Name: Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Aprende a generar aptámeros de ARN anti-gp120 del VIH mediante SELEX en filtro de nitrocelulosa. Este método permite aislar ligandos de alta afinidad para terapia antirretroviral dirigida.

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Damos las gracias a Britta Hoehn, Sun Guihua, Soifer Harris y Lisa Scherer útil para los debates. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud y AI29329 HL07470 otorgado a JJR Los siguientes reactivos fueron obtenidos a través de la Investigación y el Programa de SIDA de los NIH de reactivos de referencia, la División de SIDA, NIAID, NIH: el Cho-EE y de células CHO-gp160 línea, el pNL4-3 luc vector, el VIH-1 gp120 BaL de DAIDS, el NIAID.

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<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
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<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
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<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R y JZ tiene una patente pendiente en el &quot;tipo de células específicas del sistema de entrega aptamer-siRNA para el tratamiento del VIH-1&quot;. USPTO, No.<strong&gt; 12/328994</strong&gt; Fecha de publicación: 11 de junio de 2009.

Los aptámeros son in vitro desarrollado ácidos nucleicos que asumen específica y estable formas tridimensionales, proporcionando muy específicos, la unión estrecha de moléculas específicas 8. La baja afinidad nanomolar vinculante y especificidad exquisita de aptámeros a sus objetivos que sean versátiles herramientas de diagnóstico, imágenes in vivo, y la terapéutica 9. Con el advenimiento de la tecnología aptamer para la entrega de siRNA objetivo ahora es posible usar la ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> MF-Millipore filtro de membrana </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> Tamaño de poro 0,45 m </td></tr><tr><td> Swinnex portafiltros </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> 13 mm de diámetro </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> De purificación de ADN </td></tr><tr><td> Microcon YM-30 columnas </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> ARN concentración </td></tr><tr><td> Bio-spin columna del 30 de </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> ARN purificación </td></tr><tr><td> PCR Taq ADN polimerasa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> Thermoscript RT-PCR sistema </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe Kit T7 transcripción </td><td> EpiCentre </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP para PCR </td><td> Roche </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido ribonucleico, el traslado de E. coli </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R1753 </td><td> tRNA competidor </td></tr><tr><td> VIH-1 Ba-L proteína gp120 </td><td> la investigación del SIDA y el Programa de reactivos de referencia </td><td> 4961 </td><td> Proteína diana </td></tr><tr><td> SiRNA silenciador kit de etiquetado - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol / cloroformo 01/05 solución (pH 4,5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> Cloroformo / isopropanol 24 / 1 solución </td><td> Sigma </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> Ternero intestinal fosfatasa (CIP) </td><td> Nueva Inglaterra BioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> Polinucleótido quinasa T4 </td><td> Nueva Inglaterra BioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> Glucógeno </td><td> Roche </td><td> 10 901 393 001 </td><td> ARN precipitación </td></tr><tr><td> Gamma-P-32 ATP </td><td> MP Biomédica </td><td> 013502002 </td><td> Radiactividad </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19:01 </td><td> Nacional de Diagnóstico </td><td> CE-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> Nacional de Diagnóstico </td><td> CE-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;-tetrametiletilendiamina (TMEMD) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Persulfato de amonio (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-metionina sulfoximina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5379-250 mg </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 los medios de comunicación </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de bicarbonato sódico, un 7,5% w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> Medio esencial mínimo (MEM) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM no aminoácidos esenciales (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> TA kit de clonación con pCR 2.1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del vih aptámeros para la entrega de sirna

