Name: Solo Drosophila Omatidio disección e Imagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Aprende a diseccionar omatidios individuales de Drosophila para estudiar eventos intracelulares en modelos de neurodegeneración. Este método permite generar cultivos neuronales primarios para tratamientos farmacológicos y análisis de imagen avanzados.

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Damos las gracias a Bernard Charroux para los debates. Este trabajo fue financiado por la Escuela de Biomédica ley de Kirchhoff.

1. La disección de la retina Drosophila <ol><li> Llenar una y de un portaobjetos de vidrio de 3 Bueno con tampón fosfato salino (PBS 1X), y luego vuela por anestesiar a CO 2. Tanto hombres como mujeres pueden ser utilizados para este experimento. </li><li> Una vez que las moscas son anestesiados, recoger una mosca con unas pinzas y colocarlo en el plato pequeño de PBS. </li><li> Bajo un microscopio de disección, una pizca de la trompa con pinzas, y luego separar la cabeza del cuerpo si se rompe el cuello con un segundo conjunto de pinzas. </li><li> Sosteniendo la cabeza de mosca de la trompa, cortado por la mitad a lo largo de la línea media hacia la izquierda / derecha de la cabeza de mosca con micro tijeras para revelar el cerebro. </li><li> Use una pipeta de punta de corte para recoger a la retina, y la transferencia de un segundo pozo de la lámina de vidrio de 3 llenarse bien con medio Schneider. </li><li> En primer lugar, pelar lejos la mayor parte de la cutícula de cabeza y luego retire el cerebro con una pinza. Mantener la retina situado entre la lámina y la córnea. </li><li> A continuación, la transferencia de la retina en una gota (50 l) del medio de Schnieder frescas se colocan directamente de la lámina de vidrio. </li></ol> 2. La disección de la omatidios <ol><li> Dependiendo del propósito final de la disección (ya sea de imágenes inmediata o la cultura) y en la óptica del microscopio de fluorescencia (directa o inversa), este paso puede tener lugar en un portaobjetos o en una placa de 24 pocillos. Con el propósito final de esta disección, el omatidios se diseca directamente en el portaobjetos de vidrio. </li><li> Sujete bien el extremo más dorsal o ventral de la retina con una pinza. Utilizando micro tijeras, corte la retina en la mitad a lo largo de la línea media dorsal / ventral para exponer los omatidios en el centro del ojo. </li><li> Seguir para captar la retina de tal manera que la córnea está orientada hacia abajo y la lámina hacia arriba. Utilizando una aguja de tungsteno muy bien, separar el omatidios de la lámina y la córnea. </li><li> Solo omatidios y grupos de omatidios recogerá en el fondo del pozo o la diapositiva. Elimine todos los residuos más grandes que se haya quedado antes de proceder. </li></ol> 3. Tratamiento, las manchas y de imagen <ol><li> Para el análisis de la autofagia, diluir 1:1000 LysoTracker en la caída de Schneider (primero diluir 1:10 en Schneider y luego añadir 0,5 l de la caída en la diapositiva), mezclar y esperar 10 segundos. </li><li> Retire el exceso de líquido de la diapositiva, teniendo cuidado de dejar atrás el omatidios. Esto se hace mejor con una punta fina de gel de carga. </li><li> Añadir una gota de Vectashield para cubrir los omatidios, un cubreobjetos y sellar con nailpolish. </li></ol> 4. Los resultados representativos: La buena ejecución del protocolo deben dejar un número de omatidios individuales y de pequeños grupos de omatidios mantienen unidas por fragmentos de lámina, pero bien separados en el lado de la córnea. Estas se pueden visualizar como en este ejemplo para visualizar Atg8: GFP y LysoTracker, mostrando autofagosomas, lisosomas y autophagolysosomes (Fig. 3). El método puede ser utilizado para obtener imágenes en vivo, sin embargo, en este caso es de señalar que la autofluorescencia de la media de Schneider se hace difícil distinguir las señales de baja intensidad de fluorescencia. Un problema adicional es que los gránulos de pigmento que permanecer unidos a los fotorreceptores son intensamente fluorescentes, especialmente en el canal rojo. Un cuadro campo claro puede ser necesario para distinguirlos de los orgánulos genuino. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento de disección para obtener omatidios individuales o pequeños grupos de omatidios de la retina de la mosca. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Las posibles variaciones del protocolo simple de describir aquí que involucran a la genética y el envejecimiento marcha ascendente de la disección y la tinción o cultivo para un máximo de 24 horas y posterior administración de fármacos de la disección. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 escaneo confocal de autofagosomas y los lisosomas en una sola omatidio disecados de aw; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP:.: Atg8 / + volar, que expresa un mutante de poliglutamina Atrophin y de 12 días a 29 ° C. El panel de campo claro (derecha) muestra la estructura casi intacta de la omatidio y el marco indica la zona analizada. Los lisosomas marcas rojas, verdes los autofagosomas, lisosomas auto-, lo que resulta de la fusión de los dos orgánulos, aparecen de color amarillo. Las puntas de flecha indican dos eventos de fusión en curso entre los autofagosomas y los lisosomas.

