Name: El trasplante quirúrgico de células madre neurales en la médula espinal de los ratones infectados con el virus neurotrópico Hepatitis Ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprende a trasplantar células madre neurales en la médula espinal de ratones infectados con JHMV para promover remielinización. Este método permite estudiar terapias de reemplazo celular en enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple.

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1. Preparación <ol><li> Prepare xilazina-ketamina solución (La ketamina es una sustancia controlada. Registros detallados deben mantenerse y las soluciones de almacenarse en un lugar seguro, bajo llave). </li><li> Limpiar y esterilizar el equipo. </li><li> Prepare el área de la cirugía de la limpieza con agente de asepsia y luego cubrir con papel absorbente estéril, y establecer el micromanipulador. </li></ol> 2. Preparación de células para trasplante <ol><li> Las células deben ser resuspendidas a una concentración de 100.000 células / l É y, aunque sólo 250.000 se trasplantan las células por ratón, un exceso de células es necesaria a efectos de carga jeringa (preparar por lo menos 300.000 células por ratón que reciben las células). </li><li> Lavar las células para ser trasplantadas tres veces en HBSS en un frasco cónico de 50 ml. Contar las células antes de que el giro final. </li><li> Después de que el giro final hacia abajo, y dejar decantar HBSS vial en posición invertida para evitar que las gotas lleguen a la bolita. </li><li> Muros de piedra seca en el interior con un irradiados con UV, Kimwipe estéril. No permita que se seque el precipitado. </li><li> Sosteniendo el tubo en posición vertical, poco a poco y con mucha delicadeza resuspender las células en la mitad del volumen final deseado de HBSS. </li><li> Medir el volumen total de pipeteado de la mayoría de la suspensión en una punta de pipeta y luego se ajusta el dial de la pipeta de la suspensión hasta que todo está en la punta de la pipeta. Esto le dirá cuánto más HBSS es necesario para la concentración deseada. </li><li> Aumentar el volumen hasta la cantidad deseada mediante la adición de HBSS. </li><li> Vuelva a colocar en el hielo. Comprobar la viabilidad de las células si debe estar en el hielo durante más de 2 hrs. </li></ol> 3. Preparación de los ratones para la cirugía y el trasplante <ol><li> Anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de ketamina (100mg/kg) y xilazina (10mg/kg) en dosis de 100 l ~ o un equivalente de anestesia. Todo el procedimiento de la preparación quirúrgica para suturar se de 30-40 minutos. </li><li> (Opcional: aplicar numeradas, cinta de color a la cola de cada ratón para asegurar la identificación) </li><li> Afeitar el área dorsal del ratón desde la parte baja del cuello, y se extiende 2 cm bilateral de la línea media, con una maquinilla eléctrica. El pelo se debe cortar lo más cerca posible (puede que sea necesario para revisar el área varias veces). </li><li> Para eliminar el resto del cabello, aplique una fina capa de crema de depilación (Nair), con un aplicador con punta de gasa. </li><li> Después de 1-2 minutos, limpie con una gasa de Nair mojada ligeramente con agua y jabón. El área preparada debe limpiar la piel desnuda, sin ninguna pieza perdida de pelo que podría entrar en la herida durante la intervención quirúrgica posterior. Esterilizar el área preparada con una solución de yodo. </li></ol> 4. Laminectomía <ol><li> Cambian con frecuencia y / o esterilizar los guantes durante todo el procedimiento. Posición de la parte dorsal del ratón con la cabeza apuntando hacia la izquierda (si eres diestro). Coloque los animales para asegurar la esterilidad y que sólo el área afeitada se expone. Haga una incisión vertical (~ 1,3 cm) sobre el sitio laminecomy que van desde unos vértebras torácicas T8 a T12. </li><li> Con las pinzas Graefe en la mano izquierda, sujetar firmemente la columna vertebral en T9 (Figura 1) y levante el ratón hacia arriba para exagerar la curvatura de la columna. </li><li> Usar el bisturí para marcar la unión entre T10 y T11, el espacio entre las dos protuberancias espinosas. Además expone el cruce con cuidado el desguace de la capa muscular para exponer el hueso (ver Figura 1 B, C). </li><li> Use las tijeras para más músculo clara distancia de la lámina y alrededor del pedículo con tijeras pequeñas. Esto abrirá un pequeño espacio entre las vértebras. Lentamente y con delicadeza insertar una hoja de la tijera en esta brecha y cortar el pedículo. Asegúrese de que la curvatura de la tijera siempre se coloca lateralmente, lejos del cordón. Repetir en el otro lado. (Ver Figura 1 D, E) </li><li> Levante la lámina para exponer la médula y con cuidado recortar. Asegúrese de no dejar fragmentos de hueso libre o irregulares atrás. (Ver Figura 1 F) </li><li> Antes de la inyección, limpie la sangre fuera con hisopos de algodón estériles. </li></ol> 5. La inyección de células <ol><li> Coloque la aguja con una aguja tuerca a la jeringa Hamilton y limpiarlas por lavado varias veces con agua, luego de etanol al 70%, y finalmente HBSS. Inserte el émbolo después de cada llenado con agua, etanol al 70%, o HBSS. </li><li> Prepare la jeringa Hamilton para cargar celulares, eliminando el émbolo y aflojar la tuerca de la aguja y tirar de la aguja fuera de la jeringa para evitar la contrapresión. Asegúrese de que el manejo cuidadoso de la aguja y la tuerca se hace con guantes estériles. </li><li> 15μl de células de carga en punta de la pipeta y presione firmemente la punta en la parte de atrás de la jeringa para cargar las células en la jeringa. </li><li> Inserte el émbolo de unos 5 mm y