Name: Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Aprende a generar aptámeros de ARN anti-gp120 del VIH mediante SELEX en filtro de nitrocelulosa. Este método permite aislar ligandos de alta afinidad para terapia antirretroviral dirigida.

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Damos las gracias a Britta Hoehn, Sun Guihua, Soifer Harris y Lisa Scherer útil para los debates. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud y AI29329 HL07470 otorgado a JJR Los siguientes reactivos fueron obtenidos a través de la Investigación y el Programa de SIDA de los NIH de reactivos de referencia, la División de SIDA, NIAID, NIH: el Cho-EE y de células CHO-gp160 línea, el pNL4-3 luc vector, el VIH-1 gp120 BaL de DAIDS, el NIAID.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
<li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SELEX+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li>
<li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type%2C+secreted%2C+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li>
<li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li>
<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R y JZ tiene una patente pendiente en el &quot;tipo de células específicas del sistema de entrega aptamer-siRNA para el tratamiento del VIH-1&quot;. USPTO, No.<strong&gt; 12/328994</strong&gt; Fecha de publicación: 11 de junio de 2009.

Los aptámeros son in vitro desarrollado ácidos nucleicos que asumen específica y estable formas tridimensionales, proporcionando muy específicos, la unión estrecha de moléculas específicas 8. La baja afinidad nanomolar vinculante y especificidad exquisita de aptámeros a sus objetivos que sean versátiles herramientas de diagnóstico, imágenes in vivo, y la terapéutica 9. Con el advenimiento de la tecnología aptamer para la entrega de siRNA objetivo ahora es posible usar la ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> MF-Millipore filtro de membrana </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> Tamaño de poro 0,45 m </td></tr><tr><td> Swinnex portafiltros </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> 13 mm de diámetro </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> De purificación de ADN </td></tr><tr><td> Microcon YM-30 columnas </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> ARN concentración </td></tr><tr><td> Bio-spin columna del 30 de </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> ARN purificación </td></tr><tr><td> PCR Taq ADN polimerasa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> Thermoscript RT-PCR sistema </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe Kit T7 transcripción </td><td> EpiCentre </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP para PCR </td><td> Roche </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido ribonucleico, el traslado de E. coli </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R1753 </td><td> tRNA competidor </td></tr><tr><td> VIH-1 Ba-L proteína gp120 </td><td> la investigación del SIDA y el Programa de reactivos de referencia </td><td> 4961 </td><td> Proteína diana </td></tr><tr><td> SiRNA silenciador kit de etiquetado - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol / cloroformo 01/05 solución (pH 4,5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> Cloroformo / isopropanol 24 / 1 solución </td><td> Sigma </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> Ternero intestinal fosfatasa (CIP) </td><td> Nueva Inglaterra BioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> Polinucleótido quinasa T4 </td><td> Nueva Inglaterra BioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> Glucógeno </td><td> Roche </td><td> 10 901 393 001 </td><td> ARN precipitación </td></tr><tr><td> Gamma-P-32 ATP </td><td> MP Biomédica </td><td> 013502002 </td><td> Radiactividad </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19:01 </td><td> Nacional de Diagnóstico </td><td> CE-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> Nacional de Diagnóstico </td><td> CE-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;-tetrametiletilendiamina (TMEMD) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Persulfato de amonio (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-metionina sulfoximina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5379-250 mg </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 los medios de comunicación </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de bicarbonato sódico, un 7,5% w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> Medio esencial mínimo (MEM) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM no aminoácidos esenciales (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> TA kit de clonación con pCR 2.1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del vih aptámeros para la entrega de sirna

