Name: Intraluminal la arteria cerebral media de oclusión (MCAO) Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Aprende el modelo MCAO intraluminal para estudiar ictus isquémico en ratones usando flujometría láser Doppler. Este método permite inducir isquemia y reperfusión de forma reproducible en investigación neurovascular.

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Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Florida y está en conformidad con el "Principio de Cuidado de Animales de Laboratorio" (NIH publicación N º 86-23, revisado en 1985). 1. Materiales <ol><li> Animales: Los ratones machos C57BL / 6 (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, EE.UU.) con un peso 20 a 26 gramos en el momento de la cirugía. </li><li> Anestesia: <ol><li> Máquina de anestesia: La inhalación VetEquip sistema de anestesia (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, EE.UU.). </li><li> Anestésicos por inhalación: El isoflurano (Farmacia Baxter, Deerfield, IL). </li></ol></li><li> Instrumentos quirúrgicos: SuperCut tijeras Iris y recto (Instrumentos de Precisión World, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.); Vannas micro-tijeras y recto (Instrumentos World Precision, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.), Dumont pinzas (de punta fina, 45 ° puntas dobladas, Instrumentos del Mundo de precisión, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.), unidad de coagulación bipolar (Desecador Alta Frecuencia 900, Instrumentos del Mundo de precisión, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.), clip de buques micro (Instrumentos del Mundo de precisión, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.) </li><li> Material quirúrgico: puntas estériles de algodón, toallitas húmedas, gasas, suturas (7-0 sutura de seda, Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EE.UU.), adhesivo tisular (Vetbond, 3M Company, St. Paul, MN, EE.UU.), lavado quirúrgico : Bethadine, el 70% de etanol, y estéril salina al 0,9%; Ungüento para los ojos (ungüento Puralube Vet, Pharmaderm, Melville, NY, EE.UU.). </li><li> La oclusión de sutura preparación para MCAO: <ol><li> Filamento de MCA oclusión: 7-0 suturas quirúrgicas monofilamento de nylon (Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EE.UU.). </li><li> Fuente de calor para embotar la punta de sutura (Unidad de cauterio térmico, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL). </li><li> De silicona líquida de caucho (silicona RTV adhesivo, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.). </li></ol></li><li> Cirugía / Microscopio de disección (microscopio Leica Stereo MZ6). <ol><li> Iluminación de fibra óptica (iluminador de fibra óptica FO1-150, TechniQuip Corp., Livermore, CA, EE.UU.). </li></ol></li><li> Flujometría láser Doppler (Periflux System 5000, Perimed, Estocolmo, Suecia). <ol><li> Flexible micropunta (micropunta MT B500-0 recta, Perimed, Estocolmo, Suecia) </li></ol></li><li> Parámetros de temperatura: <ol><li> Controlar temperaturas rectales (MTD-12, Instrumentos del Mundo de precisión, Inc., Sarasota, FL). </li><li> Manta térmica (T / bomba, TP600, Gaymar, NY, EE.UU.). </li></ol></li><li> Las manchas y la medición cuantitativa de infarto de volumen: <ol><li> 2% de solución de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC 2%, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, EE.UU.). </li><li> Los ratones del cerebro matriz cortadora (Zivic-Miller laboratorio., Inc., Allison Park, PA, EE.UU.). </li><li> Cámara digital (V1253, Kodak Co., Rochester, NY, EE.UU.). </li><li> Image J software (software ImageJ 1.42q, EE.UU. National Institutes of Health, Bethesda, MA, EE.UU.). </li></ol></li></ol> 2. Pre-quirúrgico pasos <ol><li> Antes de la cirugía, los ratones se encuentran en un 12:12 luz / oscuridad ciclo con acceso libre a comida y agua de roedores. </li><li> Suturas para MCAO son preparados por embotamiento de 1-2mm de la punta del hilo de sutura con el calor y la capa 3 a 4 mm del eje de la sutura de la punta con caucho de silicona líquido, permitiendo que se seque (7-0; diámetro de la punta, 0.20-0.25 mm, revestimiento de longitud, 3-4mm, longitud de la sutura 11-13mm). La esterilidad se debe preservar en todos los pasos antes mencionados. </li><li> Después de sopesar el ratón, la anestesia se induce con un 4% de isoflurano en una cámara de inducción y mantenimiento durante el procedimiento de 1.5-2% de isoflurano en el 30% de O 2 y el 70% de N 2 O mezcla de gas a través de una mascarilla. </li><li> El ratón es colocado en una posición en decúbito prono sobre una gasa acostado en una superficie de trabajo con control de temperatura (manta térmica), la piel de la cabeza rapada. </li><li> Ungüento oftálmico lubricante se aplica tanto a los ojos y los párpados se cierran los ojos para evitar la desecación durante el proceso quirúrgico. </li><li> Una incisión (1 cm) se hace en la piel que recubre la bóveda craneal de la línea nucal superior a la nasion y la piel se estira lateralmente para fijar un micropunta flexible (MT B500-0 micropunta recta, 0,5 mm de diámetro). El micropunta se coloca perpendicular a la superficie del cráneo parietal derecho (1 mm por detrás y 5 mm lateral al bregma) para controlar el flujo de sangre en el territorio de la ACM por flujometría láser-doppler. </li><li> Asegúrese de que la micropunta flexible unidos al cráneo con firmeza antes de que el animal se volvió hacia una posición de decúbito supino. El cuello del animal se coloca en una almohadilla suave y su nariz se lleva a cabo en el cono