Name: Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Aprende a realizar pantallas competitivas genómicas con bibliotecas de levadura con código de barras para estudiar interacciones gen-droga en Candida albicans. Este método automatizado permite analizar miles de mutantes simultáneamente.

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Damos las gracias a Ron Davis, Deutschbauer Adán, y el laboratorio de HIP HOP todo en la Universidad de Toronto para el debate y asesoramiento. CN es apoyado por becas de la National Human Genome Research Institute (número de concesión HG000205), RO1 HG003317, CIHR MOP-84305, y la Sociedad Canadiense del Cáncer (# 020380). JO fue apoyada por el Programa de Entrenamiento de Stanford Genome (número de concesión T32 HG00044 de la National Human Genome Research Institute) y los Institutos Nacionales de Salud (número de concesión P01 GH000205). GG es apoyado por el NHGRI HG003317 SR1 y la Sociedad Canadiense del Cáncer, subvención n º 020380, TD y el Centro de Secuenciación Donnelly es apoyado en parte por subvenciones de la Fundación Canadiense para la Innovación a los Dres. Brenda Andrews y Greenblatt Jack. AMS es apoyado por una beca de la Universidad de Toronto en Abrir.

<ol><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li>
<li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li>
<li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li>
<li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetic+Landscape+of+a+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomic+profiling%3A+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li>
<li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li>
<li>Nislow, C., Giaever, G. Chapter 387. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNislow%2C+C+%22Yeast+Gene+Analysis%22">Yeast Gene Analysis</a>. Stark, I., Stansfields, M. J. R. , 2nd Edition, Elsevier Ltd. 387-414 (2007).</li>
<li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. Cold Spring Harbor Laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd. edn, Cold Spring Harbor Laboratory. (2001).</li>
<li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li>
<li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li>
<li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este sentido, se indica un protocolo que, con la modificación de modesto, se puede adaptar fácilmente a una amplia gama de las colecciones existentes de código de barras colecciones de mutantes de microorganismos diferentes para crear colecciones de mutantes marcados. Hacemos hincapié en que, si bien nos han informado de un protocolo sobre la mutagénesis de transposones etiquetados para el patógenos levadura C. albicans, un protocolo muy similar podría ser adaptado a una amplia variedad de hongos unicelulares. Modificado, este protocolo funciona muy bien en las bacterias 13, y en la actualidad las colecciones de un número adicional de genomas de hongos y bacterias se encuentran en construcción. En la actualidad, este ensayo proporciona la única completa de todo el genoma de pantalla imparcial de las interacciones gen-molécula pequeña. Una característica particularmente atractiva de este ensayo es que ningún conocimiento previo del gen o una molécula pequeña es necesaria. A pesar del alcance y el poder de estos ensayos, que se puedan transferir a otros laboratorios se ha visto obstaculizada tanto por la inversión de capital inicial y las herramientas informáticas para el análisis de los resultados. Con la adopción de una lectura de la generación siguiente secuencia en combinación con potentes herramientas para el análisis, se espera su aprobación para aumentar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibióticos </td><td> Proveedor y números de catálogo </td></tr><tr><td> Carbenicilina </td><td> Sigma, parte # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamicina </td><td> Sigma, parte # K1876 </td></tr><tr><td> espectinomicina </td><td> Sigma, parte # S0692 </td></tr><tr><td> Cloranfenicol </td><td> Sigma, parte # C0378 </td></tr><tr><td> ADN de limpieza y kits de concentración </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kit </td><td> Qiagen, parte # 27106 </td></tr><tr><td> Kit Hi-Speed ​​Maxi plásmido </td><td> Qiagen, parte # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR kit de purificación </td><td> Qiagen, parte # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen, parte # 28704 </td></tr><tr><td> PCR y los reactivos de electroforesis </td><td></td></tr><tr><td> Taq ADN polimerasa (Mg libre) Buffer </td><td> New England Biolabs, parte # M0320L </td></tr><tr><td> Mezcle la solución desoxinucleótidos </td><td> New England Biolabs, parte # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, parte # 63036 </td></tr><tr><td> Agarosa, colorante de carga, y el ácido nucleico mancha adecuada para electroforesis en gel </td><td> Varios </td></tr><tr><td> 10X tampón TAE </td><td> Sigma, parte # T8280 </td></tr><tr><td> Más de 1 Kb DNA Ladder </td><td> Invitrogen, parte # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD caldo </td><td></td></tr><tr><td> 10 g de extracto de levadura </td><td> Sigma, parte # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g de Bacto