Un In Vitro Sistema para el Estudio de latencia del tumor y el salto hacia el crecimiento metastásico

El objetivo general del siguiente experimento consiste en observar en tiempo real y de manera de alto rendimiento el efecto de agentes potenciales sobre la latencia de células tumorales y/o la reaparición desde la latencia tumoral, utilizando el siguiente ensayo in vitro para modelar la latencia tumoral o el cambio hacia un crecimiento metastásico. Esto se logra primero cultivando células tumorales latentes y/o metastásicas en un sistema tridimensional de extracto de membrana basal, o sistema BME, adaptado a una plataforma de placas de 96 pocillos. Cuando se cultivan en el sistema 3D, las células metastásicas entran en una fase transitoria, latente o quiescente.

En contraste, las células tumorales que están inactivas in vivo entran en un estado de quiescencia prolongado. En el sistema de cultivo 3D, las células metastásicas pueden tratarse entonces con agentes candidatos para evitar su transición de la quiescencia a la proliferación. Mientras tanto, las células tumorales inactivas pueden tratarse con agentes candidatos que podrían inducir su transición de la quiescencia a la proliferación.

El comportamiento proliferativo de las células latentes y metastásicas como resultado del tratamiento se evaluará mediante la adición del kit de ensayo de proliferación celular Cell Titer 96 Aqueous One Solution en los puntos temporales deseados para su análisis en un lector de placas ELIZA. Los resultados obtenidos muestran el efecto del tratamiento sobre la proliferación celular de células tumorales latentes o metastásicas, basado en un ensayo de proliferación celular en el sistema 3D. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metástasis, como qué factores y mecanismos celulares mantienen a las células tumorales diseminadas en un estado de latencia y qué factores y mecanismos celulares inducen el cambio de la latencia tumoral a metástasis clínica Thaw.

El factor de crecimiento Qualtrics redujo el BME en un refrigerador a cuatro grados Celsius durante la noche anterior al día en que se realizará el ensayo de proliferación. Luego, el día del ensayo, seleccione un cultivo de células tumorales dormantes o metastásicas para el experimento. A continuación, coloque una placa de 96 pocillos sobre una bandeja de hielo dentro de una cabina o campana.

Luego, utilice un dispensador con una jeringa para recubrir cada pocillo de la placa con 50 microlitros del BME frío descongelado. Asegúrese de que no se formen burbujas en los pocillos. Coloque la placa de 96 pocillos recubierta con BME en un incubador humectado con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, coloque un frasco de tripsina a 37 grados Celsius para calentarlo mientras la placa recubierta con BME se incuba.

Aspire el medio de las células tumorales. Enjuague las placas de cultivo con 10 mililitros de PBS. Luego aspire el PBS y agregue dos mililitros de tripsina precalentada a las placas de cultivo.

Incube las placas durante cinco minutos. Añada cinco mililitros de DMEM con alta concentración de glucosa, suplementado con 10 %FCS y antibióticos, a un tubo cónico de 15 mililitros. Durante este tiempo.

Después de la incubación, transfiera las células desprendidas al tubo de 15 mililitros y cuente las células. Luego, centrifugue el número total de células a cultivar en una centrífuga de cultivo celular durante cinco minutos a 1500 G a temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente el sobrenadante.

Deje algo de medio, ya que en la mayoría de los casos el precipitado no es visible. Luego, golpee suavemente la parte inferior del tubo para asegurarse de obtener una suspensión simple de células. A continuación, re suspenda el precipitado con 100 microlitros de medio de ensayo por cada dos veces 10 a la tercera células.

Agite las células varias veces con una pipeta de cinco mililitros para asegurar que se mantenga una suspensión de células individuales. Siembre 100 microlitros de suspensión celular por pocillo en la placa recubierta con BME de 96 pocillos para la placa de control de desvalorización del fondo, y agregue adicionalmente 100 microlitros por pocillo de medio de ensayo solo a algunos pocillos de la placa recubierta con BME de 96 pocillos. A continuación, incube las placas, aspire el medio antiguo y alimente las células con medio de ensayo nuevo cada cuatro días.

Para evaluar la proliferación celular, agregue 20 microlitros de la solución acuosa uno del reactivo de tinción celular 96 procedente de un kit de ensayo de proliferación celular por pocillo a cada placa de 96 pocillos que se analizará en el punto temporal experimental deseado. Incube las placas durante dos horas. Luego, utilizando un lector de placas ELI A, registre la absorbancia de los pocillos experimentales y de fondo a 490 nanómetros en preparación para inmunofluorescencia.

