Name: Ensayo de detección de estrés oxidativo en una línea celular astrocitos felina, G355-5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprende a detectar estrés oxidativo en astrocitos felinos usando CM-H2DCFDA y citometría de flujo. Este método cuantifica especies reactivas de oxígeno para estudios de neuroprotección.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Damos las gracias a los productos ReadiSorb por su generoso apoyo de estos estudios.

1. De cultivo celular de astrocitos y felino, el tratamiento con H 2 O 2 <ol><li> La línea de cultivo celular G355-5 en un frasco de 75 cm 2 con los medios de comunicación DMEM más nutrientes a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta el 60% de confluencia (~ 5 días). Vuelva a colocar los medios de comunicación cada 1-2 días o según sea necesario para mantener una cultura saludable. </li><li> Retire el medio y agregar 2 ml de tripsina 0,25%. Levante las células mediante pipeteo durante 45 s - 1 min a temperatura ambiente (TA). </li><li> Rápidamente la transferencia de la suspensión a un tubo cónico de 15 ml que contienen 10 ml de los medios de comunicación. Mezclar suavemente. </li><li> Centrifugar a 300 xg, 23 ° C durante 3 minutos para obtener un pellet. Eliminar el sobrenadante sin perturbar el precipitado. </li><li> Agregar 6-7 ml de medio fresco y volver a suspender las células. </li><li> Añadir aproximadamente 1 ml de células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Agregar 3.2 ml de los medios de comunicación a cada pocillo e incubar hasta el 80-90% confluente. </li><li> Prepare una solución de peróxido de 100μM (H 2 O 2) en los medios de comunicación. </li><li> Retire el medio de cada pocillo y reemplazar con 2 ml de medio fresco (control), 2 ml de H 2 O 2 (tratamiento) o 2 ml de DPBS. Se incuba a 37 ° C CO, 5% 2 de 3 h. </li><li> Quitar las soluciones y agregar 1 ml de tripsina para levantar las células. La transferencia de células a un tubo de 1,7 ml Eppendorf que contiene 0,5 ml de DPBS. Este paso se debe realizar en cada pocillo de forma individual con el fin de prevenir la muerte celular de incubación prolongado tripsina. </li><li> Giran a 300 xg durante 3 minutos, desechar el. Sobrenadante y resuspender en 1 ml de DPBS </li></ol> 2. La tinción de ROS <ol><li> Todos los pasos para la tinción debería ser realizada con una exposición mínima de luz para evitar decoloración. </li><li> Añadir 1 l de CCCP 50 mm para el control positivo. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 5 min. </li><li> Añadir 5 l de una 10 mM CM-H 2 DCFDA solución a la H 2 O 2 grupos. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 15-30 min. No mancha, se añade a la muestra de suero salino. </li><li> Lavar las muestras con 2 ml de DPBS para eliminar la mancha residual. </li><li> Giran a 300 xg durante 3 minutos para obtener un pellet. </li><li> Resuspender las células en 0,5 ml de DPBS. Añadir un PI l de cada muestra, con excepción de la solución salina. </li><li> Transferencia de muestras a un tubo de citómetro de flujo de 5 ml. </li><li> Ejecutar en el citómetro de flujo. </li></ol> 3. Citometría de flujo <ol><li> Corra las muestras en un FC500 Beckman Coulter (o equivalente) equipado con un láser de 488 nm de argón y los pasos siguientes bandas: 525, 775 y 620 nm, todos ± 20 nm. </li><li> Prepare los controles adecuados: las células no teñidas, CM-H 2 DCFDA manchada sólo, único IP, doble manchadas (control negativo). </li><li> Realizar un protocolo que tiene la histoplots siguiente: FS vs SS, PI vs CM-H DCFDA 2. También debe contar con los histogramas siguientes: el número de células frente a FL1, FL2 y FL3, que se corresponde con las manchas. </li><li> Antes de ejecutar los ejemplos, revise el equipo, los líquidos y contenedores de residuos. Caliente el equipo por lo menos 20 min. </li><li> Limpiar el equipo y realizar una calibración con las cuentas adecuadas de acuerdo a los estándares de los fabricantes. </li><li> Seleccione el protocolo y ejecutar los ejemplos. </li><li> Limpiar el equipo como se hizo anteriormente. </li><li> Limpie la línea de vacío de acuerdo con las normas de los fabricantes. </li><li> Apague la corriente y limpia la línea de la cabeza / de vacío. </li><li> Desactivar el software y el ordenador. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Resultados de citometría de flujo se analizaron mediante FlowJo 7.6 y los controles de la mancha se utiliza para establecer objetivamente la compuerta. Sobre esta base, las células sanas a aparecer en la parte izquierda del gráfico y ROS (estrés oxidativo) se ha detectado como un cambio de celdas a la derecha. La figura 1 muestra los resultados de los efectos del peróxido de hidrógeno en astrocitos sanos felino. Los datos de FL1 se utilizó para medir la intensidad de la CM-H 2 DCFDA, lo que indica la presencia de ROS. Como era de esperar, una mayor cantidad de ROS se detectó en la muestra tratada con H 2 O 2. Esto se muestra en el histograma como un cambio en la intensidad de fluorescencia de izquierda a derecha. Al comparar las células sanas tratadas con DMEM contra DPBS, no hubo ningún cambio significativo en la cantidad de ROS (Fig. 2). <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Los resultados de citometría de flujo de los niveles de estrés oxidativo en los astrocitos sanos felino y el efecto de H 2 O 2 en las células sanas. Los resultados indican que el H 2 O 2 aumenta los niveles de ROS en las células sanas en comparación con las células sin tratamiento (DMEM). <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Resultados de citometría de flujo de los niveles de ROS detectado en las células sanas se incubaron durante 3 horas con DPBS.