peptona </td><td> BD Biosciences, parte # 211677 </td></tr><tr><td> 20 g de dextrosa </td><td> Sigma, parte # D9434 </td></tr><tr><td> Material de laboratorio </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas multicanal (1000, 200, y el l 20) </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Depósitos desechables pipeteo </td><td> Varios </td></tr><tr><td> 15 y 50 tubos de centrifugación ml </td><td> Varios </td></tr><tr><td> 96 - y 384-Pozo Profundo placas </td><td> Axygen Scientific, parte # P-2ML-SQ-CS &amp; P 384240SQCS- </td></tr><tr><td> 96 y 384 así-PCR placas y película de sellado </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Compactador para el sellado de varias placas </td><td> Sigma, parte # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C y 37 ° C agitando incubadoras para el cultivo de bacterias y levaduras en las placas y tubos </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Transposón mutagénesis in vitro </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 transposasa </td><td> Epicentro biotecnologías, parte # TNP92110 </td></tr><tr><td> De alto rendimiento de la transformación </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT Kit de Preparación plásmido </td><td> Borde Biosystems, part # 84359 </td></tr><tr><td> polietilenglicol, peso molecular 3350 </td><td> Varios </td></tr><tr><td> acetato de litio </td><td> Sigma, parte # 517992 </td></tr><tr><td> Placas de 6 pocillos, estériles </td><td> Corning, parte # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / ml uridina </td><td> Sigma, parte # U3750 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA solución </td><td> Sigma, parte # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> Varios </td></tr><tr><td> salmón testículos ADN </td><td> Sigma, parte # 1626 </td></tr><tr><td> El crecimiento de las colecciones de código de barras </td><td></td></tr><tr><td> 48 placas, y si en las placas de crecimiento de cultivos </td><td> Greiner, parte # M9437 </td></tr><tr><td> Sellos adhesivos placa </td><td> ABgene, parte # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 ml frascos de cultivo </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Espectrofotómetro capaz de absorbancia </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Con control de temperatura agitador de matraces de 250 ml o espectrofotómetro temblor </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Safe-Lock Microcentrífuga tubo, 2 mL </td><td> Eppendorf, parte # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Hibridación equipo </td><td></td></tr><tr><td> Horno de hibridación 640 </td><td> Affymetrix, parte # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip neumático Estación 450 </td><td> Affymetrix, pieza # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Scanner 3000 </td><td> Affymetrix, pieza # 00-0212 </td></tr><tr><td> Baño de agua hirviendo con bastidor flotante </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Consumibles de hibridación </td><td></td></tr><tr><td> Genflex etiqueta 16K matriz v2 </td><td> Affymetrix, parte # 511331 </td></tr><tr><td> Solución de Denhardt, concentrado 50 veces </td><td> Sigma, parte # D2532 </td></tr><tr><td> Estreptavidina, R-ficoeritrina conjugado (SAPE) </td><td> Invitrogen, parte # S866 </td></tr><tr><td> Safe-Lock Microcentrífuga tubos de 0,5 mL </td><td> Eppendorf, parte # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Teeny Tough-Spots </td><td> Diversificación de la biotecnología, parte # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M </td><td> BioRad, part # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% de Tween </td><td> Sigma, parte # T2700 </td></tr><tr><td> MES monohidrato de ácido libre </td><td> Sigma, parte # M5287 </td></tr><tr><td> MES sal de sodio </td><td> Sigma, parte # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> Sigma, parte # 71386 </td></tr><tr><td> 20X PEES </td><td> Sigma, parte # S2015 </td></tr><tr><td> La biología molecular del agua de grado </td><td> Sigma, parte # W4502 </td></tr><tr><td> Primers hibridación </td><td> Varios proveedores (desalación estándar) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;con biotina GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;con biotina GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;con biotina CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Secuenciación Primers: Plataforma Illumina </td><td> Varios proveedores </td></tr><tr><td> UpTag Adelante (100um) </td><td> 5 &#39;AAC GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC GAT T GTC CAC GAG GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag inversa (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN GTC CAG CAG CTG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Adelante (100um) </td><td> 5 &#39;AAC GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T AAC GAA GAG CTC GAA TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag inversa (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN CGG TGT TCT CGG CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> Leer 1 UP-tag siguientes cebadores (100um) </td><td> 5 &#39;GTC CAG CAG CTG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Leer 1 