de la nariz del aparato de anestesia. Esto se traducirá en tener suficiente espacio para la micropunta flexible. </li><li> Una sonda de temperatura rectal se inserta para mantener una temperatura constante de animales núcleo de 37 ± 0,5 ° C. </li><li> Tanto las patas delanteras y las patas traseras se pegan a la superficie de la plataforma de operación, y la cola se pega al tubo rectal. </li> &lt;/ Ol&gt; 3. MCA oclusión cirugía: <ol><li> Bajo el microscopio quirúrgico, una incisión en línea media del cuello se realiza con unas tijeras entre el manubrio y la mandíbula con cuidado, levantando la piel suelta. </li><li> Los pares de glándulas submandibulares subyacentes son francamente dividida, con la glándula izquierda dejados in situ. La glándula submandibular derecha se retrae cranealmente y asegurados junto con el músculo esternocleidomastoideo. </li><li> La división expuesta del músculo omohioideo que cubre la vaina carotídea es cuidadosamente dividida con pastillas. </li><li> La arteria carótida común derecha (CCA) ha sido cuidadosamente separados y aislados del nervio vago y su vaina (que se encuentra lateral al CCA). </li><li> En adelante, los 2 métodos quirúrgicos que se han utilizado con frecuencia para llevar a cabo MCA oclusión divergen: </li></ol> 4 de Koizumi método <ol class="lroman" type="i"><li> Tres puntos de sutura collar suelto (7-0 de seda) se preparan todo el derecho de CCA. </li><li> La arteria carótida externa (ACE) es identificado, aislado y cauterizar (2-3mm distal a la bifurcación). Posteriormente, se pueden dividir con micro-tijeras. Para evitar daños involuntarios periférica en el sitio de cauterización, la potencia debe fijarse en 1 usando el mando de potencia. Esto es consistente para todas las cauterizaciones. </li><li> Suficiente tensión se aplica a la sutura de cuello más proximal de la CCA para ocluir el flujo sanguíneo (ligadura permanente). La oclusión del flujo se verifica una caída de aproximadamente 50% de los valores de perfusión cortical. </li><li> A continuación, un clip de recipiente se coloca justo antes de la bifurcación de la CCA para evitar el flujo retrógrado en el momento de la arteriotomía. </li><li> Una arteriotomía se realiza entre la sutura proximal liga y el clip de buque en la CCA, con micro-tijeras (el más cercano a la ligadura). </li><li> El calor embotado de silicona recubierto de sutura de nylon 7-0 se introduce a través de la arteriotomía y se avanzó hasta que llega el clip de buque. Los dos restantes suturas manuales sueltos apretar ligeramente alrededor de la CCA entre la arteriotomía y el clip de buques para evitar la posterior fuga de flujo a través de la CCA, con cuidado de no traumatizar la pared arterial, y luego el clip de embarcación es retirada. </li></ol> 3 Longa el método <ol class="lalpha" type="a"><li> La ECA ha sido identificado, diseccionado tanto como sea posible (cerca de su bifurcación en las arterias lingual y maxilar), cauterización (con el poder establecido en 1), y se divide en micro-tijeras. </li><li> Dos puntos de sutura collar suelto (7-0 de seda) se preparan en todo el proximal ICA justo por encima de la bifurcación de la CCA. </li><li> La CCA se encuentra temporalmente cerrado con un clip de buque. La oclusión del flujo se verifica una caída de aproximadamente 50% de los valores de perfusión cortical. </li><li> Luego, el ICA se encuentra temporalmente cerrado con un clip de buque por encima de las dos suturas collar suelta para evitar el flujo retrógrado en el momento de la arteriotomía. </li><li> Una arteriotomía se realiza mediante micro-tijeras en el cierre de la CEPA se refleja en el muñón. </li><li> El calor embotado de silicona recubierto de sutura de nylon 7-0 se introduce a través de la arteriotomía de la CEPA y avanzó hasta llegar al clip de buques aplicado en ICA. Los dos puntos de sutura flojos cuello proximal de ICA se han de apretar ligeramente alrededor de la porción proximal de la ACI para evitar el flujo de sangre a través de reflujo ICA, con la atención suficiente como para no traumatizar a la pared arterial, y luego el clip de embarcación es retirada. </li></ol> El resto del procedimiento es en gran medida convergentes: <ol><li> La sutura de la oclusión se avanza a través de la arteria carótida interna (ACI) hacia la base del cráneo hasta una resistencia leve se siente. Una caída simultánea en el valor del flujo sanguíneo cerebral como un porcentaje (= 80%) respecto al valor basal es confirmado por flujometría láser-doppler. Los dos puntos de sutura cuello se tensan alrededor del filamento insertado. </li><li> Para experimentos de isquemia cerebral transitoria, oclusión de la sutura se retira con cuidado después de 45 minutos. Este punto en el tiempo puede ser alterado por diversos fines experimentales. </li><li> Después de retirar el filamento de sutura, el sitio arteriotomía se cierra para evitar el sangrado posquirúrgico. En el método de Koizumi, se trata de puntos de sutura se apriete el collar alrededor de la CCA. En la técnica de Longa, el sitio arteriotomía en la base de la CEPA se cauteriza, a continuación, los puntos de sutura en el cuello proximal ICA se aflojan y se retira para restaurar el flujo de la carótida. </li><li> Para cerrar la incisión, la glándula submaxilar y SMC se establecen en el campo operatorio. Los bordes de la herida luego se aproxima con adhesivo tisular en el cuello uterino y las áreas del cuero cabelludo. Por otra parte, un producto básico reabsorbibles o metal podría ser utilizado para cerrar la herida, especialmente cuando