que contiene isopropanol por un volumen de producto de PCR. </li><li> Transferencia del producto de PCR con tampón de unión a una columna. </li><li> Centrifugar durante 1 minuto a 10.000 RCF a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la columna con el tampón de lavado con etanol. </li><li> Centrifugar durante 1 minuto a 10.000 RCF a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto a temperatura ambiente para secar la membrana de sílice y eliminar cualquier solución de lavado residual con etanol. </li><li> Añadir 10 l de agua ultrapura. </li><li> Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos a temperatura ambiente para recoger el ADN purificado. </li></ol> 5. La clonación Lisogenia caldo (LB) Preparación Plate <ol><li> Disolver 25 gr de la mezcla de LB en aproximadamente 800 ml de agua. </li><li> Llevar el volumen final de 1 L. </li><li> Añadir 15 gr de Bactoagar. </li><li> Autoclave durante 20 minutos. </li><li> Después del autoclave, removerlo vigorosamente la solución en el matraz para mezclar el agar fundido. </li><li> Enfriar la solución a 50 ° C. </li><li> Añadir ampicilina (50 mg / ml) y agitar hasta que se disuelva. </li><li> En placas a una profundidad de aproximadamente 3 mm. </li><li> Dejar las placas a temperatura ambiente. </li><li> Corre X-Gal (40mg/ml) y IPTG (100 mM) en cada placa de LB y se incuba a 37 ° C hasta que esté listo para su uso. </li></ol> La transformación de células competentes La transformación se realiza mediante las instrucciones de un fabricante de equipo después de comercial (Topo TA kit de clonación, Invitrogen, Carlsbad CA, EE.UU.). <ol><li> Prepare la mezcla de reacción de clonación (1-4 l de agua dulce producto de PCR, 1 l de solución de sal, 1 l de vectores y el agua si es necesario). </li><li> Mezcla de reacción suavemente y se incuba durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lugar la reacción en hielo. </li><li> Añadir 2 l de la reacción de la clonación en un vial de células competentes y mezclar suavemente. </li><li> Incubar en hielo durante 30 minutos. </li><li> De choque térmico de las células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Transferir inmediatamente el tubo en hielo. </li><li> Añadir 250 ml del medio. </li><li> Tape el tubo tighly y agitar el tubo horizontal a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Corre 50 L de cada transformación en un plato precalentado selectiva. </li><li> Incubar toda la noche a 37 ° C. </li></ol> Después de la incubación, las colonias de color blanco y azul se desarrollan en las placas. Las colonias blancas son positivas para la inserción de producto de PCR y las colonias azules son negativos para la inserción de producto de PCR. 6. El análisis de secuenciación La reacción de secuenciación <ol><li> Una mezcla se realiza con estos reactivos: 2,5 l de ADN, una imprimación l (5pmol / l) 1,1 l BigDye (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). </li><li> Condiciones termociclador: 96 ° C durante 1 minuto, 25 veces de 96 ° C durante 10 segundos, 55 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 4 min. </li></ol> Columna de purificación <ol><li> Para cada reacción, preparar una columna MicroSpin (Qiagen, Milán, Italia). </li><li> Invertir columna y agitar para mezclar la resina. </li><li> Quite la parte inferior de la columna, afloje la tapa de ¼ de vuelta, y la columna en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrífuga 3200 rpm durante 1 minuto. </li><li> Transferencia de columna a un tubo de microcentrífuga limpio. </li><li> Pipeta cuidadosamente toda la secuencia de reacción de PCR en el centro de la columna. </li><li> Centrífuga 3200 rpm durante 1 minuto. </li><li> ADN purificado se eluite en el tubo (20 l de agua ultrapura). </li></ol> El análisis de secuenciación <ol><li> Cargue la muestra purificada (20 l) en 96-pocillos de la placa. </li><li> La carga de la placa en el secuenciador. Secuenciadores automáticos de ADN generan un cromatograma de cuatro colores que muestra los resultados de la ejecución de la secuencia. </li><li> Entrada de la secuencia de nucleótidos como una consulta en las bases de datos públicos de secuencias. La búsqueda se realiza sobre la base de datos NCBI y servidores, con herramientas básicas de búsqueda local de alineación (BLAST). </li><li> Tenga en cuenta sólo las bacterias con homologías 98-100%. </li></ol> 7. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Cronología del procedimiento. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Diagramas de flujo del procedimiento de identificación de bacterias enteras. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. 2% en gel de agarosa que muestra una amplia gama de 16S rRNA gen PCR. El carril 1 contiene una escalera de 100 pb de ADN, el carril 2 contiene el control positivo de PCR, carril 3 muestra el control negativo de PCR. Carril 4 muestra ejemplos de un paciente VIH-positivo, y la calle 5 contiene el agua. Carril 6 SHujos de muestras de un individuo sano y una negativa reacción de PCR; carril 7 contiene agua. Sólo los pacientes con VIH positivo muestra una amplificación por PCR. Agua ultrapura utilizada como control negativo durante la etapa de extracción, indica que no hubo contaminación. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. 0,7% en gel de agarosa mostrando plásmido extraído con el procedimiento minipreparación. El carril 1 contiene una escalera de 1 kilobase ADN, carril 2 contiene la colonia de control azul, calles 3 y 12 contienen colonias de color blanco. El plásmido de la colonia azul no contiene el prospecto del producto de PCR. Todas las 10 colonias de color blanco contienen el plásmido con el inserto correcto. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Muestra un ejemplo de análisis de secuenciación de bacterias en el plasma de una persona VIH-positiva individual. Nuestros resultados muestran que la translocación microbiana en la infección por VIH supone una flora polimicrobic, que no se ve en personas VIH negativas temas, lo que sugiere el fracaso sustancial de la inmunidad intestinal en el control de la translocación de bacterias.