ABAJO-tag imprimación siguientes (100um) </td><td> 5 &#39;TGT CGG CGG CGT TCT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> Lea 2 cebador de secuenciación Índice (de serie Illumina imprimación R1) (100um) </td><td> 5 &#39;AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> Reactivos adicionales Secuenciación / Equipo </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF Kit de purificación de PCR </td><td> Qiagen, parte # 29051 </td></tr><tr><td> Bomba de vacío </td><td> Cualquier proveedor </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel vacío en el colector </td><td> Macherey-Nagel, parte # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Kit de ensayo </td><td> Invitrogen, parte # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen Qubit tubos de ensayo </td><td> Invitrogen, parte # Q32856 </td></tr><tr><td> 40% de acrilamida y 1% de N, N&#39;-metilen-bis-acrilamida, 37.5:1 </td><td> Bio Rad, part # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma, parte # T1503-1kg </td></tr><tr><td> Ácido bórico </td><td> Sigma, parte # B6768-500G </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td><td> Teknova, parte # E0306 </td></tr><tr><td> Persulfato de amonio </td><td> Sigma, parte # A3678-25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop, parte # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Solución de bromuro de etidio </td><td> Bioshop, parte # ETB444.10 </td></tr><tr><td> Acetato de amonio 0,5 M </td><td> Teknova, parte # A2000 </td></tr><tr><td> 10 mM de acetato de magnesio tetrahidratado </td><td> Sigma, parte # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1 mM EDTA, pH 8,0 </td><td> Ver 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Acetato de sodio, pH 5,2 </td><td> Teknova, parte # S0297 </td></tr><tr><td> Velocidad de vacío </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Lea solo racimo kit de generación de </td><td> Illumina, parte # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> 36c Secuenciación Kit v4 </td><td>Illumina, parte # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> Receta de TBE 10X <table border="1"><tbody><tr><td> Cantidades </td><td> Reactivos </td></tr><tr><td> 108 gramos </td><td> Tris Base </td></tr><tr><td> 55 gramos </td><td> Ácido bórico </td></tr><tr><td> 40 ml </td><td> 0,5 M EDTA (pH 8,0) </td></tr><tr><td colspan="2"> Añadir dH 2 O a 1 litro marca </td></tr></tbody></table> 12% de poliacrilamida gel receta <table border="1"><tbody><tr><td> Volúmenes </td><td> Reactivos </td></tr><tr><td> 5,8 ml </td><td> 40% de acrilamida y 1% de N, N&#39;-metilen-bis-acrilamida, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> TBE 10X </td></tr><tr><td> 140 l </td><td> 10% de persulfato de amonio </td></tr><tr><td> El volumen total de: 20 ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag mezcla de cebadores: Resuspender Uptag y Buptagkanmx4 cada uno en ddH2O a 100 M, a continuación, mezclar en una proporción de 1:1 para una concentración final de 50 M cada uno. Almacenar a -20 ° C. Downtag mezcla de cebadores: Resuspender Dntag y Bdntagkanmx4 cada uno en ddH2O a 100 M, a continuación, mezclar en una proporción de 1:1 para una concentración final de 50 M cada uno. Almacenar a -20 ° C. Oligonucleótidos mixtos: Resuspender cada uno de los siguientes ocho oligos (estándar desalada) en ddH2O a 100 M: Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. Mezclar un volumen igual de los ocho oligonucleótidos para una concentración final de 12,5 M cada uno. 12X MES acciones: De 10 ml, disolver 0,7 g de monohidrato de ácido libre MES y 1,93 g de sal de sodio MES en 8 ml de agua de grado molecular biología. Después de mezclar bien, verificar el pH y ajustar si es necesario a un pH 6.5 a 6.7. Añadir agua hasta un volumen total de 10 ml. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C protegido de la luz (por ejemplo, envolver el tubo de papel de aluminio). Reemplace si la solución se vuelve visiblemente amarilla o después de 6 meses. Tampón de hibridación 2X: De 50 ml, mezclar 8,3 ml de 12X MES acciones (de 02/09/14), 17,7 ml de 5 M NaCl, 4,0 ml de EDTA 0,5 M, 0,1 ml de 10% de Tween 20 (vol / vol), y 19,9 ml de filtrado ddH 2 O. Filtro de esterilización. Lavar A: Mezclar 300 ml de 20X SSPE, 1 ml de Tween 10% (vol / vol), 699 ml ddH 2 O. Filtro de esterilización. Lave B: Mezcle 150 ml 20X SSPE, 1 ml de Tween 10% (vol / vol), 849 ml ddH 2 O. Filtro de esterilización. Cebadores de secuenciación de códigos de barras En primer secuencias UP-etiqueta de los 5 &#39;de cola (en negrita) son secuencias de Illumina adaptador específico incorporado en el primer F y R. La secuencia variable (cursiva) representa la etiqueta de indexación 5-mer utilizados en la multiplexación / índice de lectura. La cola de la 3 &#39;(subrayado) representa el primer comunes que flanquean el código de barras uptag y es necesario ampliar los códigos de barras de levadura. En ABAJO-tag imprimación secuencias 5 &#39;es idéntica a la cola 5&#39; de la cola de la UP-etiqueta de cebadores (secuencia específica de iluminación), sin embargo, el 3 &#39;de cola (subrayado) se sustituye con los primers comunes que se utilizan para amplificar la baja etiqueta de código de barras.