luego apretar la tuerca de la aguja. </li><li> Presione el émbolo de la ONUhasta que alguna de la suspensión celular se ve salir de la aguja. </li><li> Asegúrese de que no haya burbujas en la jeringa y coloque la jeringa en posición horizontal para evitar que las células de hacer un gradiente de gravedad. </li><li> Coge el ratón laminectomized por el músculo dorsal ancho espinales conectan las espinas de T8 y T9 (Figura 2B, C). </li><li> Abrazadera de la pinza en el brazo izquierdo micromanipulador (vertical) de modo que las patas delanteras del ratón están en el aire y sus patas traseras tocando ligeramente una plataforma de toallas de papel estéril como en las Figuras 2A y 2B. </li><li> Conecte la jeringa en el brazo derecho micromanipulador (a un ángulo de 70 °) y deslice la jeringa a la posición más baja posible, antes de sujeción. </li><li> Estabilizar el ratón fijando su cola contra las toallas de papel y baje lentamente la jeringa (Figura 2B). </li><li> Baje la aguja hacia el cordón y la inserción de la aguja de 1 mm en el hemisferio opuesto a través de la línea media dorsal (Fig. 2C). La punta de la aguja debe estar en la materia gris cerca del canal central. </li><li> Inyecte lentamente 2.5μl de las células. Inyectar a un ritmo de 1μl / 5 segundos. Después de inyectar las células, espere unos 10 segundos y retirar la aguja de una décima de vuelta a la vez cada 10 segundos hasta que la aguja está fuera de la médula. Preste atención a la posible emanación de la suspensión celular. </li><li> Rápidamente retirar la jeringa y separarlo del brazo micromanipulador. Coloque la jeringa en posición horizontal. </li><li> Suelte el ratón y la transferencia a la mesa de sutura. </li><li> Repita los pasos 5.7 hasta 5.14 para cada ratón hasta que la jeringa se vacía. Esterilizar las herramientas (en el esterilizador) y la aguja (la limpieza con etanol), entre los animales. Deseche las células y recargar si aglutinación es visible. </li><li> Limpie la jeringa en el paso 5.1 entre las cargas. </li></ol> 6. Puntos de sutura y el cuidado post-operatorio <ol><li> Sutura de la incisión. Aguja de sutura se inserta en la fascia superficial en ambos lados de la incisión. El hilo se encadenan a través de, tirando de la fascia superficial juntos (Figura 3), con lo que cubre la médula espinal expuesta en el sitio de la lámina eliminado. No suturar el músculo cutáneo adheridos a la piel o el músculo esquelético de la espalda. Tirar del hilo a través de toda, dejando aproximadamente 1 / 2 ". Con el porta-agujas, tres nudos se forman y el hilo se corta lo más cerca posible del nudo como sea posible. </li><li> Cerrar la incisión mediante la aplicación de dos-tres grapas (dependiendo del tamaño de la incisión) en la piel (Figura 3B). Tire con cuidado de la piel lejos del ratón para evitar grapado el músculo subyacente. </li><li> El uso de un 26G3 / aguja 8 inyectar 0,5 ml de Ringer lactato por vía subcutánea en la espalda baja lejos de la incisión. </li><li> Lugar del ratón de nuevo en su jaula. Para asegurarse de que es capaz de respirar cómodamente mientras está bajo anestesia, el ratón debe ser colocado en su lado de la jaula, evitando el contacto entre el sitio de la cirugía y camas jaula. Las jaulas deben ser colocados en las compresas calientes. </li><li> Los ratones son monitoreados después de la anestesia desaparezca para asegurar que cese el sangrado, las suturas permanecen cerradas, y que los ratones que volver a la movilidad antes de la cirugía. </li><li> Tratar a los ratones una vez con el analgésico buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg) después de la cirugía. </li><li> Asegúrese de que los ratones con discapacidad tengan acceso suficiente a los alimentos y el agua: botellas de agua están equipados con extenderse 3,5 pulgadas caños y los ratones que no pueden caminar a mano agua que se alimenta y / o alta en calorías, suplementos dietéticos (Nutri-Cal, Tomlyn). </li></ol> 7. Los resultados representativos: Resultados deseados serán identificables por la falta de flujo de salida de la suspensión celular durante la inyección y la aparición intacta de la médula espinal después del procedimiento. Para ello, es vital contar con una iluminación brillante y directo sobre la columna vertebral del ratón durante la laminectomía y durante la inyección. Iluminación óptima se ve facilitada por la iluminación de fibra óptica (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 - laminectomía (A) Una vez vértebra T9 está sólidamente mantenidas con las pinzas de Graefe, (B, C) ​​El puntaje de la columna vertebral con el bisturí entre T10 y T11 para facilitar la entrada de las tijeras de micro.. (D) Retire con cuidado las tijeras micro a través del espacio entre T10 y T11 (flechas y cuadro E), y cortar los pedículos en cada lado (los guiones, E) para liberar a la lámina dorsal. (F) Mueva la lámina hasta rostral y córtala. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. La inyección de NSCs. (A) La configuración general de la micromanipulador con la pinza mantiene el ratón conectado al brazo izquierdo y la jeringa Hamilton en el brazo derecho en un ángulo de 70 años. (B) La pinza hemostática mantener los músculos espinales dorsal conecta la columna vertebral de T8 y T9. (C) La aguja se baja a través de tque la línea media y en la sustancia gris en el hemisferio opuesto, proximal al canal central. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Suturas y cierre de la herida. (A) Las suturas se aplica a la fascia superficial en ambos lados de la incisión. (B) La incisión se cierra con 2-3 grapas según sea necesario (un alimento básico que aparece en una herida que necesitan 3).

