Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA

El objetivo general de los siguientes experimentos es generar RNA Aptima in vitro para la proteína GP120 del VIH-1 utilizando una membrana de nitrocelulosa. Esto se logra mediante PCR y posterior transcripción in vitro con T7. Para preparar el ADN inicial y la biblioteca de ARN aleatorio como segundo paso, se aplica sobre un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido una mezcla del ARN de la biblioteca y la proteína diana, lo que permite el aislamiento de las moléculas de ARN unidas de las especies de ARN no unidas.

Después de 12 ciclos de selección, la biblioteca de ARN se clona y se secuencia para identificar los candidatos individuales de aptámeros de ARN presentes en la biblioteca. Los resultados obtenidos permiten identificar varios aptámeros nuevos con afinidad en el rango nanomolar, según ensayos de desplazamiento en gel y microscopía confocal. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los ensayos basados en placas o en columnas, es su simplicidad y que no requiere un pretratamiento de la proteína ni de las bibliotecas, como la inmovilización de la proteína sobre la base. La biblioteca de ARN para el aislamiento de aptámeros de ARN anti GP120 del VIH se prepara a partir de una biblioteca de ADN sintetizada comercialmente que contiene secuencias aleatorias de 50 nucleótidos.

La secuencia de la biblioteca de oligonucleótidos de ADN de cadena sencilla tiene una longitud de 81 nucleótidos. Como se muestra en este diagrama, la región aleatoria está flanqueada por regiones constantes: un tumor de 30 en el extremo cinco prima y un 16 MA en el extremo tres prima. Las regiones constantes incluyen el promotor T siete para la transcripción in vitro y una etiqueta en el extremo tres prima para la R-T-P-C-R.

Amplifique la biblioteca aleatoria de oligonucleótidos de ADN de cadena sencilla mediante PCR, limitando la PCR a 10 ciclos para preservar la abundancia de la biblioteca original de ADN. Después de las reacciones de PCR, el conjunto amplificado de ADN de doble cadena se recupera utilizando un kit de purificación en gel. El ADN de doble cadena se convierte luego en una biblioteca de ARN utilizando el kit cript siguiendo las instrucciones del fabricante, sustituyendo en la mezcla de reacción de transcripción CTP y UTP por citidina trifosfato con dos fluoros y uridina trifosfato con dos fluoros, con el fin de producir ARN resistente a ribonucleasas.

Una vez finalizadas las reacciones de transcripción, digiera las reacciones con DS uno para eliminar el ADN de la plantilla y purifíquelas mediante un gel de poliacrilamida al 8 % y urea siete molar. Finalmente, cuantifique la biblioteca de ARN purificada mediante espectrofotometría UV. Antes de la selección de optimas, prepare los tampones necesarios y almacénelos a las temperaturas adecuadas.

Tampón Heaps a temperatura ambiente y tampones para el plegamiento de ARN y unión de ARN a menos 20 grados Celsius. Antes de iniciar el primer ciclo de selección, preequilibre el grupo aleatorio de ARN en un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido a temperatura ambiente durante 30 minutos para minimizar la unión no específica con el filtro. Después de 30 minutos, retire el filtro de nitrocelulosa.

Combine la piscina de ARN aleatorio pre-limpiada y la proteína GP120 del VIH-1 en tampón de unión de ARN de baja salinidad, incube en una plataforma rotatoria a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, pase la reacción a través de un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido y lave con un mililitro de tampón de unión de ARN de baja salinidad para eluir el ARN unido del filtro. Retire la membrana de nitrocelulosa del portafiltros.

Añada 200 microlitros de tampón de elución a la membrana y caliente a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Después de que el ARN se haya eluido del filtro, centrifugue brevemente el tubo, transfiera la solución de ARN a un tubo nuevo y realice una extracción con fenol-cloroformo en el mismo. Utilice una columna MicroCon YM 30 para concentrar el ARN y eluir el ARN recuperado con 20 microlitros de agua libre de ARNasas.

El pool de ARN recuperado se retrotranscribe y amplifica luego durante 15 ciclos de PCR. Después de purificar el pool de doble cadena amplificado, se transcribe en un nuevo pool de ARN como se demostró anteriormente antes de la siguiente ronda de selección. Reorganicen el pool de ARN en tampón HBS 1X, caliéntenlo a 95 grados Celsius durante tres minutos y luego dejen que enfríe lentamente hasta 37 grados Celsius.

Continúe la incubación a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Absorba el ARN renaturalizado y páselo a un filtro de nitrocelulosa durante 30 minutos antes de la incubación con la proteína objetivo de la cubierta del VIH GP120 para la siguiente ronda de selección. Con el fin de obtener con éxito los apts con mayor afinidad de unión, la rigurosidad de la selección debe controlarse cuidadosamente mediante el ajuste de las condiciones de selección.

Las condiciones de selección se muestran en esta tabla. Para los ciclos de cellex del uno al cuatro, incubar el pool de ARN pre-limpiado con la proteína diana en tampón de unión de ARN de bajo contenido salino durante 30 minutos. Después del cuarto ciclo de cellex, utilizar tampón de unión de ARN de alto contenido salino a medida que avanza el cellex.

