La medición bioquímica de la hipoxia neonatal

Se describe un método para medir los marcadores bioquímicos de la hipoxia-isquemia neonatal. El enfoque utiliza cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía de gases espectrometría de masas (GC / MS).

El objetivo general del siguiente experimento es medir los marcadores bioquímicos de la isquemia hipóxica neonatal. Esto se logra recolectando primero muestras de sangre de los bebés para aislar el plasma. A continuación, se filtra parte del plasma, se combina con un patrón interno y se analiza para determinar las concentraciones de hipoxantina, santina y ácido úrico en el HPLC dos.

A continuación, se procesan diferencialmente más alícuotas de plasma y se analizan por separado. Para la concentración de alantoína y los niveles de MDA en el GCMS, el paso final del procedimiento es combinar una porción de plasma con un sustrato para iniciar la reacción enzimática después de apagar la reacción. La actividad de la xanthe oxidasa se puede determinar en una HPLC equipada con un detector fluorescente.

En última instancia, se obtienen resultados que muestran cromatogramas de áreas de picos, que se pueden convertir en concentraciones molares de los marcadores bioquímicos deseados o actividad enzimática a través de curvas estándar. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de la isquemia hipoxia neonatal, ya que este método combina mediciones de marcadores de privación de energía, estrés oxidativo, daño oxidativo y actividad enzimática para generar una imagen bioquímica general de la presencia e incluso el grado de isquemia hipóxica antes del inicio de este procedimiento. Se recoge una muestra de sangre humana de un recién nacido inmediatamente después del nacimiento en un tubo de EDTA de seis mililitros en menos de cinco minutos.

Después de la recolección, centrifugue la muestra a cuatro grados centígrados y 1.500 veces G durante 10 minutos. Transfiera el plasma, que está presente en el supinado, a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugue durante 30 minutos. Retire el supinato teniendo cuidado de no contaminar las muestras con glóbulos rojos.

Eloqua agrupe las muestras en microtubos centricéntricos separados para el análisis de purinas lanina, MDA y xanthe oxidasa para cada medición PLC de purinas. Transfiera 200 microlitros de plasma a un dispositivo de filtro centrífugo. Centrífuga del plasma a cuatro grados Celsius y 14.000 veces G durante 1,5 horas.

Retire el filtrado y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga que contiene dos purinas aino. Asegúrese de registrar el volumen de filtrado agregado al tubo de microcentrífuga que contiene dos AP.To determinar con precisión la concentración. Agite el tubo durante 10 a 20 segundos.

Analice las muestras con una HPLC como se describe en el protocolo escrito utilizando tres inyecciones de 50 microlitros para cada muestra de los cromatogramas resultantes. Determine la concentración de purinas en la muestra. Cuantificar la hipoxantina, la xantina y el ácido úrico mediante la obtención de áreas de pico en sus correspondientes tiempos de retención y longitudes de onda.

A continuación, cuantifique el área del pico de dos ap. A partir de esta información, se pueden calcular las proporciones de área de hiperxantina y ácido úrico por dos PA. A continuación, convierta las proporciones a concentraciones micromolares utilizando curvas estándar Para realizar la medición de lanina, agregue 50 microlitros del patrón interno y 100 microlitros de aceto nitrilo a 50 microlitros de plasma.

Después de vorexizar la mezcla durante 10 a 20 segundos. Centrifugar durante 10 minutos después de la centrifugación. Retire el supinato y colóquelo en un vial de GCM S.

Seque el líquido bajo gas nitrógeno. Una vez que el líquido esté seco, agregue 25 microlitros de agentes de congelación M-T-B-S-T-F-A y 25 microlitros de piridina. Tape el vial e incube a 50 grados centígrados durante dos horas.

A continuación, transfiera la muestra a otro vial de GCMS con un inserto de 300 microlitros. Analice las muestras en el GCMS utilizando un muestreador automático. Realice la separación de compuestos utilizando helio como gas portador con un caudal de 1,5 mililitros por minuto.

Para comenzar el análisis de GCMS, introduzca los parámetros de la ejecución. Ajuste la temperatura inicial de la columna a 100 grados Celsius y mantenga esa temperatura durante dos minutos antes de aumentarla a 180 grados Celsius a una velocidad de 10 grados Celsius por minuto. Mantenga la temperatura durante cuatro minutos, luego auméntela a 260 grados Celsius a una velocidad de 20 grados Celsius por minuto.

Mantenga esta temperatura hasta el final de la carrera. Utilice el muestreador automático para inyectar un microlitro del producto DERIVATIZADO en modo dividido y realice la ejecución entre cada ejecución de muestra. Haga que el muestreador automático limpie la columna con dos inyecciones de piridina M-T-B-S-T-F-A una a una.

Para cuantificar un toin de LAN, seleccione el modo de monitoreo de iones y monitoree la relación de carga maestra de 3 98 ion para atlanto in y la relación de carga maestra de 400 para el atlanto in pesado. A continuación, convierta las proporciones de abundancia de iones de atlanto en atlanto pesado en concentraciones micromolares de atlanto utilizando una curva estándar preparada antes de la medición de MDA, prepare soluciones de hidroxil tolueno butilado y fenilhidracina de 50 milimolares como se describe en el protocolo escrito. AGREGUE M-M-D-A-B-H-T y citrato de sodio a la muestra de plasma de 100 microlitros.