<ol><li>Bukrinsky, M. I., Nottet, H. S., Schmidtmayerova, H. L., Dubrovsky, H., Flanagan, C. R., Mullins, M. E., Lipton, S. A., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nitric+oxide+synthase+activity+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29-infected+monocytes%3A+implications+for+HIV-associated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of nitric oxide synthase activity in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected monocytes: implications for HIV-associated neurological disease.</a> J Exp Med. 181, 735-745 (1995).</li>
<li>Cadet, J. L., Ali, S., Epstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+oxygen-based+radicals+in+methamphetamine-induced+neurotoxicity%3A+evidence+from+the+use+of+CuZnSOD+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Involvement of oxygen-based radicals in methamphetamine-induced neurotoxicity: evidence from the use of CuZnSOD transgenic mice.</a> Ann N Y Acad Sci. 738, 388-3891 (1994).</li>
<li>Cathcart, R., Schwiers, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+picomole+levels+of+hydroperoxides+using+a+fluorescent+dichlorofluorescein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay.</a> Anal Biochem. 134, 111-116 (1983).</li>
<li>Chao, C. C., Hu, S., Peterson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia%3A+the+not+so+innocent+bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Glia: the not so innocent bystanders.</a> J Neurovirol. 2, 234-239 (1996).</li>
<li>Cooper, A. J., Kristal, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+glutathione+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of glutathione in the central nervous system.</a> Biol Chem. 378, 793-802 (1997).</li>
<li>Cubells, J. F., Rayport, S., Rajendran, G., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+neurotoxicity+involves+vacuolation+of+endocytic+organelles+and+dopamine-dependent+intracellular+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine neurotoxicity involves vacuolation of endocytic organelles and dopamine-dependent intracellular oxidative stress.</a> J Neurosci. 14, 2260-2271 (1994).</li>
<li>Dawson, V. L., Dawson, T. M., Uhl, G. R., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+coat+protein+neurotoxicity+mediated+by+nitric+oxide+in+primary+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 coat protein neurotoxicity mediated by nitric oxide in primary cortical cultures.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 3256-329 (1993).</li>
<li>Desagher, S., Glowinski, J., Premont, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+protect+neurons+from+hydrogen+peroxide+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes protect neurons from hydrogen peroxide toxicity.</a> J Neurosci. 16, 2553-2562 (1996).</li>
<li>Dewhurst, S., Gelbard, H. A., Fine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathogenesis+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Today%22%5BJournal%5D)">Neuropathogenesis of AIDS.</a> Mol Med Today. 2, 16-23 (1996).</li>
<li>Dringen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+functions+of+glutathione+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Metabolism and functions of glutathione in brain.</a> Prog Neurobiol. 62, 649-671 (2000).</li>
<li>Dringen, R., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+restoration+as+indicator+for+cellular+metabolism+of+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutathione restoration as indicator for cellular metabolism of astroglial cells.</a> Dev Neurosci. 20, 401-407 (1998).</li>
<li>Dringen, R., Pfeiffer, B., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+the+Antioxidant+Glutathione+in+Neurons%3A+Supply+by+Astrocytes+of+CysGly+as+Precursor+for+Neuronal+Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synthesis of the Antioxidant Glutathione in Neurons: Supply by Astrocytes of CysGly as Precursor for Neuronal Glutathione.</a> J Neurosci. 19, 562-569 (1999).</li>
<li>Everall, I. P. H. udson, L, R. W. K. erwin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+absolute+levels+of+ascorbic+acid+and+unaltered+vasoactive+intestinal+polypeptide+receptor+binding+in+the+frontal+cortex+in+acquired+immunodeficiency+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Decreased absolute levels of ascorbic acid and unaltered vasoactive intestinal polypeptide receptor binding in the frontal cortex in acquired immunodeficiency syndrome.</a> Neurosci Lett. 224, 119-1122 (1997).</li>
<li>Gabriel, C., Camins, A., Sureda, F. X., Aquirre, L., Escubedo, E., Pallas, M., Camarasa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+nitric+oxide+generation+in+mammalian+neurons+using+dichlorofluorescin+diacetate+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of nitric oxide generation in mammalian neurons using dichlorofluorescin diacetate and flow cytometry.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 38, 93-938 (1997).</li>
<li>Gendelman, H. E., Genis, P., Jett, M., Zhai, Q. H., Nottet, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+system+for+HIV-1-induced+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">An experimental model system for HIV-1-induced brain injury.</a> Adv Neuroimmunol. 4, 189-1893 (1994).</li>
<li>Hayman, M., Arbuthnott, G., Harkiss, G., Brace, H., Filippi, P., Philippon, V., Thomson, D., Vigne, R., Wright, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxicity+of+peptide+analogues+of+the+transactivating+protein+tat+from+Maedi-Visna+virus+and+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotoxicity of peptide analogues of the transactivating protein tat from Maedi-Visna virus and human immunodeficiency virus.</a> Neuroscience. 53, 1-6 (1993).</li>
