Solo Drosophila Omatidio disección e Imagen

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar e imaginar un drosophila o matia individual para estudiar eventos intracelulares en modelos de neurodegeneración. Esto se logra primero separando la cabeza de la mosca del resto del cuerpo y abriéndola mediante un corte.

A continuación, se extraen el cerebro y otros tejidos del interior de la cabeza. Luego se elimina la cutícula y cada retina se corta por la mitad. El paso final del procedimiento consiste en extraer la O con una aguja de tungsteno y depositarlas sobre un portaobjetos.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran orgánulos autofágicos citoplasmáticos mediante microscopía confocal de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica es que permite un análisis biológico celular de alta resolución en modelos de Drosophila para la neurodegeneración, lo cual hasta ahora solo podía ofrecer conocimientos genéticos en este campo, demostrando que el procedimiento será variable. Un estudiante de posgrado de mi laboratorio, con la ayuda de Daniel Mackay, técnico de histología y microscopía en el centro.

Para comenzar, llene un pocillo de una placa de vidrio de tres pocillos con solución salina tamponada con fosfato, luego anestesie las moscas con dióxido de carbono. Una vez que las moscas estén anestesiadas, tome una mosca individual usando pinzas y colóquela en el pequeño recipiente con PBS. Bajo un microscopio estereoscópico, presione el probóscide con las pinzas y luego separe la cabeza del cuerpo cortando el cuello.

Usando un segundo par de pinzas que sujeten la cabeza de la mosca por el probóscide, corte la cabeza por la mitad a lo largo de la línea media rostral lateral con tijeras microquirúrgicas. Para exponer el cerebro, utilice la punta de una pipeta cortada para recoger la cabeza junto con la retina y transfiérala a otro pozo lleno con medio Schneider. Retire con pinzas la mayor parte de la cutícula de la cabeza y luego extraiga el cerebro.

Mantenga la retina intercalada entre la lámina y la córnea. A continuación, transfiera la retina a una gota de 50 microlitros de medio Schneider fresco. Colocada directamente sobre un portaobjetos de vidrio, sujete con pinzas, utilizando tijeras microquirúrgicas, cualquiera de los extremos más dorsales o ventrales de la retina.

Corte la retina por la mitad a lo largo de la línea media dorsal-ventral para exponer el AMIA en el centro del ojo. Continúe sosteniendo la retina de manera que la córnea quede mirando hacia abajo y la lámina hacia arriba. Utilizando una aguja fina de tungsteno, separe primero el oia de la lámina y luego de la córnea.

Un solo OIA y grupos de OIA se acumularán en el fondo del pocillo o portaobjetos. Retire cualquier resto mayor que se haya acumulado antes de continuar. Para analizar la autofagia, diluya el marcador Lito a uno en 1000 en una gota de medio Schneider, mezcle y espere 10 segundos.

Retire el exceso de líquido del portaobjetos. Tenga cuidado de dejar atrás el AMIA. Añada una gota de vector shield para cubrir el AMIA.

Coloque una cubierta, deslice y selle con esmalte de uñas utilizando microscopía confocal; tanto los fagosomas marcados con g fp a TG ocho como los lisosomas marcados con Lyo Tracker pueden visualizarse en un tédium diseccionado individualmente a partir de una mosca que expresa una forma mutante de atropina. El panel de campo brillante en la esquina superior derecha muestra la estructura casi intacta del tédium, y el marco indica el área escaneada. Aquí, el color rojo marca los lisosomas y el verde marca el autofagosoma.

Los autofagosomas, que resultan de la fusión de los dos orgánulos, aparecen de color amarillo. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el cultivo de material y la administración de fármacos para responder diferentes preguntas, como los compuestos efectivos sobre las señales de autofagia en células neuronales de distintos orígenes genéticos.

Combinar las ventajas de la genética de drosophila con algunos análisis biológicos celulares avanzados posibles en cultivo celular.