Name: Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Aprende la electroporación in utero para la entrega génica en el sistema nervioso central embrionario. Este método permite estudiar la función de genes durante el desarrollo neural en ratón.

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Los autores desean agradecer a Eva Hadzimova, Mattar Pierre y Kovach Christopher por su trabajo inicial en el establecimiento en la tecnología de electroporación in utero en el laboratorio de CS. Este trabajo fue financiado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) subvención (44.094 MOP) y CIHR / Fundación Fighting Blindness (FFB) Nuevas equipo de Grant (00933-000) a CS y el Hospital de Niños de Alberta una beca de la Fundación de Investigación de DMK. RD fue apoyado por una beca HOPE CIHR Canadá, RC se apoya en una Beca FFB y LML fue apoyado por una beca de formación CIHR en Genética y Desarrollo Infantil.

<ol><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li>
<li>Langevin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+in+utero+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+gene+regulatory+elements+in+the+murine+telencephalon.+Dev+Dyn+236%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236.</a> , 1273-1286 (2007).</li>
<li>Mattar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+helix-loop-helix+transcription+factors+cooperate+to+specify+a+cortical+projection+neuron+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity.</a> Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).</li>
<li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li>
<li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li>
<li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li>
<li>Vue, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li>
<li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice%3A+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).</li>
<li>Buffo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+transcription+factor+Olig2+in+response+to+brain+injuries%3A+implications+for+neuronal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).</li>
</ol>

En el útero de la electroporación se puede utilizar para analizar una amplia variedad de procesos de desarrollo. Por ejemplo, la transfección de genes reporteros, como las buenas prácticas agrarias, mCherry o fosfatasa alcalina puede ser utilizado para llevar a cabo el linaje de búsqueda y experimentos de migración neuronal. Por otra parte, la recombinasa Cre puede ser transitoriamente expresó que la eliminación selectiva de un alelo floxed en un espacio y / o de manera temporal controlada. Además, shRNA o domi...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Categoría </th></tr><tr><td> Tijeras finas </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 14078-10 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Iris tijeras curvas </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 14061-10 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Ex-Delicado Porta-agujas </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 12002-12 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Anillo de pinza, de 9 mm </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11103-09 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Ojo vestirse Forcep </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11051-10 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Dumont # 7 DMX Forcep </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11271-30 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Dumont # 5 DMX Forcep </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11251-30 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Tejido pinza Adson- </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11027-12 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Reflejo de aplicador de clip </td><td> Mundial de instrumentos de precisión </td><td> 500343 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Cuchara perforada, 15 mm de diámetro </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 10370-18 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Autoclip Remover </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Seda Negro trenzado de sutura </td><td> Ethicon Inc. </td><td> K871 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Reflejo de la piel de cierre inoxidable clips de acero herida </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 500346 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> ECM 830 electroporación sistema de onda cuadrada </td><td> VWR-CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Pinzas w / Brecha variable 2 Ronda de 5 mm de electrodo de platino Plate </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P5 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Pinzas w / Brecha variable 2 Ronda 7mm electrodo de platino Plate </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P7 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Eppendorf FemtoJet microinyector </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111-488 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Control de pie de Eppendorf FemtoJet microinyector </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (misc) </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Modelo Bransonic limpiador ultrasónico 1510R-DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995-534 CPN-952-118 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Sutter P97 micropipeta Extractor </td><td> Sutter Instrument, Carsen Group Inc. </td><td> P-97 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Micropipetas - borosilicato con filamento de OD: 1 mm, ID: 0,78 mm, 10 cm de longitud </td><td> Sutter Instrumento </td><td> BF100-78-10 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> 3-ejes manipulador grueso </td><td> Carl Zeiss Canadá Inc. </td><td> M-152 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Dispositivo de sujeción magnética para micromanipulador </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> M1 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Placa base para micromanipulador </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 5052 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Micropipeta titular </td><td> Mundial de la PrDECISIÓN Instrumentos </td><td> MPH3 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Micropipeta Mango </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 5444 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Estereomicroscopio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Vaporizador de isoflurano anestesia </td><td> Porter Instrumentos Empresa </td><td> MODELO 100-F </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Metriclean2 solución de baja espuma para ultrasonidos instrumentos quirúrgicos </td><td> Metrex Research Corporation </td><td> 10-8100 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Gentamicina 40mg/ml en 0,2 g azul de metileno spray antibiótico después de la sutura </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Germex para la esterilización de instrumentos quirúrgicos </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> BNP pomada oftálmica </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Distribuido por Church &amp; Dwight Co., Inc. </td><td> disponibles en el mercado </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Stanhexidine 4% w / v piel más limpia </td><td> Omega Laboratories Inc. </td><td> 01938983 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> La buprenorfina (Temgesic) analgésico </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Sulfa &quot;25&quot; sulfametazina antibiótico oral </td><td> Profesionales de Laboratorios Veterinarios </td><td> DIN # 00308218 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Solución de Ringer lactato </td><td> Baxter Corporación </td><td> DIN # 0061085 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Saline - 0,9% de cloruro sódico </td><td> B-Braun Medical Inc. </td><td> DIN # 01924303 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Anestésicos por inhalación - El isoflurano USP </td><td> Pharmaceutical Partners Inc. de Canadá </td><td> DIN # 02237518 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr></tbody></table>