Diluir la mezcla final a 480 microlitros añadiendo agua destilada desionizada. Derivatice la solución añadiendo 20 microlitros de 50 milimolares de fenol hidracina. Después de tapar el vial, incube la solución en un agitador orbital.

Después de la incubación, agregue un mililitro de vórtice de hexano a la mezcla durante un minuto y centrifugue a 3000 rotaciones por minuto durante 10 minutos. Después de la centrifugación, transfiera la capa orgánica a un tubo de microcentrífuga. Luego concentre la solución a 100 microlitros evaporándola bajo una corriente de gas nitrógeno y transfiérala a un archivo A-G-C-M-S con un inserto de 300 microlitros.

A continuación, analice las muestras en A-G-C-M-S utilizando el muestreador automático realizando la separación de compuestos y la cuantificación de MDA como se describe en el procedimiento escrito. Comience la detección de la actividad de la santhe oxidasa preparando dos viales para muestras de plasma. Uno para incubar con el sustrato durante cero minutos como control, y otro para incubar durante cuatro horas.

Como experimento, agregue tampón y sustrato a cada tubo. Preincubar las muestras a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Inicie la reacción enzimática agregando 60 microlitros de plasma a cada tubo.

Agregue inmediatamente 300 microlitros de ácido clorhídrico al 4% al tubo de incubación cero. Por el contrario, deje que la otra mezcla se incube durante cuatro horas a 37 grados centígrados antes de apagar la reacción después de la adición de ácido clórico. Agite el tubo de control de incubación cero y siga con la centrifugación.

Retire 500 microlitros del supinato y agréguelo a un tubo que contenga 20 microlitros de carbonato de potasio de cinco molares para neutralizar el vórtice de reacción, la muestra neutralizada y centrifugar por segunda vez. A continuación, añada 350 microlitros de la solución neutralizada a un tubo de microcentrífuga que contenga dos ap. Después de incubar la muestra de cuatro horas, apague la reacción agregando 300 microlitros de ácido clorhídrico al 4%.

Continúe el procesamiento de la muestra tal como se realizó para la muestra de control. Analice las muestras en una HPLC equipada con un detector de fluorescencia de barrido. Introduzca los parámetros utilizando las condiciones socráticas a un caudal de un mililitro por minuto.

Para obtener una separación e identificación de picos adecuadas, establezca la longitud de onda de excitación del detector de fluorescencia en 340 nanómetros y la longitud de onda de emisión de 410 nanómetros 3 50. Las inyecciones de microlitros se ejecutan en la HPLC para cada muestra después de la ejecución de la HPLC. Determine la relación entre ISO terin y dos AP obteniendo áreas de pico del espectro del detector de fluorescencia.

El primer pico del espectro, aproximadamente a los cinco minutos, corresponde a dos ap. El segundo y más grande pico será terran. Los eluidos de pico de ANTOIN ISO en último lugar, obtengan la diferencia en las relaciones de área de pico de dos AP de ISO ANTOIN entre los puntos de tiempo de incubación cero y cuatro horas.

Utilice este valor para calcular la actividad de la xantina oxidasa a partir de las curvas estándar. Un ejemplo de la cuantificación por HPLC de compuestos purificantes es los tiempos de retención específicos y las longitudes de onda de emisión de ácido úrico, hipoxantina y xantina que permiten la cuantificación simultánea de compuestos de purina. Cuando el ensayo se ejecuta correctamente, los compuestos tendrán una separación adecuada y la forma del pico será nítida y unimodal.

Si hay burbujas de aire en el sistema de HPLC, los tiempos de retención cambiarán y la presión de la HPLC fluctuará drásticamente. Si es necesario cambiar el cartucho de protección, la presión aumentará y los picos se ensancharán y se volverán o trimodales como se muestra en este ejemplo. Un ejemplo de la cuantificación GCMS de la lanina se muestra porque se conoce la lanina masiva derivatizada y la lanina pesada derivatizada.

El modo de iones de selección se puede utilizar para identificar estos compuestos en el espectrómetro de masas. Si el ensayo se realiza correctamente, se observarán dos picos al mismo tiempo de retención. Un pico corresponde a Alan Toin y el otro a Heavy Toin.

Los resultados para la cuantificación de MDA son similares a los de Alan Toin, con la excepción de que los dos picos se observan en diferentes tiempos de retención. Aquí, se observa un pico de relación de carga maestra de 144 para MDA y un pico de relación de carga maestra de 158 para MMDA. Un ejemplo de la cuantificación basada en HPLC de la función de la xanthe oxidasa se demuestra en el tiempo de incubación de cero minutos y el tiempo de incubación de cuatro horas.

Si el ensayo se ejecuta correctamente, se deben observar tres picos con el detector fluorescente, uno para dos ap, uno para Terran y otro para ISO terin. Tenga en cuenta que el pico de ISO terin más alto para el tiempo de incubación de cuatro horas debido al aumento de la actividad de la enzima santhe oxidasa. Debido a que este ensayo mide la función enzimática, la congelación y descongelación repetidas de la muestra pueden alterar esto.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir con precisión varios marcadores bioquímicos de la isquemia por hipoxia neonatal.