supervivencia a largo plazo de los animales que se pretende. </li><li> Después del cierre de la incisión, el animal recibe un ml de solución salina caliente por vía subcutánea como la reposición de volumen. Una dosis de los analgésicos adecuados (es decir, la buprenorfina en 0,05-0,1 mg / kg) se debe utilizar para minimizar el dolor y el malestar del animal durante el período de recuperación. El ánimal se retira de la sala de cirugía y se coloca en una jaula de recuperación de la zona caliente / para prevenir la hipotermia, con acceso gratuito, fácil de alimentos blandos y el agua. </li></ol> 4. Post-Op evaluación neurológica Después de que el animal recobre el conocimiento total, déficits neurológicos pueden ser evaluados por una escala simple (escala de cinco puntos) de la siguiente manera 3: <ol start="0"><li> sin déficit observable </li><li> fracaso en la prolongación pata contralateral (leve déficit neurológico focal) </li><li> dando vueltas en una dirección contralateral al infarto (déficit neurológico focal moderado) </li><li> cayendo en una dirección contralateral al infarto (grave déficit neurológico focal) </li><li> disminución del nivel de conciencia sin movimiento espontáneo </li></ol> 5. La coloración y medición cuantitativa del volumen de infarto cerebral <ol><li> Después de 24 horas de reperfusión MCA, el ratón superviviente se pesa, profundamente anestesiados con un 4% isoflorane y sacrificados de acuerdo con el protocolo aprobado. </li><li> El cerebro se retira cuidadosamente y se colocan en una máquina de cortar el cerebro del ratón de la matriz, y el cerebro entero está coronal seccionadas a intervalos de 2 mm. </li><li> Las secciones se encuentran inmersos en un 2% TTC en tampón fosfato salino (PBS) a 37 ° C durante 20 minutos. Después de la tinción TTC, área infartada se muestra como un blanco (sin teñir) los tejidos adyacentes a la de ladrillo rojo (viable) tejidos (Figura 1). </li><li> Las secciones seriadas se fotografían con una cámara digital y el área de infarto se mide con el programa J imagen. </li><li> El área de infarto (blanco, sin manchas), la zona del hemisferio ipsilateral (blanco y rojo ladrillo, de colores), y la zona del hemisferio contralateral (ladrillo rojo teñido), se miden para cada sección. El volumen se calcula sumando las áreas de representación en todas las secciones y se multiplica por el grosor del corte. Después de corregir el edema, el volumen de infarto se calcula de la siguiente manera 9: Volumen corregido del infarto (CIV),% = [volumen del hemisferio contralateral - (volumen del hemisferio ipsilateral - el volumen del infarto)] volumen del hemisferio / contralateral x 100 </li></ol> 6. Resultados representante Después de la oclusión y reperfusión de la MCA a través de la CCA a la izquierda para establecer la isquemia cerebral transitoria, los animales son sacrificados y sus cerebros seccionados coronalmente están manchadas de TTC para evaluar el volumen de infarto (Figura 1). <img src="files/ftp_upload/2879/2879fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. TTC-manchado secciones de serie del cerebro coronal (2 mm) de los ratones sometidos a la oclusión MCA. </ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+on+stroke+prevention%2C+diagnosis%2C+and+therapy.+Report+of+the+WHO+Task+Force+on+Stroke+and+other+Cerebrovascular+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).</li>
<li>Lloyd-Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2009+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association+Statistics+Committee+and+Stroke+Statistics+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.</a> Circulation. 119, e21-e181 (2009).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).</li>
<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema.+I.+A+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monofilament+intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse.</a> Neurol Res. 19, 641-648 (1997).</li>
<li>Fujii, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-related+differences+in+susceptibility+to+transient+forebrain+ischemia+in+SV-129+and+C57black%2F6+mice.+%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. </a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).</li>
<li>Bederson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+2%2C3%2C5-triphenyltetrazolium+chloride+as+a+stain+for+detection+and+quantification+of+experimental+cerebral+infarction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).</li>
<li>Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+4-phenylbutyrate+protects+against+cerebral+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury.</a> Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).</li>
<li>Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+differences+in+susceptibility+to+cerebral+ischemia+are+related+to+cerebral+vascular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).</li>
<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ideal+suture+diameter+is+critical+for+consistent+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).</li>
<li>Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-regulated+model+of+focal+ischemia+in+the+mouse%3A+a+study+with+histopathological+and+behavioral+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).</li>
<li>Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+induced+prolonged+protection+against+cerebral+ischemia+in+mice%3A+a+redox+sensitive+mechanism%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism?</a> Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