<li>Hirata, H., Ladenheim, B., Rothman, R. B., Epstein, C., Cadet, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine-induced+serotonin+neurotoxicity+is+mediated+by+superoxide+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine-induced serotonin neurotoxicity is mediated by superoxide radicals.</a> Brain Res. , 677-6345 (1995).</li>
<li>Koka, P., He, K., Zack, J. A., Kitchen, S., Peacock, W., Fried, I., Tran, T., Yashar, S. S., Merrill, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+1+envelope+proteins+induce+interleukin+1%2C+tumor+necrosis+factor+alpha%2C+and+nitric+oxide+in+glial+cultures+derived+from+fetal%2C+neonatal%2C+and+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus 1 envelope proteins induce interleukin 1, tumor necrosis factor alpha, and nitric oxide in glial cultures derived from fetal, neonatal, and adult human brain.</a> J Exp Med. 182, 941-951 (1995).</li>
<li>Kong, L. Y., Wilson, B. C., McMillian, M. K., Bing, G., Hudson, P. M., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+the+HIV-1+envelope+protein+gp120+on+the+production+of+nitric+oxide+and+proinflammatory+cytokines+in+mixed+glial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">The effects of the HIV-1 envelope protein gp120 on the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines in mixed glial cell cultures.</a> Cell Immunol. 172, 77-83 (1996).</li>
<li>Koutsilieri, E., Gotz, M. E., Sopper, S., Sauer, U., Demuth, M., ter Meulen, V., Riederer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glutathione+and+cell+toxicity+following+exposure+to+neurotropic+substances+and+human+immunodeficiency+virus-1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Regulation of glutathione and cell toxicity following exposure to neurotropic substances and human immunodeficiency virus-1 in vitro.</a> J Neurovirol. 3, 342-349 (1997).</li>
<li>Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+of+neuronal+cell+injury+and+death+in+AIDS+dementia+and+focal+cerebral+ischemia%3A+potential+treatment+with+NMDA+open-channel+blockers+and+nitric+oxide-related+species%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Similarity of neuronal cell injury and death in AIDS dementia and focal cerebral ischemia: potential treatment with NMDA open-channel blockers and nitric oxide-related species.</a> Brain Pathol. 6, 507-517 (1996).</li>
<li>Lipton, S. A., Yeh, M., Dreyer, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+current+models+of+HIV-related+neuronal+injury%3A+platelet-activating+factor%2C+arachidonic+acid+and+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Update on current models of HIV-related neuronal injury: platelet-activating factor, arachidonic acid and nitric oxide.</a> Adv Neuroimmunol. 4, 181-188 (1994).</li>
<li>Mills, E. M., Takeda, K., Yu, Z. X., Ferrans, V., Katagiri, Y., Jiang, H., Lavigne, M. C., Leto, T. L., Guroff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+treatment+prevents+the+increase+in+superoxide+produced+by+epidermal+growth+factor+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor treatment prevents the increase in superoxide produced by epidermal growth factor in PC12 cells.</a> J Biol Chem. 273, 22165-22168 (1998).</li>
<li>Peuchen, S., Duchen, M. R., Clark, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+glutathione+redox+state+in+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Modulation of the glutathione redox state in adult astrocytes.</a> Biochem Soc Trans. 24, 449S-449S (1996).</li>
<li>Possel, H., Noack, H., Augustin, W., Keilhoff, G., Wolf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C7-Dihydrodichlorofluorescein+diacetate+as+a+fluorescent+marker+for+peroxynitrite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">2,7-Dihydrodichlorofluorescein diacetate as a fluorescent marker for peroxynitrite formation.</a> FEBS Lett. 416, 175-178 (1997).</li>
<li>Sagara, J., Makino, N., Bannai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+efflux+from+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Glutathione efflux from cultured astrocytes.</a> J Neurochem. 66, 1876-1881 (1996).</li>
<li>Stefano, G. B., Smith, E. M., Paemen, L. R., Hughes, T. K. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+gp120+associated+neurological+deficits%3A+a+potential+role+for+nitric+oxide+and+other+signal+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">HIV gp120 associated neurological deficits: a potential role for nitric oxide and other signal molecules.</a> Advances in Neuroimmunology. 3, 47-57 (1993).</li>
<li>Sundaresan, M., Yu, Z. X., Ferrans, V. J., Irani, K., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+generation+of+H2O2+for+platelet-derived+growth+factor+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction.</a> Science. 270, 296-299 (1995).</li>
<li>Wang, X. F., Cynader, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+provide+cysteine+to+neurons+by+releasing+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Astrocytes provide cysteine to neurons by releasing glutathione.</a> J Neurochem. 74, 1434-1442 (2000).</li>
<li>Wilson, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+defense+of+the+brain%3A+a+role+for+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Antioxidant defense of the brain: a role for astrocytes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 75, 1149-1163 (1997).</li>
<li>Zenger, E., Collisson, E. W., Barhoumi, R., Burghardt, R. C., Danave, I. R., Tiffany-Castiglioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+cytometric+analysis+of+FIV-induced+injury+in+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Laser cytometric analysis of FIV-induced injury in astroglia.</a> Glia. 13, 92-100 (1995).</li>
</ol>