<ol><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li>
<li>Macpherson, A. J., Harris, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+commensal+intestinal+bacteria+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).</li>
<li>Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+intestinal+flora+in+the+treatment+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease.</a> Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).</li>
<li>Brenchley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+a+cause+of+systemic+immune+activation+in+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection.</a> Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).</li>
<li>Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+disease%3A+fallout+from+a+mucosal+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe.</a> Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).</li>
<li>Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+bacterial+DNA+correlate+with+immune+activation+and+the+magnitude+of+immune+restoration+in+persons+with+antiretroviral-treated+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection.</a> J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).</li>
<li>Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+associated+with+sustained+failure+in+CD4%2B+T-cell+reconstitution+in+HIV-infected+patients+on+long-term+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy.</a> AIDS. 22, 2035-2038 (2008).</li>
<li>Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. The 17th Conference on Reteroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA, USA, , (2010).</li>
<li>Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+primers+and+probes+for+the+16S+rRNA+gene+of+most+species+of+pathogenic+bacteria%2C+including+bacteria+found+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid.</a> J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Por la presente, muestran un protocolo de PCR / secuenciación para caracterizar la translocación de bacterias en la sangre periférica de individuos infectados con VIH.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Resultados de la más fiable se obtiene cuando se utiliza plasma con EDTA. Después de tomar muestras de sangre, el plasma se separa por centrifugación dentro de 2 / 3 horas, para evitar la hemólisis y la degradación del fragmento de ADN. Las muestras se almacenan primero a -20 ° C durante aproximadamente 5 días y luego ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Easty ADN Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K 180001 </td><td></td></tr><tr><td> Cloroformo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2432 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7203 </td><td></td><tr/><tr><td> UltraPure Waer </td><td> Invitrogen </td><td> 10977049 </td><td></td></tr><tr><td> Lisozima </td><td> Fluka </td><td> 62970 </td><td> 10 mg / ml en agua destilada </td></tr><tr><td> AmpliTaq Gold </td><td> Applied Biosystems </td><td> 26478701 </td><td></td></tr><tr><td> Microcontrolador 100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td><td></td></tr><tr><td> PCR primers </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Eppendorf </td><td> C1343 </td><td></td></tr><tr><td> ADN escalera </td><td> Invitrogen </td><td> 15628019 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink PCR kit de micro </td><td> Invitrogen </td><td> K310050 </td><td></td></tr><tr><td> Agar LB, en polvo </td><td> Invitrogen </td><td> 22700025 </td><td></td></tr><tr><td> Bactoagar </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> Invitrogen </td><td> 11593027 </td><td> 10 mg / ml en agua destilada </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520034 </td><td> 40mg/ml en DMF </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Invitrogen </td><td> 15529019 </td><td> 100 mm de agua destilada </td></tr><tr><td> Topo TA kit de clonación </td><td> Invitrogen </td><td> K450002 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink rápida kit plásmido Miniprep </td><td> Invitrogen </td><td> K210010 </td><td></td></tr><tr><td> Big Dye </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4337455 </td><td></td></tr><tr><td> DyeEx 2,0 spin kit </td><td> Qiagen </td><td> 63204 </td><td></td></tr></tbody></table>