El modelo MCAO es un modelo establecido que se replica a la isquemia cerebral en especies murinas. Este modelo fue utilizado por primera vez en ratas y posteriormente adaptado a los ratones. Evitar craniectomía para eliminar la influencia de la manipulación quirúrgica de permeabilidad de la barrera sangre-cerebro y la presión intracraneal es una ventaja de esta técnica. Sin embargo, muchas variables, tales como la cepa diferencias relacionadas con la 10, el tamaño de la sutura de punta 11, la durac...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Tipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Los ratones machos C57BL / 6 </td><td> Animal </td><td> Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, EE.UU. </td><td></td><td> 20-26 grs </td></tr><tr><td> Disección microscopio </td><td> Microscopio </td><td> Leica estereomicroscopio MZ6 </td><td></td><td> 6.3:1 captura </td></tr><tr><td> Iluminación de fibra óptica </td><td> Iluminador </td><td> TechniQuip Corp., Livermore, California, EE.UU. </td><td></td><td> FO1-150 </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Anestesia </td><td> Baxter Farmacia, Deerfield, IL </td><td> 1001936060 </td><td></td></tr><tr><td> SuperCut tijera Iris, recta </td><td> Herramienta quirúrgica </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. </td><td> 14218 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas micro-tijera, rectas </td><td> Herramienta quirúrgica </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. </td><td> 14003 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont pinzas de punta fina </td><td> Herramienta quirúrgica </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. </td><td> 503290 </td><td></td></tr><tr><td> Buque clip de </td><td> Herramienta quirúrgica </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. </td><td> 14120 </td><td></td></tr><tr><td> Desecador Alta Frecuencia 900 </td><td> Herramienta quirúrgica </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. </td><td> 500397 </td><td></td></tr><tr><td> 7-0 de nylon quirúrgico de sutura monofilamento </td><td> Sutura </td><td> Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EE.UU. </td><td> 1647G </td><td> Sutura para la oclusión </td></tr><tr><td> 7-0 suturas de seda quirúrgica </td><td> Sutura </td><td> Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EE.UU. </td><td> 7733G </td><td> De sutura para ligadura </td></tr><tr><td> De silicona RTV adhesivo </td><td> El caucho de silicona </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. </td><td> 1571 </td><td></td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> Adhesivo tisular </td><td> 3M Company, St. Paul, MN, EE.UU. </td><td> 70200746587 </td><td></td></tr><tr><td> Puralube ungüento Vet </td><td> Ungüento para los ojos </td><td> Pharmaderm, Melville, NY, EE.UU. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La buprenorfina hydrochlorode </td><td> Analgésicos </td><td> Hospira Inc., Lake Forest, Illinois, EE.UU. </td><td> NDC 0409-2012-32 </td><td></td></tr><tr><td> Unidad de cauterio térmico </td><td></td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. </td><td> 501292 </td><td></td></tr><tr><td> Periflux System 5000 </td><td> TCD flujometría </td><td> Perimed, Estocolmo, Suecia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BAT-12 </td><td> Termómetro rectal </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. </td><td> BAT-12R </td><td></td></tr><tr><td> T / bomba, TP600 </td><td> Manta térmica </td><td> Gaymar, NY, EE.UU. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2,3,5-trifenil tetrazolio cloruro </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, EE.UU. </td><td> T8877 </td><td></td></tr><tr><td> Los ratones del cerebro matriz cortadora </td><td> Máquina de cortar el cerebro </td><td> Zivic-Miller laboratorio., Inc., Allison Park, PA, EE.UU. </td><td> BSMAS001-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