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</ol>

Un trasplante de buena ejecución dependerá principalmente de la laminectomía cuidado y la inyección de las células. El escollo principal para evitar que durante la laminectomía es el daño de la médula espinal. Esto puede ocurrir durante el procedimiento en sí, o por daños causados ​​por los fragmentos de hueso afilados dejado atrás después del procedimiento. Para evitar estos, asegúrese de que los puntos de las tijeras micro curvas son siempre de espaldas a la cuerda y examinar cuidadosamente la columna laminectomized para asegurarse de que todos los fragmentos óseos se borran y que los bordes de la estructura vertebral restantes no han salido o abiertamente irregular. Como se mencionó anteriormente, la detección de flujo de salida será posible si la luz está brillando y directamente en la médula espinal expuesta durante la inyección. Flujo de salida es más probable que ocurra con agujas de calibre 30 (frente al 33 calibre) y si la inyección se hace con demasiada rapidez. Aunque este protocolo nos ha dado buenos resultados, otros han informado de espera más largos períodos (hasta 5 minutos) antes de retractarse de la aguja de inyección después de 8,9. Además, pequeñas agujas de calibre son preferibles, pero hemos observado que algunas células se lisaron con demasiada facilidad cuando pasa a través de agujas de calibre 33. Para maximizar la eficiencia, un equipo de trasplante dotación de las cuatro estaciones diferentes (ratón de preparación, la laminectomía, inyecciones y suturas) es deseable. Además, el calendario para cada procedimiento debe ser optimizado para minimizar el tiempo que las células están esperando en el hielo. Por ejemplo, trasplante de nuestros ratones en grupos de cuatro (el número de dosis en cada carga de la jeringa), la persona inyección de células empieza a cargar la jeringa después de que el ratón ha sido tercero laminectomized y la persona que prepara los ratones debe anestesiar a los siguientes grupo después de que el segundo ratón del grupo anterior se ha laminectomized. De esta manera, se puede trasplantar células (o medios de control) en 40 ratones en alrededor de 3 horas a pesar de que cada ratón se llevará a aproximadamente 30-40 min. Terapias de reemplazo celular para el tratamiento de algunos trastornos del SNC se encuentran actualmente en ensayos clínicos 10. No hay sustituto para los modelos in vivo de la NSC y el trasplante de nuestro protocolo para el injerto de NSCs en la médula espinal de ratones con desmielinización viral inducida facilita el uso de un modelo importante de la EM y también se puede adaptar fácilmente a otros modelos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo / equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> Phoenix Parmaceuticals </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina clorhidrato </td><td> MP Biomedicals </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Church &amp; Dwight Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10  l Hamilton jeringa w / extraíble aguja </td><td> Hamilton Company </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Agujas Hamilton, 30G o 33 G, de ½ pulgada, 30 ° de bisel </td><td> Hamilton Company </td><td> 7803-077803-05 </td><td> Probar la viabilidad de las células después de la aprobación a través de agujas para identificar el mejor indicador de uso </td></tr><tr><td> Micro Tijeras </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> Unas pequeñas pinzas Graefe </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> Kopf Instruments </td><td> Modelo 1772 Soporte universal </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> Kopf Instruments </td><td> Modelo 1773 Portaelectrodos </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> Kopf Instruments </td><td> Modelo 902 estereotáxica de pequeños animales </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> Kopf Instruments </td><td> Modelo 960 portadora electrodo izquierdo </td><td></td></tr><tr><td> Suturas </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer lactato </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> Grapas </td><td> Ciencia fina </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Hemostático </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> Escalpelos, tamaños 10,11 </td><td> Pescador </td><td> 268878, 268879 </td><td></td></tr><tr><td> Suturas </td><td> ETHICON * </td><td> 1676G </td><td> tamaño de 5-0, 3 / 8 &quot;círculo de agujas de 19 mm, 45 cm hilo trenzado </td></tr><tr><td> Reflejo de la herida 7 aplicador de clip de </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7mm clips herida Reflex </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Olsen-Hegar porta-agujas </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

el trasplante quirúrgico de células madre neurales en la médula espinal de los ratones infectados con el virus neurotrópico hepatitis ratón