pantallas competitiva genómica de bibliotecas de levadura con código de barras

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

En virtud de los avances en las tecnologías de secuenciación de próxima generación, tenemos acceso a nuevas secuencias del genoma casi a diario. El ritmo de estos avances se está acelerando, prometiendo una mayor profundidad y amplitud. A la luz de estos avances extraordinarios, la necesidad de métodos rápidos, en paralelo a definir la función del gen se vuelve cada vez más importante. Las colecciones de mutantes de deleción en todo el genoma de las levaduras y E. coli han servido como bestias de carga para la caracterización funcional de la función del gen, pero este método no es escalable, actual deleción del gen enfoques requieren cada uno de los miles de genes que componen un genoma que se eliminan y verifican. Sólo después de este trabajo está completo podemos seguir de alto rendimiento fenotipificación. Durante la última década, nuestro laboratorio ha refinado con una cartera de la competencia, en miniatura, de alto rendimiento de todo el genoma ensayos que se pueden realizar en paralelo. Este paralelismo es posible gracias a la inclusión de &quot;etiquetas&quot; de ADN, o &quot;códigos de barras,&quot; en cada mutante, con el código de barras que sirve como indicador de la mutación y se puede medir la abundancia de código de barras que evaluará su aptitud mutante. En este estudio, se busca llenar el vacío entre la secuencia de ADN y con código de barras colecciones de mutantes. Para lograr esto, se introduce una interrupción transposón combinado-código de barras del enfoque que abre los ensayos paralelos de código de barras que recientemente secuenciado, pero mal caracterizado microbios. Para ilustrar este enfoque se presenta una nueva colección de Candida albicans interrupción de código de barras y describir cómo los microarrays basado en la próxima generación basada en la secuencia de plataformas se pueden utilizar para recoger 10.000 - 1.000.000 gen-gen y las drogas las interacciones entre genes en un solo experimento.

Hemos desarrollado completa e imparcial en todo el genoma para comprender las pantallas de genes de drogas y las interacciones genético-ambientales. Métodos para la detección de estas colecciones mutantes se presentan.

Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras

Gracias a los avances en las tecnologías de secuenciación de nueva generación, tenemos acceso a nuevas secuencias genómicas casi a diario. El ritmo de estos avances es...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar colecciones de microorganismos con códigos de barras a nivel del genoma para comprender las interacciones gen-fármaco y gen-ambiente de manera altamente paralela. Esto se logra mediante el tamizaje de la colección de microorganismos durante cinco a 20 generaciones de crecimiento en presencia de un fármaco, utilizando robótica para mantener las células en crecimiento exponencial. Como segundo paso, se recolectan las células, lo que nos permite extraer ADN genómico de 4.000 a 6.000 individuos simultáneamente.A continuación, los productos de PCR que comprenden las barras amplificadas se cuantifican mediante hibridación a microarreglo o secuenciación de barras para cuantificar dichas barras y, por lo tanto, determinar la abundancia de cada cepa en un grupo complejo. Finalmente, se obtienen resultados que indican qué mutantes con barras son sensibles a los tratamientos y, por consiguiente, se agotan del grupo durante el transcurso del experimento. La principal ventaja de la técnica que veremos hoy es que, en lugar de trabajar con cepas individualmente como colonias en placas o cultivos líquidos individuales, podemos analizar decenas o cientos de miles de cepas diferentes como un único grupo.Así que, una vez que comprendimos el potencial de este ensayo, necesitamos automatizarlo, y afortunadamente, yo trabajaba en el sensor de Tecnología Genómica de Stanford, rodeado de ingenieros que me permitieron lograrlo. Hoy, Andrew Smith, un estudiante de posgrado avanzado en mi laboratorio, demostrará el protocolo, guiándonos a través de todos los procedimientos y sus pasos asociados, así como Tanya Durick, quien nos mostrará cómo realizar los aspectos de secuenciación del protocolo. Este protocolo utiliza una biblioteca de mutantes de Candida albicans generados mediante mutagénesis por transposón, en la que cada mutante porta una etiqueta codificada por barras que permite combinar mutantes individuales en un solo grupo. Una copia de la biblioteca se replica en 3 placas de 84.Las placas de cultivo que contienen medio se incuban a 30 grados Celsius durante dos o tres días hasta que las colonias alcancen su tamaño máximo. Luego, trabajando en un entorno de microbiología con llama y material de laboratorio estéril, se inunda cada placa con cinco a 10 mililitros de medio y se deja en remojo durante cinco minutos. A continuación, se resuspenden las colonias con un espátula de siembra y se vierte el líquido junto con las células en un tubo cónico de centrífuga de 50 mililitros.Añada DMSO hasta un 7%. Ajuste las células a una concentración final de OD 600 de 50 por mililitro con medio que contenga 7% de DMSO, luego alícuote volúmenes de 40 microlitros en tubos de tira para PCR; los alícuotas de células agrupadas pueden almacenarse indefinidamente a -80 grados Celsius. Para comenzar este procedimiento, descongele los alícuotas de células agrupadas sobre hielo, diluya inmediatamente el pool suavemente en medio con una droga o condición de elección, inoculando a una OD 600 de 0.0625 en un volumen total de 700 microlitros por pozo en una placa de 48 pozos. A efectos de este video, se prepararán tres réplicas de dos condiciones.Incluya al menos un control de disolvente adecuado en la placa. Selle la placa con un sellador plástico, cultive las células en un espectrofotómetro o en un agitador con control de temperatura a 30 grados Celsius, con un régimen de agitación determinado experimentalmente. Por ejemplo, agite durante 14 minutos, lea las pocillos durante un minuto y luego reanude la agitación.Parte de la suspensión celular puede ser recolectada por el robot y almacenada en una placa de cultivo en la plataforma robótica. En puntos de tiempo definidos por el usuario, típicamente a las 5, 10, 15 y 20 generaciones de crecimiento, recolecte al menos dos unidades de densidad óptica a 600 nm de células para cada muestra y punto de tiempo.Transfiera las muestras celulares recolectadas a tubos de microcentrífuga de seguridad. Estas células pueden utilizarse entonces para la extracción de ADN genómico, lo cual se mostrará a continuación para comenzar este procedimiento. ADN genómico purificado a partir de células recolectadas en diferentes puntos de tiempo con un kit de levadura.De acuerdo con las instrucciones del fabricante, con una modificación, eluir el ADN con 300 microlitros de TE 0,1 X. A continuación, preparar dos reacciones de PCR para cada muestra: una para las etiquetas UPT y otra para las etiquetas down.Verifique los productos de PCR resultantes en un gel. Se espera un producto de 60 pares de bases para ambas PCR en los amplicones utilizados para hibridación, como se muestra en las bandas uno y tres. En este ejemplo, se espera un producto de 130 pares de bases para los amplicones destinados a la secuenciación de códigos de barras, como se muestra en las bandas cinco y siete.En este momento, los productos de PCR pueden utilizarse ya sea para análisis de microarreglo o para secuenciación directa de códigos de barras, dependiendo