intraluminal la arteria cerebral media de oclusión (mcao) modelo para el ictus isquémico con orientación flujometría láser doppler en ratones

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

El accidente cerebrovascular es la tercera causa de muerte y la principal causa de discapacidad en el mundo, con un costo estimado de cerca de $ 70 mil millones en los Estados Unidos en 2009 1,2. El intraluminal de arteria cerebral media oclusión (MCAO) modelo fue desarrollado por Koizumi 4 en 1986 para simular este impactante patología humana en la rata. Una modificación del método de MCAO fue presentado más tarde por Longa 3. Ambas técnicas han sido ampliamente utilizados para identificar los mecanismos moleculares de las lesiones cerebrales derivadas de accidentes cerebrovasculares isquémicos y posibles modalidades terapéuticas 5. Este método relativamente no invasiva en ratas se ha extendido el uso de ratones para tomar ventaja de transgénicos y knock-out cepas de 6,7. El modelo de isquemia focal cerebral, una sutura intraluminal se avanza a través de la arteria carótida interna para ocluir la base del MCA. Retracción de la sutura después de un período de tiempo especificado imita reperfusión espontánea, pero la sutura también pueden ser retenidos de forma permanente. Este vídeo se demuestra los dos enfoques principales para llevar a cabo el procedimiento intraluminal MCAO en ratones en forma escalonada, además de proporcionar ideas para posibles inconvenientes y dificultades. El tejido cerebral isquémico posteriormente se tiñeron por el cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) para evaluar la extensión del infarto cerebral 8.

El intraluminal de arteria cerebral media oclusión (MCAO) es el modelo más empleado entre los modelos experimentales de ictus isquémico. Aquí vamos a demostrar todo el modelo en detalle con la guía de la flujometría láser Doppler, y sus resultados representativos.

Intraluminal la arteria cerebral media de oclusión (MCAO) Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en ratones

El accidente cerebrovascular es la tercera causa principal de muerte y la principal causa de discapacidad en el mundo, con un costo estimado de cerca de 70.000 millones de dólares en los Estados Unidos...