entrega génica eficaz en los territorios del snc múltiples utilizando in utero la electroporación

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

La capacidad de manipular la expresión génica es la piedra angular de la moderna embriología experimental, lo que lleva al esclarecimiento de múltiples vías de desarrollo. Varias tecnologías transgénicas potente y bien establecidas están disponibles para manipular los niveles de expresión de genes en el ratón, lo que permite la generación de los modelos de la pérdida y ganancia de función. Sin embargo, la generación de ratones transgénicos resulta costoso y el tiempo. Métodos alternativos de la manipulación genética han sido ampliamente tratado por lo tanto. En el útero de la electroporación es un método de entrega de genes en ratones vivos 1,2 embriones que se han adaptado con éxito 3,4. Se basa principalmente en el éxito de las tecnologías de la electroporación in ovo que se utilizan comúnmente en chica 5. En pocas palabras, el ADN es inyectado en los ventrículos abierta del cerebro en desarrollo y la aplicación de una corriente eléctrica provoca la formación de poros transitorios en las membranas celulares, lo que permite la absorción de ADN en la célula. En nuestras manos, los embriones pueden ser eficientemente electroporated a partir del día embrionario (E) 11,5, mientras que la focalización de los embriones más jóvenes que requieren una guiada por ultrasonido protocolo microinyección, como se describió anteriormente 6. Por el contrario, E15.5 es la última etapa que puede electroporar, debido a la aparición de los parietales y la diferenciación de hueso frontal, lo que dificulta la microinyección en el cerebro. Por el contrario, la retina se puede acceder a través del final de la embriogénesis. Los embriones se pueden recoger en cualquier punto durante todo el período postnatal embrionario o temprano. La inyección de un reportero construir facilita la identificación de las células transfectadas. Hasta la fecha, en la electroporación in utero ha sido más utilizado para el análisis del desarrollo neocortical 1,2,3,4. Los estudios más recientes se han centrado en el embrión de la retina y el tálamo 7,8,9 10,11,12. A continuación, presentamos una modificación en el protocolo de electroporación in utero que puede ser fácilmente adaptada a los diferentes dominios de destino del sistema nervioso central embrionario. Aportar pruebas de que mediante el uso de esta técnica, podemos apuntar el telencéfalo diencéfalo embrionario, y la retina. Los resultados representativos se presentan, en primer lugar que muestra el uso de esta técnica para introducir las construcciones de expresión de ADN en los ventrículos laterales, lo que nos permite controlar la maduración progenitor, diferenciación y migración en el telencéfalo embrionario. También muestran que esta técnica puede ser utilizada para combatir el ADN de los territorios que rodean el ventrículo diencefálico 3 º, lo que permite las rutas migratorias de diferenciar las neuronas en los núcleos diencefálicos a ser monitoreados. Por último, se muestra que el uso de micromanipuladores nos permite introducir con precisión construcciones de ADN en las áreas objetivo pequeño, como el espacio subretiniano, lo que nos permite analizar los efectos de la manipulación de la expresión de genes en el desarrollo de la retina.

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

La capacidad de manipular la expresión génica es la piedra angular de la embriología experimental actual, lo que ha permitido la elucidación de múltiples procesos del desarrollo...