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Los ratones infectados con la cepa JHM neurotrópico del virus de la hepatitis del ratón (MHV) desarrollar los resultados patológicos y clínicos similares a los pacientes con la enfermedad desmielinizante Esclerosis Múltiple (EM). Hemos demostrado que el trasplante de NSCs en la médula espinal de los resultados de los ratones enfermos en una mejora significativa tanto en la remielinización y en los resultados clínicos. Terapias de reemplazo celular para el tratamiento de las enfermedades crónicas neurológicas son ya una realidad y en modelos in vivo son de vital importancia en la comprensión de las interacciones entre las células injertadas y el microambiente del tejido huésped. Esta presentación ofrece un método adecuado para el trasplante de células en la médula espinal de ratones infectados JHMV. En resumen, ofrecemos un procedimiento para i) la preparación de NSCs antes del trasplante, ii) pre-operatorio de atención de los ratones, iii) la exposición de la médula espinal a través de una laminectomía, iv) la inyección estereotáxica de NSCs, y iv) los cuidados postoperatorios .

El trasplante de células madre neurales (NSC) en la médula espinal de ratones con desmielinización establecido se detalla. La preparación de los comités directivos nacionales, la laminectomía de vértebra torácica 9 (T9), y el trasplante de NSCs se perfila, junto con la atención pre y post-operatorio de los ratones.

El trasplante quirúrgico de células madre neurales en la médula espinal de los ratones infectados con el virus neurotrópico Hepatitis Ratón

Los ratones infectados con la cepa neurotrópica JHM del virus de la hepatitis murina (MHV) desarrollan resultados patológicos y clínicos similares a los de los pacientes con el...

