Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

El objetivo general de este procedimiento es alterar la expresión génica en el sistema nervioso central embrionario de la neurona. Esto se logra obteniendo primero hembras preñadas cronometradas y preparándolas para la cirugía. A continuación, se exponen los cuernos uterinos mediante la generación de una incisión abdominal.

Una vez que los embriones están expuestos, el ADN se inyecta en el ventrículo lateral, el tercer ventrículo o el espacio subretiniano. El paso final del procedimiento es aplicar una corriente eléctrica al embrión a través de la pared uterina, orientando los electrodos de paleta de manera que el polo positivo se coloque sobre el sitio preferido de transfección. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la proliferación, migración y diferenciación de neuroprogenitores en el kelon tline kelon moribundo y la retina mediante microscopía de inmunofluorescencia.

La principal ventaja de esta técnica o de los métodos existentes, como la degeneración de ratones transgénicos, es que es rápida, permite estudios de mayor rendimiento y tiene un menor costo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo neuronal, como qué genes regulan el progenitor neuronal, la proliferación celular, la especificación del destino celular, la diferenciación neuronal y la migración celular. Las implicaciones de esta técnica pueden extenderse hacia una mejor comprensión de las vías genéticas que subrayan los defectos en el desarrollo del SNC, muchos de los cuales resultan en deterioro cognitivo y son trastornos del comportamiento en humanos.

Esta técnica también se puede aplicar a otros sistemas de órganos, como el sistema nervioso periférico en desarrollo, el corazón y la placenta. También se puede aplicar para estudiar modelos de enfermedades en ratones, así como otros organismos modelo como el pollito y el xip. En general, el principal obstáculo para el éxito de las personas nuevas en esta técnica es la supervivencia del embrión. Se debe tener cuidado con la supervivencia al manipular, inyectar y estudiar detenidamente los embriones.

La idea de este método fue cuando necesitábamos un medio rápido para manipular la expresión génica en el embrión, el telencéfalo y la retina. Desarrollamos esta técnica en nuestro laboratorio modificando la técnica inicialmente descrita por Sal, publicada en la revista Developmental Biology en 2001. También trabajamos con un laboratorio intensivo para establecer este protocolo en el melón en desarrollo.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de inyección y electroporación son difíciles de aprender porque requieren una manipulación muy cuidadosa de los embriones y los sitios de inyección a veces pueden ser muy pequeños. Ejemplo, el espacio subretiniano Demostrando el procedimiento hoy estará Rajiv, un postdoc del Laboratorio de Sherman Para comenzar a limpiar y esterilizar todas las herramientas quirúrgicas. A continuación, llene las jeringas con solución salina y solución de ringer lactato y colóquelas sobre una almohadilla térmica para calentar el área quirúrgica.

Esterilice una almohadilla térmica con etanol al 70% y luego cúbrala con una almohadilla de gasa esterilizada sin cojera. Ajuste la almohadilla térmica a 37 grados centígrados. Colocar al animal en una pequeña cámara anestésica y anestesiarlo suministrando un 5% de flúor con oxígeno a un litro por minuto a través de un vaporizador.

Asegúrese de recoger los gases de escape de flúor mediante un sistema de barrido. Una vez que la respiración del animal sea profunda y regular, retírelo de la cámara. Usa los reflejos de pellizcar los dedos de los pies y parpadear.

Para asegurar la anestesia completa. Coloque al animal anestesiado sobre su vientre y use un tubo de respiración para administrar 2.25% de hielo de flúor durante la cirugía. Inyecte buprenorfina a una concentración de 0,1 miligramos por kilogramo de peso corporal por vía subcutánea en la nuca.

Continúe monitoreando la respiración del animal y ajuste el flujo de flúor si es necesario. A continuación, coloque cinta adhesiva en el pecho del animal anestesiado y compruebe de nuevo si hay una respuesta de retracción pellizcando la pata trasera con pinzas romas. Con un hisopo de algodón estéril, extienda una capa gruesa de crema sobre el abdomen asegurándose de que el pelaje inferior esté completamente cubierto.

Deje actuar la crema durante aproximadamente tres minutos y revise de forma intermitente la depilación. Con un hisopo estéril, humedezca una gasa estéril con agua estéril y limpie el cabello del abdomen. A continuación, esterilice el sitio de la incisión con clorhexidina y más agua.

Seque el abdomen con una gasa limpia y estéril. Repita este paso con etanol al 70% utilizando una gasa de algodón esterilizada fresca. Prepárese para la cirugía poniéndose un atuendo quirúrgico para exponer los cuernos uterinos.

Primero, ubique el alba lineal como la línea tenue debajo de la piel en la línea media Con pinzas, separe la piel de la pared abdominal y corte una pequeña incisión recta desde la mitad del abdomen hacia abajo con tijeras para la piel con pinzas y tijeras curvas. Repite el proceso con el peritoneo. Agarre el peritoneo con las pinzas.

Aparta y luego haz una incisión lo suficientemente grande como para atravesar el útero. Coloque una gasa estéril con una pequeña hendidura vertical sobre la incisión y humedézcala con solución salina estéril tibia. A continuación, deslice las pinzas en la incisión y ubique el útero que mantiene la incisión abierta con las pinzas.

