Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar colecciones de microorganismos con códigos de barras a nivel del genoma para comprender las interacciones gen-fármaco y gen-ambiente de manera altamente paralela. Esto se logra mediante el tamizaje de la colección de microorganismos durante cinco a 20 generaciones de crecimiento en presencia de un fármaco, utilizando robótica para mantener las células en crecimiento exponencial. Como segundo paso, se recolectan las células, lo que nos permite extraer ADN genómico de 4.000 a 6.000 individuos simultáneamente.

A continuación, los productos de PCR que comprenden las barras amplificadas se cuantifican mediante hibridación a microarreglo o secuenciación de barras para cuantificar dichas barras y, por lo tanto, determinar la abundancia de cada cepa en un grupo complejo. Finalmente, se obtienen resultados que indican qué mutantes con barras son sensibles a los tratamientos y, por consiguiente, se agotan del grupo durante el transcurso del experimento. La principal ventaja de la técnica que veremos hoy es que, en lugar de trabajar con cepas individualmente como colonias en placas o cultivos líquidos individuales, podemos analizar decenas o cientos de miles de cepas diferentes como un único grupo.

Así que, una vez que comprendimos el potencial de este ensayo, necesitamos automatizarlo, y afortunadamente, yo trabajaba en el sensor de Tecnología Genómica de Stanford, rodeado de ingenieros que me permitieron lograrlo. Hoy, Andrew Smith, un estudiante de posgrado avanzado en mi laboratorio, demostrará el protocolo, guiándonos a través de todos los procedimientos y sus pasos asociados, así como Tanya Durick, quien nos mostrará cómo realizar los aspectos de secuenciación del protocolo. Este protocolo utiliza una biblioteca de mutantes de Candida albicans generados mediante mutagénesis por transposón, en la que cada mutante porta una etiqueta codificada por barras que permite combinar mutantes individuales en un solo grupo. Una copia de la biblioteca se replica en 3 placas de 84.

Las placas de cultivo que contienen medio se incuban a 30 grados Celsius durante dos o tres días hasta que las colonias alcancen su tamaño máximo. Luego, trabajando en un entorno de microbiología con llama y material de laboratorio estéril, se inunda cada placa con cinco a 10 mililitros de medio y se deja en remojo durante cinco minutos. A continuación, se resuspenden las colonias con un espátula de siembra y se vierte el líquido junto con las células en un tubo cónico de centrífuga de 50 mililitros.

Añada DMSO hasta un 7%. Ajuste las células a una concentración final de OD 600 de 50 por mililitro con medio que contenga 7% de DMSO, luego alícuote volúmenes de 40 microlitros en tubos de tira para PCR; los alícuotas de células agrupadas pueden almacenarse indefinidamente a -80 grados Celsius. Para comenzar este procedimiento, descongele los alícuotas de células agrupadas sobre hielo, diluya inmediatamente el pool suavemente en medio con una droga o condición de elección, inoculando a una OD 600 de 0.0625 en un volumen total de 700 microlitros por pozo en una placa de 48 pozos. A efectos de este video, se prepararán tres réplicas de dos condiciones.

Incluya al menos un control de disolvente adecuado en la placa. Selle la placa con un sellador plástico, cultive las células en un espectrofotómetro o en un agitador con control de temperatura a 30 grados Celsius, con un régimen de agitación determinado experimentalmente. Por ejemplo, agite durante 14 minutos, lea las pocillos durante un minuto y luego reanude la agitación.

Parte de la suspensión celular puede ser recolectada por el robot y almacenada en una placa de cultivo en la plataforma robótica. En puntos de tiempo definidos por el usuario, típicamente a las 5, 10, 15 y 20 generaciones de crecimiento, recolecte al menos dos unidades de densidad óptica a 600 nm de células para cada muestra y punto de tiempo.

Transfiera las muestras celulares recolectadas a tubos de microcentrífuga de seguridad. Estas células pueden utilizarse entonces para la extracción de ADN genómico, lo cual se mostrará a continuación para comenzar este procedimiento. ADN genómico purificado a partir de células recolectadas en diferentes puntos de tiempo con un kit de levadura.

De acuerdo con las instrucciones del fabricante, con una modificación, eluir el ADN con 300 microlitros de TE 0,1 X. A continuación, preparar dos reacciones de PCR para cada muestra: una para las etiquetas UPT y otra para las etiquetas down.

Verifique los productos de PCR resultantes en un gel. Se espera un producto de 60 pares de bases para ambas PCR en los amplicones utilizados para hibridación, como se muestra en las bandas uno y tres. En este ejemplo, se espera un producto de 130 pares de bases para los amplicones destinados a la secuenciación de códigos de barras, como se muestra en las bandas cinco y siete.