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

La epidemia mundial de infección por el VIH ha creado una necesidad urgente de nuevas clases de fármacos antirretrovirales. La potente capacidad de interferente pequeño (si) ARN para inhibir la expresión de los transcritos de ARN complementarias está siendo explotado como una nueva clase de terapias para una variedad de enfermedades incluyendo el VIH. Muchos informes anteriores han demostrado que las nuevas estrategias basadas en el ARNi terapéutico anti-HIV/AIDS tienen una considerable promesa, sin embargo, un obstáculo clave para la exitosa aplicación terapéutica y la traducción clínica de siRNAs es la prestación eficiente. Sobre todo, teniendo en cuenta la seguridad y la eficacia de tratamientos basados ​​en el ARNi, es muy conveniente para desarrollar un planteamiento selectivo de la entrega del siRNA intracelulares a las poblaciones de células o tejidos específicos. El VIH-1 proteína gp120, un sobre glicoproteína en la superficie del VIH-1, juega un papel importante en la entrada del virus en las células CD4. La interacción de la gp120 y CD4 que provoca el VIH-1 de entrada e inicia la fusión de células ha sido validado como clínicamente relevante antivirales estrategia para el descubrimiento de fármacos. Aquí, en primer lugar, discutir la selección e identificación de los 2&#39;-F modificado aptámeros anti-gp120 del VIH ARN. Utilizando un método SELEX filtro de nitrocelulosa convencionales, varios aptámeros nuevo con afinidad nanomolar fueron aislados de un 50 al azar de la biblioteca nt ARN. Con el fin de recabar las especies vinculado con una mayor afinidad, el rigor de la selección está cuidadosamente controlada mediante el ajuste de las condiciones. Los aptámeros seleccionadas pueden unirse específicamente y de forma rápida internaliza en las células que expresan la proteína de envoltura del VIH-1. Además, los aptámeros el único que puede neutralizar el VIH-1 infectividad. Sobre la base de la mejor aptamer A-1, también creamos un nuevo doble función inhibitoria anti-gp120 aptamer-siRNA quimera en la que tanto el aptámero y las partes han siRNA potente contra el VIH actividades. Además, utilizamos la gp120 siRNA aptamer quimeras para la entrega del tipo de células específicas de los siRNA en el VIH-1 las células infectadas. Esta función dual quimera muestra un considerable potencial de la combinación de varios agentes de ácidos nucleicos terapéuticos (aptámero y siRNA) en la supresión de la infección por VIH-1, por lo que las quimeras siRNA aptamer atractivo candidatos terapéuticos para pacientes que no la terapia antirretroviral altamente activa (HAART).

Varios fluoro-2&#39;-aptámeros de ARN del VIH-1BA-L con gp120 nanomol afinidad están aisladas de la biblioteca de ARN por<em&gt; In vitro</em&gt; Procedimiento SELEX. Un nuevo doble función inhibitoria anti-gp120 aptamer-siRNA quimera se crea y se muestra muy prometedora para sistémica anti-VIH.

Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA

La epidemia mundial de infección por el VIH ha generado una necesidad urgente de nuevas clases de agentes antirretrovirales. La potente capacidad de los pequeños interferentes...

