Name: La medición bioquímica de la hipoxia neonatal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Aprende a medir marcadores bioquímicos de hipoxia-isquemia neonatal mediante HPLC y GC/MS en muestras de plasma infantil. Este método permite cuantificar hipoxantina, xantina, ácido úrico, alantoína y MDA para diagnóstico temprano.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo está financiado por los Institutos Nacionales de Salud NR011209 R01-03

<ol><li>Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapartum+hypoxia%3A+the+association+between+neurological+assessment+of+damage+and+abnormal+excretion+of+ATP+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites.</a> J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).</li>
<li>Shalak, L., Perlman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic-ischemic+brain+injury+in+the+term+infant-current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts.</a> Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).</li>
<li>Webster, W. S., Abela, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hypoxia+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">The effect of hypoxia in development.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).</li>
<li>Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+xanthine+dehydrogenase+to+oxidase+in+ischemic+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues.</a> J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).</li>
<li>Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+action+of+xanthine+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inorg+Biochem%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase.</a> J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).</li>
<li>Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+human+xanthine+oxidoreductase%3A+the+enzyme+is+grossly+deficient+in+molybdenum+and+substantially+deficient+in+iron-sulphur+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres.</a> Biochem J. 388, 501-508 (2005).</li>
<li>Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allantoin+in+human+plasma%2C+serum%2C+and+nasal-lining+fluids+as+a+biomarker+of+oxidative+stress%3A+avoiding+artifacts+and+establishing+real+in+vivo+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).</li>
<li>Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+and+allantoin+levels+in+Down+syndrome%3A+antioxidant+and+oxidative+stress+mechanisms%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?</a> Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).</li>
<li>Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+thiobarbituric+acid-reacting+substances+as+potential+biomarkers+of+intrauterine+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pediatr+Adolesc+Med%22%5BJournal%5D)">Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia.</a> Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).</li>
<li>Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+hydroperoxide+and+advanced+oxidation+protein+products+in+preterm+hypoxic+babies%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies.</a> Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).</li>
<li>Berne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+nucleotides+in+hypoxia%3A+possible+role+in+regulation+of+coronary+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow.</a> Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).</li>
<li>Harkness, R. A., Lund, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+hypoxanthine%2C+xanthine%2C+uridine+and+inosine%3A+high+concentrations+of+the+ATP+metabolite%2C+hypoxanthine%2C+after+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia.</a> J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).</li>
<li>Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+markers+of+neonatal+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Health%22%5BJournal%5D)">Biochemical markers of neonatal hypoxia.</a> Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).</li>
<li>Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+methyl+malondialdehyde+as+an+internal+standard+for+malondialdehyde+detection%3A+validation+by+isotope-dilution+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry.</a> Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).</li>
<li>Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methyl+malondialdehyde+as+internal+standard+for+malondialdehyde+detection+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis.</a> Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).</li>
<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-ethoxyacrolein+contamination+increases+malondialdehyde+inhibition+of+milk+xanthine+oxidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity.</a> Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).</li>
<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+and+total+malondialdehyde+assessment+in+biological+matrices+by+gas+chromatography-mass+spectrometry%3A+what+is+needed+for+an+accurate+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection.</a> Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).</li>
<li>Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+human+plasma+xanthine+oxidase+activity+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Appl%22%5BJournal%5D)">Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography.</a> J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22">Handbook of Biochemistry and Molecular Biology</a>. Fasman, G. , 3 ed, CRC Press. Boca Raton. (1988).</li>
<li>Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+15N+isotopic+enrichment+and+concentrations+of+allantoin+and+uric+acid+in+urine+by+gas+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los métodos descritos aquí permiten la evaluación de la isquemia hipoxia neonatal. Este protocolo combina las mediciones de los marcadores de la energía (ATP) la privación, el estrés oxidativo, daño oxidativo, y la actividad enzimática para obtener una visión global de la bioquímica de la presencia o el grado de isquemia hipóxica. A pesar de la utilidad de este método, existen limitaciones potenciales. En primer lugar, es de unos 1-2 ml de sangre para obtener plasma suficiente para ejecutar todos los ensayos. Esto no se...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> 6 ml EDTA K3 K3E tubo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2204061 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga 5702R </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05413319 </td><td> Con 13 y el adaptador 16MM </td></tr><tr><td> Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml </td><td> EE.UU. Científico </td><td> 1615-5599 </td><td></td></tr><tr><td> 2-aminopurine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3509 </td><td></td></tr><tr><td> Varian Cary 100 espectrofotómetro </td><td> Agilant Tecnologías </td><td> 0010071500 </td><td></td></tr><tr><td> Savant SpeedVac </td><td> Thermo Scientific </td><td> SC210A-115 </td><td></td></tr><tr><td> Micrones dispositivo centrífugo </td><td> Fisher Scientific </td><td> UFC501596 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Columna </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 58931 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Supelguard cartucho y titular </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 59629 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC </td><td> Aguas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GCMS Vial </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03376607 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Alantoína-5 -13 C, 1 -15 N </td><td> CDN Isótopos </td><td> M-2307 </td><td> Lote # L340P9 </td></tr><tr><td> MTBSTFA </td><td> Thermo Scientific </td><td> 48920 </td><td></td></tr><tr><td> Piridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270970 </td><td></td></tr><tr><td> 5973E GC / MSD </td><td> Agilent Technologies </td><td> G7021A </td><td> Parte # 5975E de GC / MS </td></tr><tr><td> 3-Ethoxymethacrolein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 232548 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de Sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Diclorometano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270997 </td><td></td></tr><tr><td> Benceno </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401765 </td><td></td></tr><tr><td> Diisopropiléter </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38270 </td><td></td></tr><tr><td> BHT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1378 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844 </td><td></td></tr><tr><td> Fenilhidrazina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P26252 </td><td></td></tr></tbody></table>