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

La epidemia mundial de infección por el VIH ha creado una necesidad urgente de nuevas clases de fármacos antirretrovirales. La potente capacidad de interferente pequeño (si) ARN para inhibir la expresión de los transcritos de ARN complementarias está siendo explotado como una nueva clase de terapias para una variedad de enfermedades incluyendo el VIH. Muchos informes anteriores han demostrado que las nuevas estrategias basadas en el ARNi terapéutico anti-HIV/AIDS tienen una considerable promesa, sin embargo, un obstáculo clave para la exitosa aplicación terapéutica y la traducción clínica de siRNAs es la prestación eficiente. Sobre todo, teniendo en cuenta la seguridad y la eficacia de tratamientos basados ​​en el ARNi, es muy conveniente para desarrollar un planteamiento selectivo de la entrega del siRNA intracelulares a las poblaciones de células o tejidos específicos. El VIH-1 proteína gp120, un sobre glicoproteína en la superficie del VIH-1, juega un papel importante en la entrada del virus en las células CD4. La interacción de la gp120 y CD4 que provoca el VIH-1 de entrada e inicia la fusión de células ha sido validado como clínicamente relevante antivirales estrategia para el descubrimiento de fármacos. Aquí, en primer lugar, discutir la selección e identificación de los 2&#39;-F modificado aptámeros anti-gp120 del VIH ARN. Utilizando un método SELEX filtro de nitrocelulosa convencionales, varios aptámeros nuevo con afinidad nanomolar fueron aislados de un 50 al azar de la biblioteca nt ARN. Con el fin de recabar las especies vinculado con una mayor afinidad, el rigor de la selección está cuidadosamente controlada mediante el ajuste de las condiciones. Los aptámeros seleccionadas pueden unirse específicamente y de forma rápida internaliza en las células que expresan la proteína de envoltura del VIH-1. Además, los aptámeros el único que puede neutralizar el VIH-1 infectividad. Sobre la base de la mejor aptamer A-1, también creamos un nuevo doble función inhibitoria anti-gp120 aptamer-siRNA quimera en la que tanto el aptámero y las partes han siRNA potente contra el VIH actividades. Además, utilizamos la gp120 siRNA aptamer quimeras para la entrega del tipo de células específicas de los siRNA en el VIH-1 las células infectadas. Esta función dual quimera muestra un considerable potencial de la combinación de varios agentes de ácidos nucleicos terapéuticos (aptámero y siRNA) en la supresión de la infección por VIH-1, por lo que las quimeras siRNA aptamer atractivo candidatos terapéuticos para pacientes que no la terapia antirretroviral altamente activa (HAART).

Varios fluoro-2&#39;-aptámeros de ARN del VIH-1BA-L con gp120 nanomol afinidad están aisladas de la biblioteca de ARN por<em&gt; In vitro</em&gt; Procedimiento SELEX. Un nuevo doble función inhibitoria anti-gp120 aptamer-siRNA quimera se crea y se muestra muy prometedora para sistémica anti-VIH.

Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA

La epidemia mundial de infección por el VIH ha generado una necesidad urgente de nuevas clases de agentes antirretrovirales. La potente capacidad de los pequeños interferentes...

El objetivo general de los siguientes experimentos es generar RNA Aptima in vitro para la proteína GP120 del VIH-1 utilizando una membrana de nitrocelulosa. Esto se logra mediante PCR y posterior transcripción in vitro con T7. Para preparar el ADN inicial y la biblioteca de ARN aleatorio como segundo paso, se aplica sobre un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido una mezcla del ARN de la biblioteca y la proteína diana, lo que permite el aislamiento de las moléculas de ARN unidas de las especies de ARN no unidas.Después de 12 ciclos de selección, la biblioteca de ARN se clona y se secuencia para identificar los candidatos individuales de aptámeros de ARN presentes en la biblioteca. Los resultados obtenidos permiten identificar varios aptámeros nuevos con afinidad en el rango nanomolar, según ensayos de desplazamiento en gel y microscopía confocal. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los ensayos basados en placas o en columnas, es su simplicidad y que no requiere un pretratamiento de la proteína ni de las bibliotecas, como la inmovilización de la proteína sobre la base. La biblioteca de ARN para el aislamiento de aptámeros de ARN anti GP120

development-cell-type-specific-anti-hiv-gp120-aptamers-for-sirna

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Comprender las conformaciones de los antígenos de superficie viral es necesario para evaluar la neutralización de anticuerpos y guiar el diseño de inmunógenos de vacunas efectivos. En este trabajo describimos un ensayo ELISA basado en células que permite estudiar el reconocimiento de la trimérica VIH-1 Env expresada en la superficie de las células transfectadas por anticuerpos anti-Env específicos.