El objetivo general de este procedimiento es promover la remielinización y la mejoría clínica en animales con desmielinización establecida mediante el trasplante de células madre neurales en la médula espinal de ratones infectados con JHMV. Esto se logra primero preparando al animal. El segundo paso del procedimiento consiste en realizar una laminectomía en las vértebras torácicas.Posteriormente, se inyectan 10 células en la médula espinal expuesta. Tras una inyección exitosa, se cierra la herida. En última instancia, presencia de células madre neurales de ratón en la médula espinal.El parénquima puede visualizarse mediante métodos como la microscopía de fluorescencia, el trasplante de células madre neurales en la médula espinal de JHMB. Los ratones infectados pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de las terapias de reemplazo celular para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, como la forma en que las células migran, proliferan y se diferencian, así como cómo afectan al sistema nervioso central. Y si podemos modificar las células o el entorno de la médula espinal en el que se trasplantan para potenciar sus beneficios terapéuticos.Aunque este método puede proporcionar información sobre la terapia de reemplazo celular en un modelo viral de desmielinización, también puede aplicarse a otros modelos de desmielinización y lesión, como la encefalomielitis autoinmune experimental, EAE, y la lesión de la médula espinal. Antes de preparar las células para la inyección, prepare todas las soluciones necesarias. A continuación, limpie y esterilice todo el equipo.Prepare el área quirúrgica y configure el micromanipulador para preparar las células para el trasplante; retire con tripsina los ojos y resuspenda las células en un tubo cónico de 50 mililitros. Lave las células que se van a trasplantar tres veces con HBSS. Cuente las células antes de la centrifugación final.Después del último centrifugado, decante el HBSS y deje el vial en posición invertida para evitar que las gotas alcancen el precipitado. Seque las paredes internas con una toallita Kim estéril irradiada con UV. No permita que el precipitado se seque.Sosteniendo el tubo verticalmente, de forma lenta y muy delicada. Re suspenda las células en la mitad del volumen final deseado de HBSS. En última instancia, las células deben tener una concentración de 100.000 células por microlitro.Mida el volumen total pipeteando la suspensión en una punta de pipeta y luego ajustando el dial de la pipeta hasta que toda la suspensión esté dentro de la punta. Esto indicará cuánto más HBSS se necesita para alcanzar la concentración deseada. Ajuste el volumen celular al volumen deseado.Mediante la adición de HBSS. Puede transferir las células a un tubo eppendorf. Colóquelas de nuevo sobre hielo.Compruebe la viabilidad de las células si deben permanecer en hielo durante más de dos horas. Para iniciar el procedimiento quirúrgico, confirme el nivel adecuado de anestesia mediante el reflejo de pellizco en el dedo del pie. Utilice una afeitadora eléctrica para rasurar la zona dorsal del ratón desde la parte baja de la espalda hasta el cuello.Una vez afeitada el área, aplique una capa fina de crema depilatoria para eliminar cualquier vello residual. Después de uno a dos minutos, limpie el área con gasa seca y luego con gasa ligeramente empapada en agua jabonosa. El área quirúrgica ahora debe estar libre de vello.Por último, esterilice el área preparada con solución de Betadine y aplique pomada en los ojos. Para evitar la sequedad, coloque al ratón en posición dorsal hacia arriba. Realice una incisión sobre el sitio de laminectomía que se extienda desde aproximadamente las vértebras torácicas.T ocho a T 11. Exagere la curvatura de la columna vertebral y localice T 10. Es la primera vértebra con un proceso plano y generalmente se encuentra dos vértebras craneales al ápice de la curvatura de la columna vertebral.Con la pinza gris, sujete firmemente la columna vertebral. En T nueve, utilice un escalpelo para marcar el espacio entre las dos protrusiones espinosas de T 10 y T 11. A continuación, raspe la capa muscular para exponer el hueso debajo, asegurándose de que la curvatura de las tijeras