En este momento, los productos de PCR pueden utilizarse ya sea para análisis de microarreglo o para secuenciación directa de códigos de barras, dependiendo de qué producto de PCR se haya generado. Para prepararse para el análisis de microarreglo, precaliente la temperatura del horno de hibridación a 42 grados Celsius y prepare un baño de agua hirviendo y un recipiente con hielo que contenga una mezcla de agua y hielo. Humedezca previamente los arreglos llenándolos lentamente con 120 microlitros de tampón de hibridación al uno por ciento.

Incube las matrices en el tampón de hibridación a 42 grados Celsius y 20 RPM durante 10 minutos. Mientras las matrices se incuban, prepare tubos de cierre hermético de 0,5 mililitros con 120 microlitros de hibridación por muestra más uno adicional como tampón en cada tubo. Añada 30 microlitros de PCR de secuencia de captación y 30 microlitros de PCR de secuencia marcadora descendente a la mezcla de hibridación para un volumen total de 150 microlitros.

Hervir durante dos minutos y colocar en agua con hielo durante al menos dos minutos. Centrifugar brevemente los tubos antes de su uso. Retirar el tampón de prehibridación de los arreglos y agregar 120 microlitros de la mezcla de hibridación de PCR para prevenir la evaporación.

Cubra las juntas del arreglos con un tapón resistente, hibridice durante 16 horas a 42 grados Celsius y 20 RPM. Retire los arreglos del horno de hibridación y elimine los tapones resistentes de los chips. Retire lentamente la mezcla de hibridación de los arreglos mediante pipeta y llene los arreglos.

Con 120 microlitros de lavado A, cargue las matrices en el lavador de la estación fluidica cebada. Las matrices se lavarán utilizando el protocolo gene Flex SV 3 4 50 con las siguientes modificaciones: un paso adicional con lavado A antes de la tinción.

Lave B, con una temperatura de 42 grados Celsius en lugar de 40 grados Celsius, y tiña a 42 grados Celsius en la estación fluidica en lugar de a 25 grados Celsius. Tras las operaciones fluidicas, ejecute la estación fluidica, detenga el protocolo cuatro 50. Descargue el lavador después de asegurarse de que no haya burbujas de aire presentes.

Coloque las matrices en el escáner y realice el escaneo a una longitud de onda de emisión de 560 nanómetros. El producto de PCR de 130 pares de bases se utiliza para la secuenciación de códigos de barras de próxima generación con el fin de separar inicialmente 12 muestras de ADN en un gel de PAGE al 12%. A continuación, tiña el gel con verde cyber y corte la banda de gel de interés.

El ADN extraído del gel se cuantifica luego mediante PCR en tiempo real para generar agrupamientos en una celda de flujo de lectura simple utilizando el CBOT y el kit de generación de agrupamientos de lectura simple. Cargue la celda de flujo en el secuenciador y observe la primera base que se libera. El secuenciador mostrado aquí es una matriz representativa. Los datos recopilados en ciertos puntos del protocolo.

El grupo de mutantes marcados se cultivó durante 20 generaciones en presencia del agente antifúngico clotrimazol y en DMSO como control; se calculó y representó gráficamente la razón logarítmica en base dos para cada gen. Todos aquellos cepas que son significativamente sensibles al tratamiento con clotrimazol, con una razón logarítmica en base dos de dos, se resaltan en rojo. Cuatro cepas se muestran en este ejemplo: NCP uno, ERG dos y dos alelos independientes de ERG 11.

Debe verificarse que los blancos proteicos conocidos del fármaco antifúngico clotrimazol, identificados como sensibles en una pantalla agrupada, sean sensibles en ensayos individuales de crecimiento en presencia de la misma concentración del fármaco. Este siguiente gráfico muestra los resultados de un experimento de confirmación realizado aquí. Las cuatro cepas detectadas en la pantalla presentaron un crecimiento reducido en comparación con la cepa parental de tipo salvaje.

BWP 17 indicado en negro. Estas curvas individuales de crecimiento destacan una característica importante de estas pantallas genéticas de fármacos agrupadas, que consiste en que el rango absoluto de una cepa particular no refleja necesariamente su nivel exacto de sensibilidad. Además, los resultados muestran el valor de contar con múltiples alelos para cada gen.

En este caso, los dos mutantes con interrupción de ERG 11 presentan sensibilidades ligeramente diferentes al fármaco. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco días, desde la inoculación del ensayo hasta el análisis de los datos, si se lleva a cabo correctamente. Por lo tanto, aunque cada experimento individual revele información biológica, el verdadero potencial surge cuando se han realizado muchos experimentos y se ha recopilado una base de datos que permite predecir la función génica y la acción de los fármacos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar colecciones de mutantes con códigos de barras a nivel del genoma para cribados en grupo, y también de cómo utilizar microrrayos o secuenciación para identificar los genes de interés tras su desarrollo. Esta técnica permitió a los investigadores en el campo de la genómica funcional explorar la función de cada uno de los 6.000 genes diferentes en el genoma de la levadura.