la medición bioquímica de la hipoxia neonatal

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

Isquemia hipoxia neonatal se caracteriza por una perfusión inadecuada de la sangre de un tejido o una sistemática falta de oxígeno. Esta condición se piensa que causa / exacerbar bien documentado trastornos neonatales entre ellas el deterioro neurológico 1-3. Disminución de la producción de trifosfato de adenosina se produce debido a la falta de fosforilación oxidativa. Para compensar este estado de energía privados moléculas que contienen enlaces de fosfato de alta energía son dos degradados. Esto lleva a mayores niveles de adenosina, que posteriormente se degrada a inosina, hipoxantina, xantina, y finalmente en ácido úrico. Los dos últimos pasos de este proceso de degradación se llevan a cabo por la xantina oxidorreductasa. Esta enzima existe en la forma de la xantina deshidrogenasa en condiciones normoxic pero se convierte en xantina oxidasa (XO) en circunstancias reperfusión hipoxia-4, 5. A diferencia de xantina deshidrogenasa, XO genera peróxido de hidrógeno como un subproducto de la degradación de purinas 4, 6. Este peróxido de hidrógeno en combinación con otras especies de oxígeno reactivo (ROS) se producen durante la hipoxia, oxida el ácido úrico a alantoína forma y reacciona con las membranas lipídicas para generar malondialdehído (MDA) 7-9. La mayoría de los mamíferos, los humanos exentos, poseen la enzima uricasa, que convierte el ácido úrico en alantoína. En los seres humanos, sin embargo, la alantoína sólo puede estar formado por ROS mediada por la oxidación del ácido úrico. Debido a esto, la alantoína se considera un marcador de estrés oxidativo en los seres humanos, pero no en los mamíferos que han uricasa. Se describen los métodos que emplean cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía de gases espectrometría de masas (GCMS) para medir los marcadores bioquímicos de isquemia hipoxia neonatal. La sangre humana se utiliza para la mayoría de las pruebas. Sangre de los animales también se puede utilizar sin dejar de reconocer el potencial de uricasa generado alantoína. Metabolitos de purinas estaban vinculados a la hipoxia en 1963 y la fiabilidad de hipoxantina, xantina y ácido úrico como indicadores bioquímicos de la hipoxia neonatal fue validada por varios investigadores 10-13. El método de HPLC utilizado para la cuantificación de los compuestos de purina es rápido, fiable y reproducible. El método de GC / MS utilizados para la cuantificación de alantoína, un marcador relativamente nuevo de estrés oxidativo, es una adaptación de Gruber et al 7. Este método evita ciertos artefactos y requiere un volumen bajo de la muestra. Los métodos utilizados para la síntesis de MMDA se describen en otros lugares 14, 15. GC / MS cuantificación base de MDA es una adaptación de Paroni et al. y Cighetti et al. 16, 17. Xantina oxidasa se ​​midió por HPLC mediante la cuantificación de la conversión de pterina a isoxanthopterin 18. Este planteamiento resultó ser lo suficientemente sensibles y reproducibles.

Se describe un método para medir los marcadores bioquímicos de la hipoxia-isquemia neonatal. El enfoque utiliza cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía de gases espectrometría de masas (GC / MS).

La medición bioquímica de la hipoxia neonatal

La hipoxia isquémica neonatal se caracteriza por una perfusión sanguínea inadecuada de un tejido o por una carencia sistémica de oxígeno. Se cree que esta condición...

El objetivo general del siguiente experimento es medir marcadores bioquímicos de la hipoxia isquémica neonatal. Esto se logra primero recolectando muestras de sangre de recién nacidos para aislar el plasma. A continuación, se filtra una parte del plasma, se combina con un estándar interno y se analizan las concentraciones de hipoxantina, xantina y ácido úrico mediante HPLC dos.Luego, se procesan y analizan por separado diferentes alícuotas del plasma. Para la concentración de alantoína y los niveles de MDA en el GCMS, el paso final del procedimiento consiste en combinar una porción de plasma con un sustrato para iniciar la reacción enzimática después de detener la reacción. La actividad de la xantina oxidasa puede determinarse mediante HPLC equipado con un detector de fluorescencia.Finalmente, se obtienen resultados que muestran cromatogramas de áreas de picos, que pueden convertirse en concentraciones molares de los marcadores bioquímicos deseados o actividad enzimática mediante curvas estándar. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento y diagnóstico de la hipoxia isquémica neonatal porque este método combina mediciones de marcadores de privación de energ

biochemical-measurement-of-neonatal-hypoxia

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Aquí proponemos métodos sencillos para inducir la hipoxia en cultivos de células y pruebas sencillas para evaluar el estado de hipoxia de los cultivos.