de qué producto de PCR se haya generado. Para prepararse para el análisis de microarreglo, precaliente la temperatura del horno de hibridación a 42 grados Celsius y prepare un baño de agua hirviendo y un recipiente con hielo que contenga una mezcla de agua y hielo. Humedezca previamente los arreglos llenándolos lentamente con 120 microlitros de tampón de hibridación al uno por ciento.Incube las matrices en el tampón de hibridación a 42 grados Celsius y 20 RPM durante 10 minutos. Mientras las matrices se incuban, prepare tubos de cierre hermético de 0,5 mililitros con 120 microlitros de hibridación por muestra más uno adicional como tampón en cada tubo. Añada 30 microlitros de PCR de secuencia de captación y 30 microlitros de PCR de secuencia marcadora descendente a la mezcla de hibridación para un volumen total de 150 microlitros.Hervir durante dos minutos y colocar en agua con hielo durante al menos dos minutos. Centrifugar brevemente los tubos antes de su uso. Retirar el tampón de prehibridación de los arreglos y agregar 120 microlitros de la mezcla de hibridación de PCR para prevenir la evaporación.Cubra las juntas del arreglos con un tapón resistente, hibridice durante 16 horas a 42 grados Celsius y 20 RPM. Retire los arreglos del horno de hibridación y elimine los tapones resistentes de los chips. Retire lentamente la mezcla de hibridación de los arreglos mediante pipeta y llene los arreglos.Con 120 microlitros de lavado A, cargue las matrices en el lavador de la estación fluidica cebada. Las matrices se lavarán utilizando el protocolo gene Flex SV 3 4 50 con las siguientes modificaciones: un paso adicional con lavado A antes de la tinción.Lave B, con una temperatura de 42 grados Celsius en lugar de 40 grados Celsius, y tiña a 42 grados Celsius en la estación fluidica en lugar de a 25 grados Celsius. Tras las operaciones fluidicas, ejecute la estación fluidica, detenga el protocolo cuatro 50. Descargue el lavador después de asegurarse de que no haya burbujas de aire presentes.Coloque las matrices en el escáner y realice el escaneo a una longitud de onda de emisión de 560 nanómetros. El producto de PCR de 130 pares de bases se utiliza para la secuenciación de códigos de barras de próxima generación con el fin de separar inicialmente 12 muestras de ADN en un gel de PAGE al 12%. A continuación, tiña el gel con verde cyber y corte la banda de gel de interés.El ADN extraído del gel se cuantifica luego mediante PCR en tiempo real para generar agrupamientos en una celda de flujo de lectura simple utilizando el CBOT y el kit de generación de agrupamientos de lectura simple. Cargue la celda de flujo en el secuenciador y observe la primera base que se libera. El secuenciador mostrado aquí es una matriz representativa. Los datos recopilados en ciertos puntos del protocolo.El grupo de mutantes marcados se cultivó durante 20 generaciones en presencia del agente antifúngico clotrimazol y en DMSO como control; se calculó y representó gráficamente la razón logarítmica en base dos para cada gen. Todos aquellos cepas que son significativamente sensibles al tratamiento con clotrimazol, con una razón logarítmica en base dos de dos, se resaltan en rojo. Cuatro cepas se muestran en este ejemplo: NCP uno, ERG dos y dos alelos independientes de ERG 11.Debe verificarse que los blancos proteicos conocidos del fármaco antifúngico clotrimazol, identificados como sensibles en una pantalla agrupada, sean sensibles en ensayos individuales de crecimiento en presencia de la misma concentración del fármaco. Este siguiente gráfico muestra los resultados de un experimento de confirmación realizado aquí. Las cuatro cepas detectadas en la pantalla presentaron un crecimiento reducido en comparación con la cepa parental de tipo salvaje.BWP 17 indicado en negro. Estas curvas individuales de crecimiento destacan una característica importante de estas pantallas genéticas de fármacos agrupadas, que consiste en que el rango absoluto de una cepa particular no refleja necesariamente su nivel exacto de sensibilidad. Además, los resultados muestran el valor de contar con múltiples alelos para cada gen.En este caso, los dos mutantes con interrupción de ERG 11 presentan sensibilidades ligeramente diferentes al fármaco. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco días, desde la inoculación del ensayo hasta el análisis de los datos, si se lleva a cabo correctamente. Por lo tanto, aunque cada experimento individual revele información biológica, el verdadero potencial surge cuando se han realizado muchos experimentos y se ha recopilado una base de datos que permite predecir la función génica y la acción de los fármacos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar colecciones de mutantes con códigos de barras a nivel del genoma para cribados en grupo, y también de cómo utilizar microrrayos o secuenciación para identificar los genes de interés tras su desarrollo. Esta técnica permitió a los investigadores en el campo de la genómica funcional explorar la función de cada uno de los 6.000 genes diferentes en el genoma de la levadura.

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Investigación

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Biology

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