A menudo se sugiere un mecanismo de daño neuronal inducido por el virus es el estrés oxidativo 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. Básicamente, se propone que a través de la exposición al virus de la glía (astrocitos y microglia) liberar los radicales de oxígeno reactivo, tal como hidróxido, el anión superóxido, óxido nítrico y / o peróxido de hidrógeno, que son tóxicos para las neuronas. Del mismo modo, el estrés oxidativo también ha sido sugerido como un importante mecanismo patológico de metanfetamina n...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15 a 013 CV </td><td></td></tr><tr><td> MEM Vitaminas </td><td> Cellgro </td><td> 25-020-cl </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Hyclone </td><td> 17-605E </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> No aminoácidos esenciales </td><td> Hyclone </td><td> 25-025-cl </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> 20% (v / v) </td></tr><tr><td> Aminoácidos Esenciales </td><td> Cellgro </td><td> 25-030-cl </td><td> 0,2% (v / v) </td></tr><tr><td> Vacío de 500 ml sistema de filtración </td><td> VWR </td><td> 87006-076 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos cónicos </td><td> Halcón </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 frascos de cultivo de tejidos </td><td> Halcón </td><td> 353136 </td><td></td></tr><tr><td> 6 y placa de cultivo de tejidos </td><td> Halcón </td><td> 353224 </td><td></td></tr><tr><td> CM-H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C6827 </td><td></td></tr><tr><td> Yoduro de propidio (PI) </td><td> Sigma </td><td> P4170-10mg </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Lonza </td><td> 17-160F </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O 2 </td><td> Sigma </td><td> H6520 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ antibióticos </td><td> Hyclone </td><td> SV30079.01 </td><td> 0,1% (v / v) </td></tr><tr><td> G355-5 células </td><td> ATCC </td><td> CRL-2033 </td><td> Cerebro felino normal </td></tr></tbody></table>