esté orientada lejos del cordón.Inserte lentamente una hoja de las tijeras entre T10 y T11. Deslice la hoja entre la médula y el pedículo de T10 y corte el pedículo. Repita el procedimiento en el otro lado. Levante la lámina para exponer la médula debajo y córtela con cuidado.Asegúrese de no dejar fragmentos de hueso sueltos ni irregulares. Una vez eliminados todos los fragmentos óseos, limpie cualquier rastro de sangre con hisopos estériles de algodón. Primero, prepare la jeringa Hamilton sujetando la aguja con la tuerca de la aguja.Inserte el émbolo y enjuague varias veces con agua. Una vez limpio con etanol al 70% y HBSS. Retire el émbolo y afloje la tuerca de la aguja.Retire la aguja de la jeringa para evitar la presión inversa. Al cargar las células, cargue 15 microlitros de células en la jeringa presionando firmemente la punta de la pipeta en la parte posterior de la jeringa. Introduzca el émbolo aproximadamente cinco milímetros y luego apriete la tuerca de la aguja.Presione el émbolo hasta que se observe la salida de algo de la suspensión celular por la aguja. Asegúrese de que no haya burbujas en la jeringa y coloque la jeringa horizontalmente para evitar que las células formen un gradiente por efecto de la gravedad. Regresando al animal, use pinzas hemostáticas para sujetar el músculo de los apófisis espinosos S.Conectando las apófisis espinosas de T ocho y T nueve. Sujete el hemostato al brazo izquierdo del micromanipulador de modo que las patas delanteras del ratón queden en el aire y sus patas traseras toquen ligeramente una plataforma de toallas de papel estériles.Sujete la jeringa al brazo derecho del micromanipulador en un ángulo de 70 grados y deslícela a la posición más baja posible antes de fijarla. Estabilice el ratón sujetando su cola contra las toallas de papel. Baje lentamente la aguja hacia la médula espinal.Introduzca la punta un milímetro dentro del hemisferio opuesto a través de la línea media dorsal. La punta de la aguja debe estar en la sustancia gris o cerca de ella, pero no en el conducto central. Inyecte lentamente 2,5 microlitros de células a una velocidad de un microlitro por cada cinco segundos.Después de inyectar las células, espere 10 segundos y retire la aguja. Un décimo de vuelta. Retire a este ritmo cada 10 segundos hasta que la aguja salga del cordón.Inyectar las células demasiado rápido o retirar la aguja demasiado rápidamente puede provocar flujo de la suspensión celular. Si esto ocurre, deseche el ratón del estudio. Una vez retirado de la cuerda, retraccione rápidamente la aguja y desacople la jeringa del brazo del micromanipulador.Nuevamente, colóquelo en posición horizontal. Suelte el ratón y transfiéralo a una mesa de sutura. Repita este procedimiento para cada ratón hasta que se vacíe la jeringa.Deseche las células y recargue si es visible la formación de grumos, enjuagando y limpiando la jeringa entre cargas. Después de la inyección, el animal se traslada a un lugar separado para ser suturado. Pase la aguja de sutura a través de la fascia superficial en ambos lados de la incisión.Tire del hilo quirúrgico para unir la fascia y cubrir la médula espinal expuesta en el sitio de la lámina removida. Utilice un portagujas en pinzas para hacer tres nudos y corte tanto del hilo como sea posible. Por lo general, un solo punto es suficiente mientras se separa la piel del ratón.Para evitar sujetar el músculo subyacente, cierre la incisión con dos o tres grapas. Una vez cerrida la herida, inyecte 0.5 mililitros de solución de Ringer con lactato subcutáneamente en la parte baja de la espalda, pero lejos de la incisión. Coloque al ratón de lado en su jaula, asegurándose de que el sitio de cirugía no entre en contacto con el lecho de la jaula.Observe a los animales hasta que se recuperen completamente. Esta imagen muestra células madre neurales de ratón marcadas con GFP trasplantadas con éxito en una sección coronal de la médula espinal. 21 días después del trasplante.Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo trasplantar células madre neurales a la médula espinal de ratones infectados con JHMV. Una vez dominada, es posible realizar esta técnica en 40 ratones en aproximadamente tres horas.