<ol><li>Marsh, J. L., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+the+study+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila in the study of neurodegenerative disease.</a> Neuron. 52, 169-178 (2006).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Nisoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+by+polyglutamine+Atrophin+is+not+rescued+by+induction+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy.</a> Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).</li>
<li>Charroux, B., Fanto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+line+between+waste+disposal+and+recycling%3A+DRPLA+fly+models+illustrate+the+importance+of+completing+the+autophagy+cycle+for+rescuing+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration.</a> Autophagy. 6, 667-669 (2010).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).</li>
<li>Napoletano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+Atrophin+provokes+neurodegeneration+in+Drosophila+by+repressing+fat%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat.</a> The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).</li>
<li>Ravikumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mTOR+induces+autophagy+and+reduces+toxicity+of+polyglutamine+expansions+in+fly+and+mouse+models+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease.</a> Nature. 36, 585-595 (2004).</li>
<li>Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+aging+and+oxidative+stress+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La disección omatidio único que aquí se presenta permite la recolección de información de celda más profunda sobre los procesos biológicos como la neurodegeneración, cuando el modelo en el ojo de Drosophila. Las neuronas fotorreceptoras son más accesibles que otras neuronas y el citoplasma es muy grande, y por lo tanto adecuado para estudiar la dinámica de la vesícula, en las células del mismo utilizado eficientemente en muchos modelos para cuantificar la neurodegeneración en vivo. El aspecto crítico d...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Dispensador de CO2 portátil </td><td> Flystuff </td><td> 59-150 </td><td> Recambios disponibles </td></tr><tr><td> Pinzas DUMONT n º 5 </td><td> AGAR Científico </td><td> T5034 </td><td></td></tr><tr><td> 3-Bueno portaobjetos de vidrio </td><td> EMS </td><td> 71561-01 </td><td></td></tr><tr><td> Micro tijeras </td><td> VWR </td><td> HAMMHSB516-09 </td><td></td></tr><tr><td> Medio de Schneider </td><td> VWR </td><td> 733-1663 </td><td></td></tr><tr><td> LysoTracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost Diapositivas </td><td> VWR </td><td> 631-0108 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield con DAPI </td><td> Vector de Laboratorios </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> VWR </td><td> 631-1336 </td><td></td></tr></tbody></table>

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Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster ha hecho valiosas contribuciones a la investigación en neurociencias y ha sido utilizado ampliamente como un modelo para las enfermedades neurodegenerativas por su poderosa genética 1. El ojo de la mosca, en particular, ha sido el órgano de elección para la investigación neurodegeneración, siendo la parte más accesible y la vida puede prescindir de la Drosophila sistema nervioso. Sin embargo, la principal advertencia de los ojos intactos, es la dificultad, debido a la intensa autofluorescencia de los pigmentos, en los eventos de formación de imágenes intracelulares, como la dinámica de la autofagia 2, que son fundamentales para la comprensión de la neurodegeneración. Recientemente, hemos utilizado la disección y la cultura de un solo omatidios 3 que ha sido esencial para nuestra comprensión de las disfunciones autofagia en un modelo de vuelo de Dentatorubro-Pallidoluysian atrofia (DRPLA) 3, 4. Ahora el informe una descripción completa de esta técnica (Fig. 1), una adaptación de los estudios electrofisiológicos 5, que es probable que se expanda enormemente la posibilidad de volar por los modelos de neurodegeneración. Este método puede ser adaptado a la imagen en vivo eventos subcelulares y para supervisar la administración de fármacos eficaces en las células fotorreceptoras (Fig. 2). Si se utiliza en combinación con las técnicas del mosaico de 6-8, las respuestas de las células genéticamente diferentes se analizaron en paralelo (Fig. 2).

El factor limitante en el uso de los adultos<em&gt; Drosophila</emLos ojos&gt; para estudiar la neurodegeneración y la biología celular es la imagen difícil de procesos intracelulares. Se describe la disección de omatidios solo para generar una bona-fide cultivo primario de células neuronales, que pueden ser sometidos a un tratamiento de drogas y de imagen avanzada.

Solo Drosophila Omatidio disección e Imagen

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster ha realizado contribuciones invaluables a la investigación en neurociencia y se ha utilizado ampliamente como modelo para enfermedades neurodegenerativas...