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

A continuación, presentamos un protocolo para generar un adenovirus divalente tipo 5 (Ad5) vectores de prueba de principio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 mediante la utilización de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación. Este vector se demostró la aptitud para exhibir cualitativa, la capacidad de escapar de sueros Ad5-positivo in vitro, y la antigenicidad, así como la inmunogenicidad de los antígenos incorporados.

La utilización de la Estrategia de la cápside-Incorporación Antigen para el desarrollo de enfoques adenovirus serotipo 5-Vectored de vacunas

Este protocolo describe los métodos para construir un modelo de ratón humanizado de médula ósea/hígado/timo con inmunidad modificada basada en células madre contra la infección por VIH.

-Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado

Se describen los métodos para evaluar la eficacia y toxicidad de las moléculas de ARN dirigidas a las etapas posteriores a la integración del ciclo de replicación del VIH-1. Estos métodos son útiles para el cribado de nuevas moléculas y la optimización del formato de las existentes.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Un enfoque modular para la síntesis de N- glicanos para enganchar a un vidrio recubierto de óxido de aluminio slide (diapositiva ACG) como un microarray de glicanos se ha desarrollado y ha demostrado su uso para la elaboración de perfiles de un VIH ampliamente neutralizante del anticuerpo.

Chemo-enzimático síntesis de N- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del VIH perfiles

Se describe un ensayo basado en células para reportar VIH-1 la fusión a través de la expresión de la proteína verde fluorescente detectable por microscopía de flujo cytometry o fluorescencia. Puede ser utilizado para probar los inhibidores de entrada viral (específicamente en la etapa de fusión) en sistemas libres de células y células a la infección.

Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

El método BSelex para identificar y recuperar anticuerpos específicos de antígenos individuales de células mononucleares de sangre periférica humana combina citometría de flujo con PCR de una sola célula y clonación.

Método de cribado de una sola célula para la selección y recuperación de anticuerpos con especificidades deseadas de poblaciones de células B de memoria humana enriquecidas

Aquí se proporciona un método detallado que describe la purificación, el enjuimiento y la caracterización de nanopartículas de proteínas autoensamblables (SAPN) para su uso en el desarrollo de vacunas.

Producción de E. coli-expresada Nanopartículas de Proteína Auto-Ensamblaje para Vacunas Que Requieren Presentación de Epitope Trimérico

El patrón de glicosilación de un anticuerpo determina su rendimiento clínico, por lo que persisten los esfuerzos industriales y académicos para controlar la glicosilación. Dado que las campañas típicas de glicoingeniería requieren mucho tiempo y mano de obra, la generación de un protocolo rápido para caracterizar el impacto de los genes de glicosilación utilizando silenciamiento transitorio resultaría útil.

Glicoingeniería rápida de anticuerpos en células de ovario de hámster chino

Proporcionamos un protocolo que generalmente se puede aplicar para seleccionar aptámeros que se unen solo a virus infecciosos y no a virus que se han vuelto no infecciosos mediante un método de desinfección o a cualquier otro virus similar. Esto abre la posibilidad de determinar el estado de infectividad en pruebas portátiles y rápidas.

Selección in vitro de aptámeros para diferenciar virus infecciosos de virus no infecciosos

Aprende a generar aptámeros de ARN anti-gp120 del VIH mediante SELEX en filtro de nitrocelulosa. Este método permite aislar ligandos de alta afinidad para terapia antirretroviral dirigida.

Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA

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