ensayo de detección de estrés oxidativo en una línea celular astrocitos felina, g355-5

Screening Assay for Oxidative Stress in a Feline Astrocyte Cell Line, G355-5

Un mecanismo frecuentemente sugerido inducida por el virus de daño neuronal es el estrés oxidativo. Los astrocitos tienen un papel importante en el control de estrés oxidativo del Sistema Nervioso Central (SNC). Los astrocitos ayudan a mantener un medio homeostático de las neuronas, así como la protección de las neuronas a partir de especies reactivas del oxígeno (ROS). CM-H2DCFDA es un indicador penetran en las células de la presencia de ROS. CM-H 2 DCFDA entra en la célula como un compuesto no fluorescente, y se convierte en fluorescente después de esterasas celulares eliminar los grupos de acetato, y el compuesto se oxida. El número de células, medido por citometría de flujo, que se encuentran para ser fluorescente verde es una indicación de la cantidad de células que se encuentran en un estado de oxidación. CM-H 2 DCFDA es susceptible a la oxidación por un gran número de diferentes ROS. Esta falta de especificidad, respecto de los cuales ROS puede oxidar CM-H 2 DCFDA, hace que este compuesto un regente valiosa para su uso en las primeras etapas de una investigación de la patogénesis, ya que este ensayo puede ser utilizado para la detección de un ambiente oxidativo celular, independientemente de que el oxígeno radical o una combinación de ROS son los responsables de las condiciones celulares. Una vez que se ha establecido que las ROS se presentan por la oxidación de la CM-H 2 DCFDA, entonces experimentos adicionales se puede realizar para determinar qué combinación de ROS o ROS están implicados en el proceso de patogénesis particular. Los resultados de este estudio demuestran que con la adición de peróxido de hidrógeno un aumento de la CM-H 2 DCFDA fluorescencia se detectó en relación con los controles de solución salina, lo que indica que este ensayo es una prueba muy útil para la detección de un ambiente oxidativo en las células G355-5, un la línea celular de astrocitos felino.

Un método de cribado para detectar la oxidación celular entornos es medir la oxidación de la CM-H2DCFDA. Una vez oxidado dentro de una célula, CM-H2DCFDA cambios no fluorescentes en un compuesto fluorescente. Este cambio en la fluorescencia se mide mediante citometría de flujo e indica el número de células en un ambiente oxidativo.

Ensayo de detección de estrés oxidativo en una línea celular astrocitos felina, G355-5

Un mecanismo frecuentemente propuesto para el daño neuronal inducido por virus es el estrés oxidativo. Los astrocitos desempeñan un papel importante en el control del estrés oxidativo de...

Los astrocitos tienen un papel importante en el control del estrés oxidativo del sistema nervioso central, ayudando a mantener un entorno homeostático para las neuronas, así como a proteger a las neuronas de las especies reactivas de oxígeno. Aquí se presenta un método para evaluar el estrés oxidativo en astrocitos. Para ilustrar cómo funciona este ensayo, se aplica peróxido de hidrógeno y especies reactivas de oxígeno típicamente producidas durante el metabolismo celular a astrocitos felinos junto al ensayo.Para las especies reactivas de oxígeno, se añade a las células el indicador permeable a la célula CMH 2D CFDA. El CMH 2D CFDA entra en la célula como un compuesto no fluorescente, donde las esterasas celulares eliminan los grupos acetato. Si están presentes especies reactivas de oxígeno, el compuesto se oxida y se vuelve fluorescente.A continuación, las células se recolectan y la fluorescencia se analiza mediante citometría de flujo. El número de células fluorescentes indica la cantidad de células que se encuentran en un estado oxidativo. El objetivo, por supuesto, es determinar qué radicales de oxígeno específicos están presentes en las células mediante el uso de diferentes mé

screening-assay-for-oxidative-stress-feline-astrocyte-cell-line-g355

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video describe la técnica de visualización del estrés oxidativo en organoides cultivados. Este trabajo ayuda a comprender el nivel de estrés oxidativo debido a la acumulación de ROS en los distintos tipos celulares presentes en un organoide después del tratamiento con diferentes moduladores de ROS.