la secuenciación de la microflora bacteriana en la sangre periférica: nuestra experiencia con pacientes infectados por vih

Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients

El tracto gastrointestinal es fisiológicamente sanos colonizados por una gran variedad de microbios comensales que influyen en el desarrollo de la humoral y celular 1,2 mucosa del sistema inmunológico. Microbiota está protegido del sistema inmune a través de una fuerte barrera de la mucosa. Las infecciones y los antibióticos son conocidos por alterar la barrera normales del tracto gastrointestinal y la composición de las bacterias residentes, lo que puede resultar en posibles anomalías inmunológicas 3. El VIH causa una brecha en la barrera gastrointestinal con insuficiencia progresiva de la inmunidad de la mucosa y la fuga hacia la circulación sistémica de bioproductos bacterianos, tales como lipopolisacárido y fragmentos de ADN bacteriano, lo que contribuye a la activación inmune sistémica 4-7. Translocación microbiana está implicado en el VIH / SIDA inmunopatogénesis y respuesta al tratamiento 4,8. El objetivo fue caracterizar la composición de las bacterias translocación en la sangre periférica de los pacientes infectados por VIH. Para perseguir nuestro objetivo hemos creado una reacción de PCR para el gen 16S panbacteric ribosomial seguido de un análisis de secuenciación. En pocas palabras, toda la sangre de ambos sujetos infectados por el VIH y saludable se utiliza. Dado que los individuos sanos presentan homeostasis intestinal normal sin desplazamiento de la microflora se espera que en estos pacientes. Tras la recogida de sangre entera por punción venosa y la separación del plasma, el ADN se extrae del plasma y se utiliza para llevar a cabo una amplia gama de reacción de PCR para el gen 16S panbacteric ribosomial 9. Tras la purificación análisis de productos PCR, clonación y secuenciación se llevan a cabo.

Nuestro experimento muestra cómo realizar un análisis de la secuencia de translocación de especies de bacterias en la sangre periférica de los pacientes VIH positivos.

La secuenciación de la microflora bacteriana en la sangre periférica: Nuestra experiencia con pacientes infectados por VIH

El tracto gastrointestinal sano está colonizado fisiológicamente por una gran variedad de microbios comensales que influyen en el desarrollo de la respuesta humoral...