Inducción y prueba de hipoxia en el cultivo celular

Modelos de animales grandes tienen buenos valores de traslación en el examen de fisiología y farmacología de la asfixia neonatal. Utilizando los lechones recién nacidos, desarrollamos un protocolo experimental para simular asfixia neonatal que tiene ventajas de estudiar la hemodinámica sistémica y regional, el transporte de oxígeno a las vías bioquímicas y patológicas y correlaciones.

Un modelo porcino de la asfixia neonatal

Se combinaron dominio de la frecuencia del infrarrojo cercano las medidas de espectroscopia de oxigenación cerebral difusa con hemoglobina medidas de espectroscopia de correlación del índice de flujo sanguíneo cerebral para estimar un índice de metabolismo del oxígeno. Pusimos a prueba la utilidad de esta medida como una herramienta de detección de cabecera para evaluar la salud y el desarrollo del cerebro del recién nacido.

No invasiva de medición óptica del metabolismo cerebral en lactantes y Hemodinámica

La encefalopatía hipóxico-isquémica después de la asfixia perinatal se puede estudiar utilizando modelos animales. Demostramos los procedimientos necesarios para establecer un modelo de lechón de encefalopatía hipóxico-isquémica neonatal.

Un modelo del cochinillo de Neonatología encefalopatía hipóxico-isquémica

En este artículo se describe la metodología para la administración de cortos períodos de hipoxia intermitente para postnatales días 1-8 de ratón o rata crías. Este enfoque suscita efectivamente un nivel de tejido robusto "efecto priming" en células progenitoras neurales cultivadas que se cosechan en los 30 minutos de exposición a la hipoxia.

Entrega de<em&gt; En Vivo</em&gt; Aguda intermitente hipoxia neonatal en roedores a derivados de la Zona Prime subventricular progenitoras neurales Cultivos Celulares

El modelo de oveja fetal no anestesiado instrumentado crónicamente se utiliza para estudiar el desarrollo del feto humano en la salud y la enfermedad, ya que permite la colocación quirúrgica y el mantenimiento de los catéteres y electrodos, muestreo de sangre repetitivo, la inyección de sustancias, registro de la actividad bioeléctrica, y de imágenes in vivo. Se describen los procedimientos necesarios para establecer este modelo.

Instrumentación de Ovejas fetal Cerca plazo para multivariados Grabaciones no anestesiados crónicas

Las imágenes microcirculatorias (IM) se utilizan para monitorizar la perfusión periférica en neonatos críticos o prematuros. Este manuscrito y video demuestra el enfoque óptimo para obtener imágenes de alta calidad.

Transcutánea microcirculatoria Imaging en neonatos prematuros

Este protocolo está diseñado para ayudar a los médicos a medir la oxigenación de tejidos regionales en diferentes sitios del cuerpo en bebés y niños. Se puede utilizar en situaciones donde la oxigenación de los tejidos está potencialmente comprometida, particularmente durante el bypass cardiopulmonar, cuando se utilizan dispositivos de asistencia cardíaca no pulsantes, y en neonatos gravemente enfermos, bebés y niños.

Cómo administrar espectroscopia de infrarrojo cercano en neonatos, bebés y niños gravemente enfermos

Presentamos un protocolo para medir la saturación regional de oxígeno (rSO2) en pacientes en hemodiálisis (HD) mediante el uso de un monitor de espectroscopia de infrarrojo cercano. El valor de rSO2 es un índice de oxigenación tisular. Esta monitorización no invasiva y en tiempo real podría ser útil para confirmar los cambios en la oxigenación de los órganos durante la HD.

Medición de la oxigenación tisular mediante espectroscopia de infrarrojo cercano en pacientes sometidos a hemodiálisis

Aquí, presentamos un protocolo para inducir hipoxia en ratones neonatos administrándolos en ambientes controlados con diferentes concentraciones de oxígeno. Los modelos de ratón sometidos a variaciones de oxígeno al nacer han variado de forma duradera la expresión de miRNAs implicados en la inducción de cambios fenotípicos del comportamiento como el autismo.

La hipoxia altera los niveles de miRNAs implicados en la herencia no mendeliana del trastorno del espectro autista en ratones

Aprende a medir marcadores bioquímicos de hipoxia-isquemia neonatal mediante HPLC y GC/MS en muestras de plasma infantil. Este método permite cuantificar hipoxantina, xantina, ácido úrico, alantoína y MDA para diagnóstico temprano.

La medición bioquímica de la hipoxia neonatal

Explorar más videos