Ensayo de imágenes con sonda fluorescente: una técnica para visualizar el estrés oxidativo en las células organoides intestinales cultivadas tratadas con inductor de especies reactivas de oxígeno

Este video demuestra la evaluación de la salud mitocondrial en astrocitos modificados genéticamente, que expresan una proteína fluorescente dentro de sus mitocondrias. La proteína ayuda a rastrear los cambios en la salud mitocondrial a medida que su fluorescencia cambia de verde a rojo, lo que indica estrés o daño. Las imágenes se capturan y analizan utilizando varios parámetros.

Monitorización basada en fluorescencia del estrés mitocondrial en astrocitos

Accidente cerebrovascular isquémico es un evento complejo en el que la contribución específica de los astrocitos de la región del cerebro afectada expuesta a privación de glucosa oxígeno (OGD) es difícil de estudiar. Este artículo presenta una metodología para obtener aislados astrocitos y estudiar su reactividad y la proliferación en condiciones OGD.

Control de reactividad astrositos y proliferación in Vitro bajo condiciones isquémicas

Este manuscrito describe el uso de reporteros fluorógenos genéticamente codificados en una aplicación de imágenes de células vivas para el examen de estrés oxidativo inducido por xenobióticos. Este enfoque experimental ofrece inigualable resolución espaciotemporal, la sensibilidad y especificidad evitando muchas de las deficiencias de los métodos convencionales usados para la detección de estrés oxidativo toxicológica.

Enfoques de evaluación de estrés oxidativo toxicológico mediante sensores codificados genéticamente fluorógenos la proyección de imagen

Presentamos un protocolo para el desarrollo y uso de un modelo de estrés oxidativo mediante el tratamiento de células epiteliales pigmentarias de la retina con H2O2,analizando la morfología celular, la viabilidad, la densidad, el glutatión y el nivel de UCP-2. Es un modelo útil para investigar el efecto antioxidante de las proteínas secretadas por las células transfectadas por transposones para tratar la degeneración neurorretiniana.

Inducción y análisis del estrés oxidativo en células epiteliales pigmentarias de la retina humana transfectadas por transposones de la bella durmiente

Basado en experimentos in vitro , este estudio reveló el mecanismo de la crocetina en la reparación del daño por estrés oxidativo de los cardiomiocitos al influir en la mitofagia, en la que la vía de señalización PINK1 / Parkin juega un papel importante.

Protección de las células miocárdicas H9c2 del estrés oxidativo por crocetina a través de la mitofagia mediada por la vía PINK1 / Parkin

Este protocolo describe un método novedoso para cuantificar las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares utilizando dihidroetidio (DHE) como sonda de colorante de fluorescencia utilizando un enfoque de cribado de alto rendimiento. El protocolo describe los métodos para la evaluación cuantitativa de las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares en las tres líneas celulares diferentes de carcinoma hepatocelular.

Evaluación de cribado de alto rendimiento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante colorante de fluorescencia de dihidroetidio (DHE)

La cuantificación de las formas oxidadas y reducidas de glutatión (GSSG y GSH, respectivamente) se ha logrado mediante el uso de ortoftalaldehído (OPA). El OPA se vuelve altamente fluorescente una vez que se conjuga con GSH, pero no puede conjugar el GSSG hasta que se reduce. Aquí, describimos un ensayo multiparamétrico para cuantificar ambos utilizando la cuantificación de proteínas para la normalización.

Cuantificación rápida de formas oxidadas y reducidas de glutatión utilizando orto-ftalaldehído en células de mamífero cultivadas in vitro

Aquí describimos un protocolo que facilita la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en astrocitos funcionales específicos del prosencéfalo. Esto permite investigar el papel de las células gliales en la patogénesis de los trastornos del neurodesarrollo, como el síndrome del cromosoma X frágil, y modelar otros trastornos cerebrales.

Generación y caracterización de astrocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanamente que carecen de ribonucleoproteína mensajera X frágil

Este protocolo de vídeo demuestra un método novedoso para la generación y la posterior purificación de las células progenitoras neuronales de una fuente renovable de células madre neurales (NSC) en base a su físico (granularidad tamaño e interna) y las propiedades fluorescentes utilizando la tecnología de citometría de flujo.

El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo

Aprende a detectar estrés oxidativo en astrocitos felinos usando CM-H2DCFDA y citometría de flujo. Este método cuantifica especies reactivas de oxígeno para estudios de neuroprotección.

Ensayo de detección de estrés oxidativo en una línea celular astrocitos felina, G355-5

Explorar más videos