Secuenciación de la microflora bacteriana que transloca en sangre periférica. Nuestra experiencia con pacientes infectados por VIH. Soy Marti junior y trabajo como profesora asistente en la Clínica de Enfermedades Infecciosas y Medicina Tropical de la Universidad de Milán en Italia. Y ahora les mostraremos experimentos sobre cómo detectar y secuenciar el ADN bacteriano a partir de sangre periférica de pacientes infectados por VIH.El tracto gastrointestinal sano está colonizado por una gran variedad de microorganismos comensales que influyen en el desarrollo del sistema inmunitario humoral y celular. La microbiota queda protegida del sistema inmunitario mediante una barrera mucosa fuerte tras diversas afecciones clínicas como infecciones, tratamiento con antibióticos, complicaciones posoperatorias, así como en pacientes con carcinoma, pancreatitis y desnutrición. Se produce una alteración del tracto gastrointestinal.La infección por VIH provoca una ruptura de la barrera gastrointestinal con una falla progresiva de la inmunidad mucosal y el paso a la circulación sistémica de bioproductos bacterianos, como el lipopolisacárido y fragmentos de ADN bacteriano, que contribuyen a la activación inmune sistémica, demostrando las fases experimentales de la detección y secuenciación del ADN bacteriano. Presentes en sangre periférica de pacientes infectados por VIH estarán Camilla ti, una especialista en enfermedades infecciosas Esther, yo, una estudiante de doctorado, y ju MariaI, una investigadora posdoctoral, todas asistentes en la clínica de Enfermedades Infecciosas y Medicina Tropical de la Universidad de Milán. Nuestro experimento tiene como objetivo identificar especies bacterianas en muestras de sangre periférica de pacientes infectados por VIH.Vamos a utilizar sangre completa de sujetos infectados por VIH y de sujetos sanos, dado que los individuos sanos presentan una homeostasis intestinal normal. No esperamos observar microflora translocada en estos pacientes. Se recogerá sangre completa de los pacientes, seguida de la separación del plasma.El ADN será extraído posteriormente para realizar una reacción de PCR amplia dirigida al gen ribosómico PCIC 16 s. A continuación, se realizará la purificación del producto de PCR, así como análisis de clonación y secuenciación. El primer paso de nuestro experimento es la recolección de sangre mediante venopunción, seguida de la separación del plasma.Se extraen aproximadamente nueve mililitros de sangre completa que se depositan en tubos que contienen EDTA. Los tubos se colocan en una centrífuga a 2000 RPM durante 10 minutos. La centrifugación a temperatura ambiente permite la separación del plasma.El ADN se extraerá ahora de nuestras muestras de plasma. Desinfecte adecuadamente la cabina, las pipetas y los materiales necesarios para el experimento con el fin de garantizar la esterilidad; coloque todos los materiales bajo luz UV durante al menos 30 minutos. Apague las luces UV, limpie los guantes con un desinfectante, remoje algunas toallas de papel en etanol y colóquelas bajo la cabina cada vez que se descarte una punta. Durante el procedimiento de extracción de ADN, limpie la pipeta sobre las toallas de papel húmedas.Ya está listo para la extracción de ADN. El ADN se extrae utilizando un kit comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, 350 microlitros de plasma se colocan en un tubo de 2 ml con extremo cerrado.Se utiliza agua ultrapura como control negativo. Se añaden 10 microlitros de lisosoma a una concentración final de 1 mg por ml a las muestras. Luego, las muestras se incuban durante 30 minutos.A 37 grados Celsius, la solución A, cloroformo y la solución B se añaden luego a las muestras según las instrucciones posteriores a la centrifugación. Aparecerán tres fases distintas. Se recoge el sobrenadante y se añade al etanol, permitiendo la precipitación del ADN; la concentración de ADN se mide con un espectrofotómetro.El siguiente paso consiste en una amplificación mediante reacción PCR que abarca un amplio rango del gen ribosómico PRIC 16 s. La PCR se realiza en una sala dedicada. Se prepara una mezcla de PCR utilizando estos reactivos. La mezcla de PCR se filtra durante 30 minutos a 500 ×g y cuatro grados Celsius con el fin de evitar posibles contaminaciones por polimerasa de bacterias ambientales.La mezcla de PCR se divide entonces en alícuotas, según el número de muestras que necesiten amplificarse. Recuerde considerar alícuotas para los controles de reacción negativos y positivos.El TERMOCICLADO se programa en las siguientes condiciones: 94 grados Celsius durante cinco minutos. 