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Investigación

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Neurociencia

El trasplante de precursores neuronales es una estrategia prometedora para la protección y / o reemplazar la pérdida / disfuncional neuronas cervical motor frénico en lesiones de médula espinal (LME) y el trastorno de la neurona motora, esclerosis amiotrófica laterales (ALS). Ofrecemos un protocolo para la entrega de celulares a cuerno ventral de la médula espinal cervical en modelos de roedores de la ELA y la médula espinal.

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Fuente: Furmanski, O., et al. Modelo de impacto cortical controlado de lesión cerebral de ratón con trasplante terapéutico de células neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. J. Vis. Exp. (2019)En este video, las células neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos se inyectan estereotáxicamente en el borde de materia gris-materia blanca de la corteza profunda en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática. Las células...

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Fuente: Parajuli, B., et.al. Trasplante de microglía derivada de células madre pluripotentes inducidas por humanos en cerebro de ratones inmunocompetentes por vía transnasal no invasiva. J. Vis. Exp. (2022).Este video demuestra el trasplante transnasal de células de microglía humana derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSMG) en un cerebro de ratón. La hialuronidasa se aplica a las fosas nasales de un ratón con agotamiento microglial para mejorar la permeabilidad. La suspensión...

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Lesión de la médula espinal es una condición traumática que causa morbilidad severa y alta mortalidad. En este trabajo se describe en detalle un modelo contusión de lesión de la médula espinal en ratones seguido de un trasplante de células madre neurales.

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Aquí, presentamos un nuevo modelo de hígado de ratón humanizado generado en ratones knockout celular mediado por el receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID tras el trasplante de células madre hepáticas humanas inmaduras y expandibles.

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El protocolo presentado aquí permite el trasplante de microglía humana derivada de células madre pluripotentes inducidas (iPSMG) en el cerebro a través de una ruta transnasal en ratones inmunocompetentes. Se muestra el método para la preparación y trasplante transnasal de células y la administración de mezcla de citoquinas para el mantenimiento de iPSMG.

Trasplante de microglía derivada de células madre pluripotentes inducidas por humanos en ratones cerebros inmunocompetentes a través de una ruta transnasal no invasiva

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Aprende a trasplantar células madre neurales en la médula espinal de ratones infectados con JHMV para promover remielinización. Este método permite estudiar terapias de reemplazo celular en enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple.

El trasplante quirúrgico de células madre neurales en la médula espinal de los ratones infectados con el virus neurotrópico Hepatitis Ratón (Video) | JoVE Journal

El trasplante quirúrgico de células madre neurales en la médula espinal de los ratones infectados con el virus neurotrópico Hepatitis Ratón

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