El objetivo general de los siguientes experimentos es generar RNA Aptima in vitro para la proteína GP120 del VIH-1 utilizando una membrana de nitrocelulosa. Esto se logra mediante PCR y posterior transcripción in vitro con T7. Para preparar el ADN inicial y la biblioteca de ARN aleatorio como segundo paso, se aplica sobre un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido una mezcla del ARN de la biblioteca y la proteína diana, lo que permite el aislamiento de las moléculas de ARN unidas de las especies de ARN no unidas.Después de 12 ciclos de selección, la biblioteca de ARN se clona y se secuencia para identificar los candidatos individuales de aptámeros de ARN presentes en la biblioteca. Los resultados obtenidos permiten identificar varios aptámeros nuevos con afinidad en el rango nanomolar, según ensayos de desplazamiento en gel y microscopía confocal. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los ensayos basados en placas o en columnas, es su simplicidad y que no requiere un pretratamiento de la proteína ni de las bibliotecas, como la inmovilización de la proteína sobre la base. La biblioteca de ARN para el aislamiento de aptámeros de ARN anti GP120 del VIH se prepara a partir de una biblioteca de ADN sintetizada comercialmente que contiene secuencias aleatorias de 50 nucleótidos.La secuencia de la biblioteca de oligonucleótidos de ADN de cadena sencilla tiene una longitud de 81 nucleótidos. Como se muestra en este diagrama, la región aleatoria está flanqueada por regiones constantes: un tumor de 30 en el extremo cinco prima y un 16 MA en el extremo tres prima. Las regiones constantes incluyen el promotor T siete para la transcripción in vitro y una etiqueta en el extremo tres prima para la R-T-P-C-R.Amplifique la biblioteca aleatoria de oligonucleótidos de ADN de cadena sencilla mediante PCR, limitando la PCR a 10 ciclos para preservar la abundancia de la biblioteca original de ADN. Después de las reacciones de PCR, el conjunto amplificado de ADN de doble cadena se recupera utilizando un kit de purificación en gel. El ADN de doble cadena se convierte luego en una biblioteca de ARN utilizando el kit cript siguiendo las instrucciones del fabricante, sustituyendo en la mezcla de reacción de transcripción CTP y UTP por citidina trifosfato con dos fluoros y uridina trifosfato con dos fluoros, con el fin de producir ARN resistente a ribonucleasas.Una vez finalizadas las reacciones de transcripción, digiera las reacciones con DS uno para eliminar el ADN de la plantilla y purifíquelas mediante un gel de poliacrilamida al 8 % y urea siete molar. Finalmente, cuantifique la biblioteca de ARN purificada mediante espectrofotometría UV. Antes de la selección de optimas, prepare los tampones necesarios y almacénelos a las temperaturas adecuadas.Tampón Heaps a temperatura ambiente y tampones para el plegamiento de ARN y unión de ARN a menos 20 grados Celsius. Antes de iniciar el primer ciclo de selección, preequilibre el grupo aleatorio de ARN en un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido a temperatura ambiente durante 30 minutos para minimizar la unión no específica con el filtro. Después de 30 minutos, retire el filtro de nitrocelulosa.Combine la piscina de ARN aleatorio pre-limpiada y la proteína GP120 del VIH-1 en tampón de unión de ARN de baja salinidad, incube en una plataforma rotatoria a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, pase la reacción a través de un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido y lave con un mililitro de tampón de unión de ARN de baja salinidad para eluir el ARN unido del filtro. Retire la membrana de nitrocelulosa del portafiltros.Añada 200 microlitros de tampón de elución a la membrana y caliente a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Después de que el ARN se haya eluido del filtro, centrifugue brevemente el tubo, transfiera la solución de ARN a un tubo nuevo y realice una extracción con fenol-cloroformo en el mismo. Utilice una columna MicroCon YM 30 para concentrar el ARN y eluir el ARN recuperado con 20 microlitros de agua libre de ARNasas.El pool de ARN recuperado se retrotranscribe y amplifica luego durante 15 ciclos de PCR. Después de purificar el pool de doble cadena amplificado, se transcribe en un nuevo pool de ARN como se demostró anteriormente antes de la siguiente ronda de selección. Reorganicen el pool de ARN en tampón HBS 1X, caliéntenlo a 95 grados Celsius durante tres minutos y luego dejen que enfríe lentamente hasta 37 grados Celsius.Continúe la incubación a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Absorba el ARN renaturalizado y páselo a un filtro de nitrocelulosa durante 30 minutos antes de la incubación con la proteína objetivo de la cubierta del VIH GP120 para la siguiente ronda de selección. Con el fin de obtener con éxito los apts con mayor afinidad de unión, la rigurosidad de la selección debe controlarse cuidadosamente mediante el ajuste de las condiciones de selección.Las condiciones de selección se muestran en esta tabla. Para los ciclos de cellex del uno al cuatro, incubar el pool de ARN pre-limpiado con la proteína diana en tampón de unión de ARN de bajo contenido salino durante 30 minutos. Después del cuarto ciclo de cellex, utilizar tampón de unión de ARN de alto contenido salino a medida que avanza el cellex.Reduzca la cantidad de proteína GP120 e incremente el ARNt competidor de levadura para aumentar la rigurosidad de la selección de aptámeros en cada ciclo. El progreso de la selección de aptámeros de GP120 del VIH-1 se monitorea mediante un ensayo de unión a filtro. En este video, se ensayarán los 12 pools de ARN recolectados