94 grados Celsius, 55 grados Celsius, 72 grados Celsius durante un minuto por 40 ciclos, 72 grados Celsius durante 10 minutos. La duración promedio es de tres horas.Los productos de PCR se visualizan en un gel de agarosa al 2 %. Este es un gel de agarosa al 2 % que muestra los productos de PCR. La primera banda contiene una escalera de 100 pares de bases.La segunda banda, un control positivo de PCR. La tercera banda contiene un control negativo de PCR. La cuarta banda muestra muestras de un paciente positivo para VIH y la quinta banda contiene una muestra de agua.Seis muestra muestras de un individuo sano y una reacción PCR negativa. La banda siete contiene agua. La PCRIFICACIÓN es el siguiente paso.Los productos de PCR se purifican utilizando un kit comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizan muchas columnas que contienen filtros para este paso. Los resultados de la PCR se registran en una hoja de trabajo.Ahora vamos a proceder con la clonación utilizando la selección azul-blanca, una técnica molecular que permite detectar la inserción exitosa de ADN en un vector. El vector se transforma en células competentes bacterianas.Las células competentes se cultivan en presencia de xal. Si la transformación tiene éxito, la colonia bacteriana será blanca. Si no, la colonia será azul.Xal se utiliza para indicar si una célula expresa la enzima beta galactosidasa y para visualizar la transformación de colonias de E. coli; el IPTG induce la expresión de beta galactosidasa. Xal e IPTG se dispersan sobre placas que contienen ampicilina. Se prepara una mezcla de clonación que contiene productos de PCR, SALT y un vector de clonación siguiendo las instrucciones del fabricante.Se piensa que las células de E coli están sobre hielo. Luego se agrega la mezcla de clonación a las células, que posteriormente, tras una choque térmico, se siembran en placas y se incuban durante la noche a 37 grados Celsius. Tras la incubación, se desarrollan colonias blancas y azules en las placas.Las colonias blancas son positivas para los productos de PCR. Las colonias azules son negativas para la inserción del producto de PCR. Se seleccionan 10 colonias blancas y una colonia azul.Cada colonia se coloca en dos mililitros de caldo LB líquido. Las colonias en medio con adición de ampicilina se incuban durante la noche a 37 grados Celsius. Tras la incubación, las colonias crecidas durante la noche se utilizan para la extracción de plásmidos mediante un kit comercial de mini prep.Se utilizan columnas mini que contienen filtros para la etapa posterior a la extracción del plásmido; los plásmidos se visualizan en un gel de AROS al 0,7%. Este es un gel de AROS al 0,7% que muestra los productos de una mini prep. La primera hendidura contiene una escala de un kilobase.La segunda banda contiene la colonia control azul. Las bandas tres a doce contienen colonias blancas. Los resultados se registran con una hoja de trabajo; a continuación, se realiza la secuenciación y se amplifican los plásmidos.Se prepara una mezcla utilizando estos reactivos. La mezcla de PCR se divide en alícuotas según el número de muestras que deben amplificarse. El termociclado se programa bajo las siguientes condiciones: 96 grados Celsius durante un minuto, 96 grados Celsius durante 10 segundos, 50 grados Celsius durante cinco segundos y 60 grados Celsius durante cuatro minutos.Para 25 ciclos. La duración promedio es aproximadamente una hora. Después de la amplificación, los productos de PCR se purifican utilizando columnas que contienen filtros.Los productos purificados se cargan en una placa, que luego se coloca en un secuenciador. Una vez que se obtiene una secuencia, se realiza un análisis mediante blast y se identifican las especies bacterianas de cada colonia. Se consideran positivas las colonias que muestran una homología de secuencia del 98 % al 100 %.Este es un ejemplo de secuenciación bacteriana en plasma de un individuo positivo para el VIH. Nuestros resultados muestran que la translocación microbiana en la enfermedad por VIH implica una flora polimicrobiana. Hemos demostrado así que los pacientes infectados con el VIH presentan una microflora microbiana polimicrobiana elevada en la circulación sistémica.El ADN bacteriano en sangre periférica estaba por debajo del límite de detección en nuestros individuos sanos negativos para el VIH, lo que posiblemente refleja la integridad del tracto gastrointestinal. Nuestra investigación ahora se centra en comprender e investigar el posible papel de la microflora en sangre periférica, en la inmunopatogénesis del VIH y, posiblemente, en la respuesta al tratamiento.