En este artículo en video, presentamos un modelo de accidente cerebrovascular isquémico conocido como oclusión de la arteria cerebral media o MCAO. En el método original de oclusión de la arteria cerebral mediante coágulo, se introduce una sutura roma a través de la arteria carótida común para ocluir la arteria cerebral media. Este método provoca una oclusión permanente de la arteria carótida común.Una modificación metodológica por Longa permite el acceso a la arteria cerebral media a través de la arteria carótida externa. Este método preserva la función de la carótida común y su circulación distal entre los modelos experimentales de accidente cerebrovascular isquémico. El modelo de oclusión de la arteria cerebral media mediante filamento intraluminal en ratas y ratones es uno de los modelos más utilizados; desde su primera descripción en ratas, se han publicado varias modificaciones del modelo inicial, siendo actualmente la modificación de Longa la variación más destacada.Este modelo es menos invasivo y fácil de realizar tanto la isquemia permanente como la transitoria de manera controlada. El modelo de oclusión de la arteria cerebral media mediante filamento intraluminal consiste en insertar un monofilamento en la arteria carótida interna y avanzarlo hasta que bloquee el flujo sanguíneo hacia la arteria cerebral media. Este modelo proporciona infartos reproducibles en la zona territorial de la arteria cerebral media y permite la reperfusión tras la retracción del hilo.El tamaño del infarto parece verse afectado por muchos factores específicos en esta técnica, como el diámetro de la sutura, el recubrimiento de la sutura con silicona o poliol lisina, o la longitud de inserción del filamento mismo. En este video, mostraremos cómo realizar este modelo de manera escalonada, así como cómo evitar muchas de las trampas potenciales y desventajas relacionadas con el uso de este método. Se utilizará una sutura de nailon monofilamento 7.0 para la oclusión de la ACM.El extremo de la sutura de nailon debe embotarse mediante la proximidad cercana a una fuente de calor. El extremo embotado debe ser recto y liso, y tener aproximadamente de uno a dos milímetros de longitud. Después de embotar el extremo, la sutura debe cortarse a una longitud total de aproximadamente 11 a 13 milímetros.La punta roma de la sutura se sumerge en silicona hasta que tres o cuatro milímetros del extremo queden recubiertos y se deja secar. Todos los pasos en la preparación de la sutura deben realizarse en condiciones estériles. Después de pesar al ratón, se induce la anestesia con 4% de isoflurano en una cámara de inducción.El ratón se coloca en posición prona sobre una gasa que descansa sobre una manta térmica. Para mantener una temperatura corporal central de 37 grados, la anestesia se mantiene durante el procedimiento mediante una máscara facial. La cabeza afeitada se limpia con alcohol, Betadine y nuevamente con alcohol.Se realiza una incisión de un centímetro en la piel para exponer el cráneo un milímetro por detrás y cinco milímetros lateral al bgma. Se fija una microsonda flexible perpendicularmente a la superficie del hueso parietal derecho para monitorear el flujo sanguíneo en el territorio de la arteria cerebral media mediante imágenes de flujo por láser Doppler.Devuelva el animal a una posición supina y realice una incisión media en el cuello con tijeras entre el manubrio y la mandíbula. Divida cuidadosamente las glándulas submandibulares apareadas para exponer las estructuras subyacentes: el músculo digástrico, el músculo esternocleidomastoideo y la tráquea. Retracte estas estructuras formando un triángulo y continúe la disección para revelar la arteria carótida común, el nervio vago y la vena yugular interna. La arteria carótida común se bifurca en la arteria carótida externa y la arteria carótida interna.La arteria occipital también puede observarse originándose de la región de bifurcación. En el método de COE, la arteria carótida común proximal se separa y aísla cuidadosamente del nervio vago. Se preparan tres suturas sueltas en forma de collar alrededor de la arteria carótida común.Se debe prestar especial atención para que el nervio vago no quede atrapado dentro de la sutura. Se identifica y aísla la arteria carótida externa. Luego se cauteriza a dos o tres milímetros de la bifurcación.La sutura del collar más proximal en la arteria carótida común se aprieta para ocluir permanentemente el flujo sanguíneo. La oclusión del flujo se verifica mediante una disminución de aproximadamente el 50 % respecto a los valores basales de perfusión cortical. Los extremos libres de la sutura se recortan. Se coloca un clip vascular justo antes de la bifurcación de la carótida común para evitar el flujo sanguíneo retrógrado.A continuación, se realiza una arteriotomía entre la pinza vascular y la ligadura con tijeras microquirúrgicas. Esto permite introducir la sutura con extremo redondeado por calor en la arteria carótida común y avanzarla hasta que alcance la pinza vascular. Las dos suturas de collar restantes se aprietan suavemente para evitar fugas de retroflujo a través de la carótida común.Se retira el clip del vaso y se avanza suavemente la sutura roma hacia la arteria carótida interna. Hasta que se sienta una resistencia leve en la lectura del Doppler, se obtiene una disminución aproximada del 80 % respecto a la línea base. Las dos suturas del collar se ajustan firmemente para evitar sangrado retrógrado.Ahora se puede dejar al ratón en un estado de isquemia durante un período de tiempo adecuado. Para simular la reperfusión, se retiran las suturas oclusivas después de un intervalo apropiado. Un aumento en la lectura del