tras completar todos los ciclos de selección.Primero, elimine el trifosfato de cinco primas inicial tratando cada grupo de ARN con fosfatasa intestinal de becerro durante una hora a 37 grados Celsius. Para preparar el ARN tratado con CIP para la marcación con la cinasa de polinucleótidos T4 y P32 80 p, caliente a 95 grados Celsius durante cinco minutos, seguido de enfriamiento en hielo. La marcación del ARN se realiza en una sala caliente diseñada para experimentos que involucran radioactividad, en tampón PNK, cinasa de polinucleótidos T4, un microlitro de ATP gamma-P32 y agua hasta un volumen final de 20 microlitros. Incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos.Después de 30 minutos, agregue 20 microlitros de agua a cada reacción y purifique mediante una columna G 50. Finalmente, obtenga 40 microlitros de ARN marcado con una concentración final de 250 nano molar. Refolde cada grupo de ARN marcado en tampón HBS al uno por ciento, calentando a 95 grados Celsius durante tres minutos. A continuación, deje enfriar hasta 37 grados Celsius, lo que tomará entre 30 y 40 minutos.Continúe la incubación a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Una vez que la población de ARN se haya repliado, realice una reacción de unión de 100 microlitros. Combine la población de ARN marcada en el extremo con la proteína GP120 y un exceso molar diez veces mayor de ARNt competidor no específico en tampón de unión de ARN de alta salinidad, e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.Al final de los 30 minutos, separe 50 microlitros de la reacción de unión mediante un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido. Luego, lave el filtro con dos mililitros de tampón de unión y cuente la actividad radiactiva retenida en el filtro utilizando un contador de centelleo multipropósito como cuenta de control de entrada. Los 50 microlitros restantes de la reacción de unión al mismo tiempo, el ensayo de unión de la población de ARN después de cada ciclo de selección se analizó mediante un ensayo de unión a filtro con ARNt competidor para monitorear el progreso de VIH uno, GP uno 20.Las actividades de unión de selección de Optima se calcularon como el porcentaje de ARN de entrada retenido en el filtro en el complejo proteína-ARN, como se muestra aquí. El grupo inicial de ARN muestra solo el 0,1 % del ARN de entrada retenido en la membrana. Sin embargo, tras nueve rondas de selección, la novena biblioteca de ARN tiene un 9,72 % del ARN de entrada unido.Aunque se realizaron rondas adicionales de selección, no se observó un enriquecimiento adicional, lo que sugiere que se ha alcanzado la unión máxima de la población de ARN. Las actividades de unión de las poblaciones de ARN se confirmaron además mediante ensayos de retardo en gel. Estos resultados demuestran que algunos ligandos con alta especificidad de unión para la proteína diana se enriquecen sucesivamente en estas poblaciones de ARN.En este ejemplo, el grupo 12 de ARN mostró la actividad de unión más alta, ya que se alcanzó la unión máxima del grupo de ARN tras la ronda 12 de selección; este grupo de ARN se transcribió inversamente a ADNc, que posteriormente se amplificó mediante PCR. El producto de PCR se purificó y clonó en un vector de clonación TA, y se secuenció tras la alineación de 140 clones. Se identificaron seis grupos de optimas anti GP uno 20.Solo se indican en esta tabla las secuencias aleatorias de las regiones centrales de Aptima. Aproximadamente el 40 % de los clones contienen una secuencia conservada. Se seleccionó una secuencia representativa de cada grupo para su posterior caracterización debido a su abundancia relativa dentro de su grupo mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad en gel nativo; se calcularon las constantes de disociación KD de estos aptámeros representativos, por ejemplo, A uno.Lo mejor de los abers tiene un valor aparente de KD de 52 nanomolares. Como se muestra aquí. Estos abers seleccionados pueden unirse selectivamente al objetivo HIV uno bowel GP uno 20, pero no a la proteína H-I-V-G-P uno 20 CM. Células CHO G uno 60 que expresan establemente la glicoproteína de envoltura del VIH GP uno 60 se utilizaron para probar la unión y la internalización de los optimas anti GP uno 20 seleccionados.Estas células no procesan la GP160 en GP120 y G41, ya que carecen de las proteasas codificadas por gag necesarias para el procesamiento del envoltorio. El análisis por citometría de flujo revela que los aptámeros marcados con S3 se unen específicamente a las células CHO que expresan GP160, pero no a las células control CHO EE, que no expresan GP160. Además, la microscopía confocal en tiempo real de células vivas en el eje Z indica que, tras dos horas de incubación, el aptámero marcado con SI3 es internalizado selectivamente por las células CHO GP160, pero no por las células control CHO EE. También se observó que el aptámero se agrupaba dentro del citoplasma, lo que sugiere que el aptámero GP120 podría entrar en las células mediante endocitosis mediada por receptores.Finalmente, tras ver esta emisión, debería tener una buena comprensión del uso y de cómo utilizar las medidas basadas en campo para aislar los ARN Abers.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Comprender las conformaciones de los antígenos de superficie viral es necesario para evaluar la neutralización de anticuerpos y guiar el diseño de inmunógenos de vacunas efectivos. En este trabajo describimos un ensayo ELISA basado en células que permite estudiar el reconocimiento de la trimérica VIH-1 Env expresada en la superficie de las células transfectadas por anticuerpos anti-Env específicos.