El objetivo general de este procedimiento es alterar la expresión génica en las neuronas del sistema nervioso central embrionario. Esto se logra primero obteniendo hembras preñadas sincronizadas y preparándolas para la cirugía. A continuación, se exponen los cuernos uterinos mediante una incisión abdominal.Una vez expuestos los embriones, se inyecta ADN en el ventrículo lateral, el tercer ventrículo o el espacio subretiniano. El paso final del procedimiento consiste en aplicar una corriente eléctrica al embrión a través de la pared uterina, orientando los electrodos de paleta de manera que el polo positivo se coloque sobre el sitio preferido de transfección. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la proliferación, migración y diferenciación de los progenitores neuronales en el cerebro en desarrollo y la retina mediante microscopía de inmunofluorescencia.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la degeneración de ratones transgénicos, es que es rápida, permite estudios de mayor rendimiento y tiene un costo más bajo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo neural, como qué genes regulan al progenitor

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Investigación

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Neurociencia

Un método de transferencia de genes en el cerebro del ratón en desarrollo se describe mediante el uso de un método único quirúrgica y la forma especial de los electrodos. Esta técnica única permite la transfección de ADN de plásmido temporal y espacialmente, lo que ayudará a muchos neurocientíficos en el estudio de desarrollo del cerebro.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

Este estudio describe el desarrollo de...

En electroporación in vitro del labio inferior rómbico mitad de la gestación de embriones de ratón

El control de la expansión de células madre somáticas es un factor importante que impide su estudio y uso en terapia. Aquí se describe un sistema para controlar temporalmente madre neural expansión células durante el desarrollo y la edad adulta, que se puede utilizar para aumentar el número de neuronas generadas en el cerebro de ratón.

La expansión de las células madre embrionarias y adultas neurales por<em&gt; In Utero</em&gt; La electroporación o inyección estereotáxica Viral

Este video demuestra la entrega de ADN plasmídico en células neuronales cerebelosas de embriones murinos utilizando electroporación en el útero. Este método es útil para comprender la función in vivo de los genes en el desarrollo normal del cerebro y los cambios en la expresión génica de las células neuronales durante la progresión tumoral.

Entrega de genes basada en electroporación en el útero: una técnica para inyectar ADN plasmídico en células cerebelosas embrionarias de embriones murinos

A pesar de la importancia clínica y funcional del...

La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

La superficie pial es una zona de progenitor único en el sistema nervioso central que está recibiendo cada vez más atención. En esto, detallamos un método para la manipulación genética rápida de esta zona progenitor utilizando un método de electroporación modificado. Este procedimiento se puede utilizar para investigaciones celulares y moleculares de los linajes de células y vías de señalización implicadas en la diferenciación celular y para dilucidar el destino y las propiedades de las...

Neonatal electroporación superficie pial

Este protocolo describe en detalle cómo transfectar específicamente diferentes regiones en el sistema nervioso central C57BL/6 a través de la electroporación en el útero. En este protocolo se incluyen instrucciones detalladas para las transfecciones de regiones que se desarrollan en la corteza, el hipocampo, el tálamo, el hipotálamo, el núcleo septal lateral y el cuerpo estriado.

Específica Striatum Cortex, hipocampo, Thalamus-, hipotálamo, núcleo-septal lateral y<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporación en el ratón C57BL / 6

Se describe un método novedoso para la entrega de plásmido de DNA en las células uroteliales del ratón vejiga en vivo a través de la cateterización de la uretra y electroporación. Ofrece una manera rápida y conveniente para la generación de modelos de ratón autóctonas de enfermedades de la vejiga.

Novedoso método de plásmido ADN entrega al urotelio de la vejiga de ratón por electroporación

La electroporación doble en el útero permite apuntar a las poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Esta técnica es útil para visualizar las interacciones entre las poblaciones celulares que utilizan proteínas fluorescentes en condiciones normales, pero también después de experimentos funcionales para perturbar los genes de interés.

Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

En este protocolo, describimos cómo inyectar lentivirus la cavidad amniótica del ratón en E7.5, lo que lleva a una transducción uniforme de toda la placa neural, con efectos perjudiciales mínimos sobre la supervivencia o el desarrollo embrionario.

Focalización de la placa neural murina mediante nanoinyección in utero (NEPTUNE) en el día embrionario 7.5

Aprende la electroporación in utero para la entrega génica en el sistema nervioso central embrionario. Este método permite estudiar la función de genes durante el desarrollo neural en ratón.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

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