Doppler indica que el flujo sanguíneo colateral se ha restablecido.La sutura se retira completamente y las dos suturas de collar se ajustan y recortan por completo con el método largo. Se puede utilizar una ruta diferente para ocluir la arteria cerebral media. Primero, debe identificarse la carótida externa, aislarse y cauterizarse lo más distal posible, dejando una longitud suficiente para la inserción de la sutura.Entonces se divide la arteria carótida externa y sus ramas se cauterizan y cortan también. El muñón de la arteria carótida externa se retrae. Cuidadosamente, se preparan dos suturas sueltas en collar alrededor de la arteria carótida interna proximal, justo por encima de la bifurcación carotídea común.La arteria carótida común se cierra temporalmente con una pinza vascular. Esto provoca una disminución de los valores de perfusión de aproximadamente 50 % justo distal a la bifurcación. La arteria carótida interna se pinza de manera similar con una pinza vascular y se realiza una arteriotomía cerca del extremo del muñón retraído de la carótida externa utilizando tijeras microquirúrgicas.La sutura calentada y embotada se introduce a través de la arteria carótida externa y se avanza hasta alcanzar el clip vascular en la carótida interna. Los dos hilos sueltos de las suturas alrededor de la carótida interna proximal se ajustan suavemente para evitar el flujo sanguíneo de reflujo, aunque sin apretar demasiado para no traumatizar la pared arterial. Luego se retira el clip de la arteria carótida interna, la arteria triptalina se separa de la arteria carótida interna.Al avanzar suavemente la sutura, se debe tener cuidado para evitar redirigirla hacia dentro. Se observa una segunda caída en la lectura del Doppler. Cuando la sutura roma alcanza la arteria cerebral media, los puntos de sujeción deben volver a apretarse para evitar sangrado retrógrado.Ahora se puede dejar al ratón en un estado de isquemia durante un período de tiempo adecuado. Retraer la sutura roma restablece el flujo sanguíneo, como indica un aumento en el monitor Doppler. Después de que se retiran completamente las suturas, el muñón de la arteria carótida externa se cauteriza.Para prevenir hemorragias posquirúrgicas, se debe tener cuidado de preservar la permeabilidad de la arteria carótida común. Luego, se aflojan y cortan los puntos de sutura en la arteria carótida interna proximal, y se retira el clip de la arteria carótida común para restablecer el flujo sanguíneo. Esto se indica con un segundo salto en la lectura del Doppler.Una vez que el ratón recupera la conciencia, se pueden evaluar los déficits neurológicos en diferentes momentos temporales según una escala de cinco puntos. Una puntuación de cero indica ausencia de déficit neurológico observable; una puntuación de uno, correspondiente a un accidente cerebrovascular leve, se evidencia por la incapacidad de extender una pata anterior contralateral al hemisferio afectado por el accidente cerebrovascular. Una puntuación de dos, correspondiente a un accidente cerebrovascular moderado, se evidencia por movimientos circulares en dirección opuesta a la del hemisferio afectado.Una puntuación de tres, que corresponde a un accidente cerebrovascular grave, se evidencia por la caída en una dirección opuesta al hemisferio afectado. Un ratón con una puntuación de cuatro no mostrará actividad motora espontánea. Para obtener una medición del volumen del accidente cerebrovascular, el cerebro se extrae del cráneo en un punto temporal adecuado.Después de la reperfusión, el cerebro se coloca en un cortador matricial y todo el cerebro se secciona en plano coronal. A intervalos de dos milímetros, se descartan el cerebelo y los bulbos olfatorios. Cada sección de dos milímetros se sumerge en una solución de TTC al 2 % durante 20 minutos a 37 grados en la oscuridad.Las imágenes digitales de las secciones cerebrales muestran que el tejido vivo teñido con TTC aparece de color rojo y el tejido infartado, de un blanco pálido en cada sección. El área del infarto etiquetada aquí como uno. El área de todo el hemisferio ipsilateral etiquetada aquí como dos, y el área del hemisferio contralateral etiquetada aquí como tres se miden todas con el programa Image J; tras haber medido las áreas de todas las secciones, los volúmenes pueden calcularse sumando los valores de las áreas y multiplicando por el grosor de la sección.Para hallar el volumen del infarto corregido por edema, se utiliza la siguiente fórmula. Este volumen se expresa como un porcentaje del volumen del hemisferio ipsilateral. El modelo MCO proporciona resultados reproducibles.Sin embargo, algunos factores procedimentales pueden interferir con la ejecución de la técnica. El recubrimiento de silicona en el extremo de la sutura es importante porque suaviza la superficie de la sutura y reduce el riesgo de abrasión endotelial o perforación vascular. Asimismo, el recubrimiento de la sutura puede modificarse para reflejar diferentes objetivos experimentales.El recubrimiento más allá de tres o cuatro milímetros desde la punta ocluirá la arteria proximal a la arteria cerebral media, aumentando el volumen total del accidente cerebrovascular. Las suturas de color deben aplicarse con cuidado para no restringir el nervio vago y deben atarse suavemente para que la pared AAL no resulte traumatizada. La temperatura corporal del ratón puede afectar la extensión de la infartación, por lo que debe mantenerse estable durante todo el procedimiento.Esperamos que ver este video le ayude a orientarse en el proceso quirúrgico y le proporcione un punto de partida sólido para sus propios experimentos. Gracias por verlo y mucha suerte con sus experimentos.