Reduzca la cantidad de proteína GP120 e incremente el ARNt competidor de levadura para aumentar la rigurosidad de la selección de aptámeros en cada ciclo. El progreso de la selección de aptámeros de GP120 del VIH-1 se monitorea mediante un ensayo de unión a filtro. En este video, se ensayarán los 12 pools de ARN recolectados tras completar todos los ciclos de selección.

Primero, elimine el trifosfato de cinco primas inicial tratando cada grupo de ARN con fosfatasa intestinal de becerro durante una hora a 37 grados Celsius. Para preparar el ARN tratado con CIP para la marcación con la cinasa de polinucleótidos T4 y P32 80 p, caliente a 95 grados Celsius durante cinco minutos, seguido de enfriamiento en hielo. La marcación del ARN se realiza en una sala caliente diseñada para experimentos que involucran radioactividad, en tampón PNK, cinasa de polinucleótidos T4, un microlitro de ATP gamma-P32 y agua hasta un volumen final de 20 microlitros. Incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, agregue 20 microlitros de agua a cada reacción y purifique mediante una columna G 50. Finalmente, obtenga 40 microlitros de ARN marcado con una concentración final de 250 nano molar. Refolde cada grupo de ARN marcado en tampón HBS al uno por ciento, calentando a 95 grados Celsius durante tres minutos. A continuación, deje enfriar hasta 37 grados Celsius, lo que tomará entre 30 y 40 minutos.

Continúe la incubación a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Una vez que la población de ARN se haya repliado, realice una reacción de unión de 100 microlitros. Combine la población de ARN marcada en el extremo con la proteína GP120 y un exceso molar diez veces mayor de ARNt competidor no específico en tampón de unión de ARN de alta salinidad, e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Al final de los 30 minutos, separe 50 microlitros de la reacción de unión mediante un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido. Luego, lave el filtro con dos mililitros de tampón de unión y cuente la actividad radiactiva retenida en el filtro utilizando un contador de centelleo multipropósito como cuenta de control de entrada. Los 50 microlitros restantes de la reacción de unión al mismo tiempo, el ensayo de unión de la población de ARN después de cada ciclo de selección se analizó mediante un ensayo de unión a filtro con ARNt competidor para monitorear el progreso de VIH uno, GP uno 20.

Las actividades de unión de selección de Optima se calcularon como el porcentaje de ARN de entrada retenido en el filtro en el complejo proteína-ARN, como se muestra aquí. El grupo inicial de ARN muestra solo el 0,1 % del ARN de entrada retenido en la membrana. Sin embargo, tras nueve rondas de selección, la novena biblioteca de ARN tiene un 9,72 % del ARN de entrada unido.

Aunque se realizaron rondas adicionales de selección, no se observó un enriquecimiento adicional, lo que sugiere que se ha alcanzado la unión máxima de la población de ARN. Las actividades de unión de las poblaciones de ARN se confirmaron además mediante ensayos de retardo en gel. Estos resultados demuestran que algunos ligandos con alta especificidad de unión para la proteína diana se enriquecen sucesivamente en estas poblaciones de ARN.

En este ejemplo, el grupo 12 de ARN mostró la actividad de unión más alta, ya que se alcanzó la unión máxima del grupo de ARN tras la ronda 12 de selección; este grupo de ARN se transcribió inversamente a ADNc, que posteriormente se amplificó mediante PCR. El producto de PCR se purificó y clonó en un vector de clonación TA, y se secuenció tras la alineación de 140 clones. Se identificaron seis grupos de optimas anti GP uno 20.

Solo se indican en esta tabla las secuencias aleatorias de las regiones centrales de Aptima. Aproximadamente el 40 % de los clones contienen una secuencia conservada. Se seleccionó una secuencia representativa de cada grupo para su posterior caracterización debido a su abundancia relativa dentro de su grupo mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad en gel nativo; se calcularon las constantes de disociación KD de estos aptámeros representativos, por ejemplo, A uno.

Lo mejor de los abers tiene un valor aparente de KD de 52 nanomolares. Como se muestra aquí. Estos abers seleccionados pueden unirse selectivamente al objetivo HIV uno bowel GP uno 20, pero no a la proteína H-I-V-G-P uno 20 CM. Células CHO G uno 60 que expresan establemente la glicoproteína de envoltura del VIH GP uno 60 se utilizaron para probar la unión y la internalización de los optimas anti GP uno 20 seleccionados.

Estas células no procesan la GP160 en GP120 y G41, ya que carecen de las proteasas codificadas por gag necesarias para el procesamiento del envoltorio. El análisis por citometría de flujo revela que los aptámeros marcados con S3 se unen específicamente a las células CHO que expresan GP160, pero no a las células control CHO EE, que no expresan GP160. Además, la microscopía confocal en tiempo real de células vivas en el eje Z indica que, tras dos horas de incubación, el aptámero marcado con SI3 es internalizado selectivamente por las células CHO GP160, pero no por las células control CHO EE. También se observó que el aptámero se agrupaba dentro del citoplasma, lo que sugiere que el aptámero GP120 podría entrar en las células mediante endocitosis mediada por receptores.

Finalmente, tras ver esta emisión, debería tener una buena comprensión del uso y de cómo utilizar las medidas basadas en campo para aislar los ARN Abers.