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Tropismo del VIH se puede deducir de la región V3 de la envoltura viral. V3 es amplificada por PCR en triplicado, utilizando RT-PCR, secuencia, e interpretados mediante el software bioinformático. Las muestras con con la secuencia de 1 o más (s) con calificaciones bajas G2P son clasificados como no-R5 virus.

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Uso de la vía aérea fibrosis quística como un ejemplo, el manuscrito presenta un flujo de trabajo integral que comprende una combinación de enfoques de metagenómica y metatranscriptomic para caracterizar el microbiana y comunidades virales en muestras asociadas con animales.

Purificar el Impuro: Secuenciación metagenomes y Metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras

La coinfección humana es difícil de replicar in vitro. Sin embargo, los parásitos de la malaria humana pueden cultivarse fácilmente in vitro, al igual que las células mononucleares de sangre periférica humana recién aisladas infectadas naturalmente con el VIH. Esto proporciona un modelo excelente para estudiar las respuestas inmunitarias tempranas a los parásitos de la malaria en el contexto de la coinfección por el VIH.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del VIH Co-infección

Se describen técnicas que describen un procedimiento de gradiente para separar exosomas de partículas del virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Este procedimiento se utilizó para aislar exosomas de partículas de VIH en plasma humano de individuos infectados por el VIH. Los exosomas aislados se analizaron para determinar el contenido de citocinas/quimiocinas.

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Infección de tejidos humanos con virus de inmunodeficiencia humana (VIH) ex vivo proporciona un valioso modelo 3D de la patogenesia virus. Aquí, describimos un protocolo e infectar a los especímenes del tejido de las amígdalas humanas y de la mucosa genital femenina con HIV-1 y mantener en la cultura en la interfase líquido-aire.

Ex Vivo Infección de la Mucosa Genital tejido linfoide humano y mujer con Virus de inmunodeficiencia humana 1 y Histoculture

La secuencia proviral individual completa (FLIPS) proporciona un método eficiente y de alto rendimiento para la amplificación y secuenciación de sola, cerca de larga duración (intactos y defectuosos) de provirus de HIV-1 y permite la determinación de su potencial capacidad de replicación. FLIPS supera limitaciones de anteriores ensayos diseñados para secuenciar la reserva latente de VIH-1.

Amplificación de cerca integrales provirus VIH-1 para secuenciación de próxima generación

Describimos un método para procesar el líquido de lavado broncoalveolar y la sangre periférica emparejada de individuos infectados crónicamente por el VIH en terapia antirretroviral para evaluar los reservorios pulmonares del VIH. Estos métodos dan lugar a la adquisición de células T CD4 altamente puras y macrófagos alveolares que posteriormente pueden utilizarse para inmunofenotipado y cuantificaciones de ADN/ARN de VIH por reacción en cadena de polimerasa ultrasensible.

Procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y CD4+ inmunofenotipado de células T y evaluación del embalse de VIH

Aquí se presenta un protocolo optimizado para aislar, cultivar, transfectar y diferenciar a los monocitos primarios humanos de individuos infectados por el VIH y controles saludables.

Aislamiento, transfección y cultivo de monocitos humanos primarios

La leche materna transmite el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), aunque sólo el 15 % de los lactantes amamantados por madres infectadas por el VIH se infectan. Los lactantes amamantados ingieres diariamente de 105x 108 leucocitos maternos, aunque estas células están poco estudiadas. Aquí describimos el aislamiento de los leucocitos de la leche materna y un análisis de su capacidad fagocítica.

Aislamiento de leucocitos de la leche materna humana para su uso en un ensayo de fagococitosis celular dependiente de anticuerpos de metas de VIH

Aprenda el análisis de secuenciación del ADN bacteriano en sangre periférica de pacientes con infección por VIH. Este método permite identificar especies microbianas translocadas y comprender su impacto en el sistema inmunológico.

La secuenciación de la microflora bacteriana en la sangre periférica: Nuestra experiencia con pacientes infectados por VIH

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