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar e imaginar un drosophila o matia individual para estudiar eventos intracelulares en modelos de neurodegeneración. Esto se logra primero separando la cabeza de la mosca del resto del cuerpo y abriéndola mediante un corte.A continuación, se extraen el cerebro y otros tejidos del interior de la cabeza. Luego se elimina la cutícula y cada retina se corta por la mitad. El paso final del procedimiento consiste en extraer la O con una aguja de tungsteno y depositarlas sobre un portaobjetos.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran orgánulos autofágicos citoplasmáticos mediante microscopía confocal de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica es que permite un análisis biológico celular de alta resolución en modelos de Drosophila para la neurodegeneración, lo cual hasta ahora solo podía ofrecer conocimientos genéticos en este campo, demostrando que el procedimiento será variable. Un estudiante de posgrado de mi laboratorio, con la ayuda de Daniel Mackay, técnico de histología y microscopía en el centro.Para comenzar, llene un pocillo de una placa de vidrio de tres pocillos con solución salina tamponada con fosfato, luego anestesie las moscas con dióxido de carbono. Una vez que las moscas estén anestesiadas, tome una mosca individual usando pinzas y colóquela en el pequeño recipiente con PBS. Bajo un microscopio estereoscópico, presione el probóscide con las pinzas y luego separe la cabeza del cuerpo cortando el cuello.Usando un segundo par de pinzas que sujeten la cabeza de la mosca por el probóscide, corte la cabeza por la mitad a lo largo de la línea media rostral lateral con tijeras microquirúrgicas. Para exponer el cerebro, utilice la punta de una pipeta cortada para recoger la cabeza junto con la retina y transfiérala a otro pozo lleno con medio Schneider. Retire con pinzas la mayor parte de la cutícula de la cabeza y luego extraiga el cerebro.Mantenga la retina intercalada entre la lámina y la córnea. A continuación, transfiera la retina a una gota de 50 microlitros de medio Schneider fresco. Colocada directamente sobre un portaobjetos de vidrio, sujete con pinzas, utilizando tijeras microquirúrgicas, cualquiera de los extremos más dorsales o ventrales de la retina.Corte la retina por la mitad a lo largo de la línea media dorsal-ventral para exponer el AMIA en el centro del ojo. Continúe sosteniendo la retina de manera que la córnea quede mirando hacia abajo y la lámina hacia arriba. Utilizando una aguja fina de tungsteno, separe primero el oia de la lámina y luego de la córnea.Un solo OIA y grupos de OIA se acumularán en el fondo del pocillo o portaobjetos. Retire cualquier resto mayor que se haya acumulado antes de continuar. Para analizar la autofagia, diluya el marcador Lito a uno en 1000 en una gota de medio Schneider, mezcle y espere 10 segundos.Retire el exceso de líquido del portaobjetos. Tenga cuidado de dejar atrás el AMIA. Añada una gota de vector shield para cubrir el AMIA.Coloque una cubierta, deslice y selle con esmalte de uñas utilizando microscopía confocal; tanto los fagosomas marcados con g fp a TG ocho como los lisosomas marcados con Lyo Tracker pueden visualizarse en un tédium diseccionado individualmente a partir de una mosca que expresa una forma mutante de atropina. El panel de campo brillante en la esquina superior derecha muestra la estructura casi intacta del tédium, y el marco indica el área escaneada. Aquí, el color rojo marca los lisosomas y el verde marca el autofagosoma.Los autofagosomas, que resultan de la fusión de los dos orgánulos, aparecen de color amarillo. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el cultivo de material y la administración de fármacos para responder diferentes preguntas, como los compuestos efectivos sobre las señales de autofagia en células neuronales de distintos orígenes genéticos.Combinar las ventajas de la genética de drosophila con algunos análisis biológicos celulares avanzados posibles en cultivo celular.

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El método de imagen vertical descrito en este protocolo permite la visualización detallada de los polos de un huevo de Drosophila melanogaster en desarrollo.  Esta vista final proporciona una nueva perspectiva sobre la disposición y morfología de múltiples tipos de células en el epitelio folicular.

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El ovario del Drosophila es un sistema modelo excelente para estudiar el desarrollo del nicho de células madre. Aunque se han publicado métodos para disecar larvarios y adultos de los ovarios, disecciones de ovario pupa requieren técnicas diferentes que no han sido publicadas en detalle. Aquí describiremos un protocolo de disección, tinción y montaje pupas ovarios.

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Aquí, presentamos un flujo de trabajo rápido y de bajo costo para obtener imágenes de alta resolución de ojos de Drosophila adultas para cuantificar los patrones y los defectos de crecimiento. Describimos nuestro protocolo para la preparación de muestras mediante montaje en punto, adquisición de imágenes de alta resolución y análisis de imágenes.

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