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Oclusión filamentosa de la arteria cerebral media es un modelo común para el estudio de ACV isquémico en los ratones.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones - Oclusión arteria cerebral media con el modelo de filamento

Se demuestra en el video de un método para producir una oclusión de arteria cerebral media en ratones adultos con un monofilamento intraluminal. También mostrará cómo evaluar la extensión del infarto cerebral por el cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) tinción.

Modelo de ratón de la oclusión arteria cerebral media

El medio de oclusión intraluminal modelo cerebral en ratones se presentan en la presente memoria. La extensión del infarto cerebral se evaluó mediante una puntuación neurológica y tinción con violeta de cresilo, una alternativa a la tinción con TTC, que ofrece la gran ventaja de prueba en paralelo marcadores de interés muchos.

Modelo de ratón de MCAO intraluminal: Evaluación del infarto cerebral mediante tinción con violeta de cresilo

Varios modelos animales de isquemia cerebral han sido desarrollados para simular la condición humana de accidente cerebrovascular. Este protocolo describe la endotelina-1 (ET-1) inducida por la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) modelo de accidente cerebrovascular isquémico en ratas. Además, las consideraciones importantes, ventajas y deficiencias de este modelo se discuten.

La endotelina-1 inducida por la arteria cerebral media oclusión Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en la rata

Varios modelos murinos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) son ampliamente utilizados en la investigación experimental cerebro. Aquí, nos demuestran el modelo de transcraneal permanente MCAO distal que produce infarto cortical consistente de un tamaño correspondiente a los daños impuesta por la mayoría de los accidentes cerebrovasculares isquémicos humanos.

Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal

Con el fin de entender la fisiopatología del accidente cerebrovascular, es importante utilizar modelos fiables. En este trabajo se va a describir uno de los modelos de accidente cerebrovascular de uso más frecuente en los ratones, llamado el medio modelo de oclusión de la arteria cerebral (MCAO) (también llamado el filamento de sutura intraluminal o modelo) con reperfusión.

Técnica quirúrgica para la oclusión de la arteria cerebral media y la reperfusión del movimiento inducidos en ratones

Aquí, describimos un modelo de ratón de isquemia retiniana por oclusión bilateral transitoria de la arteria carótida común bilateral utilizando suturas simples y una abrazadera. Este modelo puede ser útil para entender los mecanismos patológicos de la isquemia retiniana causados por anomalías cardiovasculares.

Un modelo murino de lesión retiniana isquémica inducida por la oclusión bilateral transfronteriza de la arteria carótida común

Diferentes modelos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAo) se utilizan en la investigación experimental del accidente cerebrovascular. Aquí, se describe un modelo experimental de accidente cerebrovascular de MCAo transitorio a través de la arteria carótida externa (ECA), que tiene como objetivo imitar el accidente cerebrovascular humano, en el que el trombo cerebrovascular se elimina debido a la lisis o terapia espontánea del coágulo.

Modelado del accidente cerebrovascular en ratones: oclusión transitoria de la arteria cerebral media a través de la arteria carótida externa

Este protocolo demuestra un modelo único de brazada de ratón con un infarto de tamaño medio y una excelente tasa de supervivencia. Este modelo permite a los investigadores preclínicos de accidentes cerebrovasculares extender la duración de la isquemia, utilizar ratones de edad avanzada y evaluar los resultados funcionales a largo plazo.

Un modelo de oclusión transcraneal modificado de la arteria cerebral media para estudiar los resultados del accidente cerebrovascular en ratones ancianos

Este protocolo describe el modelo de isquemia cerebral focal transitoria en ratones a través de la oclusión intraluminal de la arteria cerebral media. Además, se muestran ejemplos de evaluación de resultados mediante resonancia magnética y pruebas de comportamiento.

Modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media de accidente cerebrovascular

En este trabajo, presentamos un protocolo para establecer un modelo de oclusión distal de la arteria cerebral media (dMCAO) mediante electrocoagulación transcraneal en ratones C57BL/6J y evaluamos el comportamiento neurológico y las características histopatológicas posteriores.

Inducción de ictus isquémico agudo en ratones mediante la técnica de oclusión de la arteria media distal

Aprende el modelo MCAO intraluminal para estudiar ictus isquémico en ratones usando flujometría láser Doppler. Este método permite inducir isquemia y reperfusión de forma reproducible en investigación neurovascular.

Intraluminal la arteria cerebral media de oclusión (MCAO) Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en ratones (Video) | JoVE Journal

Intraluminal la arteria cerebral media de oclusión (MCAO) Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en ratones

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