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

A continuación, presentamos un protocolo para generar un adenovirus divalente tipo 5 (Ad5) vectores de prueba de principio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 mediante la utilización de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación. Este vector se demostró la aptitud para exhibir cualitativa, la capacidad de escapar de sueros Ad5-positivo in vitro, y la antigenicidad, así como la inmunogenicidad de los antígenos incorporados.

La utilización de la Estrategia de la cápside-Incorporación Antigen para el desarrollo de enfoques adenovirus serotipo 5-Vectored de vacunas

Se describen los métodos para evaluar la eficacia y toxicidad de las moléculas de ARN dirigidas a las etapas posteriores a la integración del ciclo de replicación del VIH-1. Estos métodos son útiles para el cribado de nuevas moléculas y la optimización del formato de las existentes.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Un enfoque modular para la síntesis de N- glicanos para enganchar a un vidrio recubierto de óxido de aluminio slide (diapositiva ACG) como un microarray de glicanos se ha desarrollado y ha demostrado su uso para la elaboración de perfiles de un VIH ampliamente neutralizante del anticuerpo.

Chemo-enzimático síntesis de N- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del VIH perfiles

Se describe un ensayo basado en células para reportar VIH-1 la fusión a través de la expresión de la proteína verde fluorescente detectable por microscopía de flujo cytometry o fluorescencia. Puede ser utilizado para probar los inhibidores de entrada viral (específicamente en la etapa de fusión) en sistemas libres de células y células a la infección.

Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

Aquí se proporciona un método detallado que describe la purificación, el enjuimiento y la caracterización de nanopartículas de proteínas autoensamblables (SAPN) para su uso en el desarrollo de vacunas.

Producción de E. coli-expresada Nanopartículas de Proteína Auto-Ensamblaje para Vacunas Que Requieren Presentación de Epitope Trimérico

La proteína de anticuerpo recombinante expresada en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO y anticuerpos monoclonales producidos utilizando la tecnología tradicional de hibridoma puede reconocer y unirse a la proteína N aminopeptidasa porcina (APN).

Producción de anticuerpos monoclonales dirigidos a la aminopeptidasa N en el epitelio de la mucosa intestinal porcina

Aquí, presentamos un protocolo para detectar epítopos de neutralización en partículas similares a virus (VLP) que muestran antígenos. La inmunoprecipitación de las VLP derivadas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se realiza utilizando anticuerpos monoclonales específicos de glicoproteínas de la envoltura acoplados a perlas magnéticas conjugadas con proteína g. Las VLP capturadas se someten posteriormente a SDS-PAGE y western blot-análisis empleando anticuerpos específicos de gag de...

Detección de epítopos sensibles a la neutralización en antígenos mostrados en vacunas basadas en partículas similares a virus (VLP) utilizando un ensayo de captura

El patrón de glicosilación de un anticuerpo determina su rendimiento clínico, por lo que persisten los esfuerzos industriales y académicos para controlar la glicosilación. Dado que las campañas típicas de glicoingeniería requieren mucho tiempo y mano de obra, la generación de un protocolo rápido para caracterizar el impacto de los genes de glicosilación utilizando silenciamiento transitorio resultaría útil.

Glicoingeniería rápida de anticuerpos en células de ovario de hámster chino

Proporcionamos un protocolo que generalmente se puede aplicar para seleccionar aptámeros que se unen solo a virus infecciosos y no a virus que se han vuelto no infecciosos mediante un método de desinfección o a cualquier otro virus similar. Esto abre la posibilidad de determinar el estado de infectividad en pruebas portátiles y rápidas.

Selección in vitro de aptámeros para diferenciar virus infecciosos de virus no infecciosos

Aprende a generar aptámeros de ARN anti-gp120 del VIH mediante SELEX en filtro de nitrocelulosa. Este método permite aislar ligandos de alta afinidad para terapia antirretroviral dirigida.

Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA

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