Tinción de moléculas de señalización celular y células tumorales: descongele una BME en un refrigerador a cuatro grados Celsius durante la noche anterior al día en que se realizará la tinción. El día de la tinción, coloque un sistema de portaobjetos de ocho cámaras sobre una bandeja de hielo dentro de una cabina de flujo laminar o campana. A continuación, utilice una pipeta de 200 microlitros para recubrir cada pocillo del sistema de portaobjetos con 50 microlitros de BME fría con hielo.

Asegúrese de que el BME se distribuya uniformemente y de que no se formen burbujas en los pocillos. Incube las laminillas recubiertas durante 20 minutos. Seleccione una línea celular de tumor dormante o metastásico.

Recoger las células utilizando tripsina según se describió anteriormente. Luego, reunir el número total de células que se van a cultivar en un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, centrifugar las células, aspirar cuidadosamente el sobrenadante nuevamente, dejando algo de medio residual.

Para el precipitado, golpee suavemente la base del tubo cónico de 15 mililitros para obtener una suspensión de células individuales. Re_suspenda el precipitado con 400 microlitros de medio de ensayo por cada cinco veces 10 a la tercera células. Pase las células varias veces a través de una pipeta de cinco mililitros para asegurar que se mantenga la suspensión de células individuales; agregue 400 microlitros de solución celular por pocillo a cada una de las ocho cámaras recubiertas con BME.

Luego, incubar el sistema de portaobjetos de vidrio, aspirar el medio antiguo y alimentar las células con medio de ensayo nuevo cada cuatro días en los puntos temporales experimentales deseados. Aspirar la capa superior del medio y añadir 200 microlitros de fijador suplementado con tritón e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, aspirar el fijador suplementado con tritón y añadir 200 microlitros de fijador únicamente e incubar a temperatura ambiente durante 25 minutos adicionales.

Aspire nuevamente el fijador y ahora agregue 400 microlitros de PBS a cada pozo. Incube la placa durante 10 minutos adicionales a temperatura ambiente. Luego aspire el PBS y agregue 400 microlitros de PBS que contenga 0.05% entre 20 e incube durante otros 10 minutos.

También a temperatura ambiente. Ahora bloquee las células fijadas con 200 microlitros de solución de bloqueo. Incube entonces las células a temperatura ambiente durante una hora; tras la incubación, aspire la solución de bloqueo y agregue 200 microlitros del anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo a cada muestra.

Incubar bien las laminillas con el anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente. Aspirar el anticuerpo, luego lavar los pocillos tres veces agregando 400 microlitros de PBS durante 15 minutos y aspirando la solución después cada vez. Después de aspirar el PBS del último lavado, agregar 200 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado con rodamina roja.

Luego, cubra el sistema de portaobjetos de ocho cámaras con papel de aluminio e incube durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, lave los pocillos tres veces con PBS como antes; tras el tercer lavado, monte las muestras en portaobjetos con medio de montaje beta shield con dpi.

Finalmente, seque las laminillas durante 40 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Aquí se muestra un ejemplo de análisis de proliferación de las células tumorales latentes D 2.0 R y metastásicas D two A one en cultivo 3D. Las células D 2.0 R permanecen latentes durante todo el período experimental de cultivo de 14 días, mientras que las células altamente metastásicas D two A one permanecen latentes solo durante cuatro a seis días de cultivo, tras lo cual comienzan a proliferar durante la fase inicial de latencia.

Muchas células permanecen solitarias en el cultivo tridimensional, como se muestra aquí en una foto representativa de un cultivo del día cuatro, mientras que otras células no proliferativas forman esteroides multicelulares. La transición de las células D dos A uno desde un estado inactivo a un estado proliferativo en cultivo tridimensional se muestra aquí en esta foto de un cultivo del día 12. Está asociada con cambios dramáticos en la morfología celular en esta figura.

Un ejemplo de un agente que impide que las células D two A one pasen de un estado latente a un estado proliferativo se muestra en tratamientos de las células D two A one con un inhibidor específico contra la quinasa de la cadena ligera de miosina. Mantenga las células D two A one en un estado latente como se ilustra en esta figura. Un aumento significativo en la fosforilación de la cadena ligera de miosina en las células D two A one en rojo, seguido de la reorganización de los filamentos de F-actina que forman fibras de estrés de actina en verde, ocurre durante su transición de la latencia de los días uno a cuatro hacia la proliferación.

Día siete. Sin embargo, la inhibición de la actividad de la quinasa de la cadena ligera de miosina en células D dos A uno mediante SHRA o mediante el fármaco ML siete mantiene a las células D dos A uno en un estado de latencia y provoca la inhibición de la fosforilación de la cadena ligera de miosina, de la F actina y de la organización de los filamentos de estrés, como se observa aquí. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar el sistema modelo in vitro para estudiar la latencia tumoral y el cambio hacia el crecimiento metastásico.