Agarre el útero entre el primer y el segundo embrión visible y tire de ambos lados de los cuernos uterinos sobre la gasa. Cuente el número de embriones, anotando cualquier reabsorción o embriones con un tamaño corporal pequeño. Para preparar el número correcto de inyecciones de ADN, humedezca los cuernos uterinos con solución salina y vuelva a colocar cuidadosamente un cuerno uterino en el abdomen.

Para aborrecer las agujas quirúrgicas, use una pipeta pasada con una boquilla adjunta para extraer 10 microlitros de tres miligramos por mililitro. Solución de ADN libre de endotoxinas que contiene verde de metilo, colorante y expulsa el ADN en una aguja quirúrgica. Monte la primera aguja llena en el micromanipulador.

Colóquese conectado al inyector comenzando por el embrión más cercano al ovario. Use pinzas circulares para girar suavemente el embrión dentro de la decidua de modo que se coloque boca adelante, permitiendo que las inyecciones ocurran en un rollo de ROS en la dirección cordal. Uso de una fuente de luz de fibra óptica para identificar la línea media del cerebro embrionario.

Obsérvense los ventrículos laterales grandes flanqueados en las regiones rostrales. Sostenga el embrión en su lugar con pinzas curvas y coloque la aguja quirúrgica llena sobre el útero de manera que el ángulo de entrada al cerebro sea de aproximadamente 45 grados. Con un movimiento rápido y constante, gire el dial del micromanipulador para insertar la punta de la aguja a través de la pared del útero y en el ventrículo lateral del cerebro embrionario.

A continuación, presione la almohadilla del pie del microinyector. Para inyectar la solución de ADN, una inyección exitosa se visualiza fácilmente mediante la difusión del tinte verde de metilo a través de los ventrículos cerebrales embrionarios. Ahora que se ha inyectado el ADN, vuelva a subir lentamente la aguja para extraerlo sin que se rompa.

Colocar el embrión inyectado sobre la gasa estéril y humedecerlo bien con solución salina tibia. Agarre el útero con el polo positivo del electrodo de paleta colocado sobre el sitio deseado de transfección. A continuación, suministre cinco pulsos eléctricos cuadrados de 40 a 50 voltios y 50 milisegundos a una velocidad de un pulso por segundo.

Cubra el embrión inyectado y electro con una gasa húmeda protectora, y luego continúe inyectando el siguiente embrión. Una vez finalizada la inyección y la electro perización de todos los embriones deseados en el asta uterina, empújelos cuidadosamente hacia la cavidad corporal. Extraer el segundo cuerno uterino para comenzar la inyección y electroporación de los embriones restantes.

Una vez que todos los embriones estén de vuelta dentro del útero, agregue de dos a tres mililitros de solución salina tibia a la cavidad abdominal y luego retire la gasa del abdomen para revelar los lados del peritoneo. Utilice una línea de seda trenzada negra para suturar el peritoneo anclando la línea en el peritoneo más cercano al esternón y procediendo a coser lejos del ancla. Asegúrese de que todas las suturas estén ajustadas y de que no se cosan órganos subyacentes o piel en el peritoneo.

Corta la línea de sutura restante y deséchala. Tire de la piel para cerrarla sobre la línea de sutura con pinzas usando grapas de cierre de la piel. Sujete la piel teniendo cuidado de no grapar la línea de sutura por debajo o de tensar demasiado la piel.

Una vez terminado, asegúrese de que las grapas estén apretadas presionando suavemente con la herramienta de sutura aquí, A-P-C-I-G dos vectores de expresión que impulsan la expresión de GFP se han electroporado en el neocórtex en desarrollo en E 12. A medida que avanza el desarrollo neocortical, los progenitores apicales se diferencian en progenitores basales secundarios o neuronas postmitóticas y continúan expresando GFP. A continuación, se pueden analizar estas células neuronales para determinar la expresión de marcadores típicos del subtipo neuronal que se muestra en rojo.

En esta vista venal de un prosencéfalo de un embrión electroporado en E 12 y diseccionado en E 14, el sitio electroporado está indicado por la epifluorescencia verde de E 14. La expresión de GFP se observa en el tálamo, el pretálamo y el hipotálamo, lo que indica que los territorios de lílico moribundos se han transfectado con éxito. El cuadro de instrumentos marca la ubicación de la sección a través de una zona ventricular.

Una mirada más cercana a la zona ventricular muestra la migración de las células GFP fuera de la zona ventricular hacia la zona del manto. Donde se formarán los núcleos hipotalámicos, la retina embrionaria también se electropora fácilmente, como se muestra en esta sección coronal, a través de un E 16.5 I electroporado con PCIC en E 15.5. En este caso, la acumulación de células m cherry positivas es específica de la capa externa de neuroblastos y no se observa en las células ganglionares B positivas de la retina una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos si no surgen complicaciones inesperadas.

Al intentar este procedimiento, es importante utilizar técnicas estériles adecuadas, una mano firme al manipular los embriones y tener todos los materiales necesarios listos antes de poner a la hembra embarazada bajo anestesia. Siguiendo este procedimiento, se puede permitir que los embriones electrotrenzados vivan hasta la edad adulta, momento en el que se pueden realizar otros métodos como ensayos conductuales y funcionales para responder preguntas adicionales sobre cómo la manipulación de ciertos genes en el embrión afecta la función neuronal en el adulto. Desde su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo del SNC exploren la función génica in vivo en ratones.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo introducir ADN extraño en el tubo neural embrionario. En concreto, te mostramos cómo preparar a una mujer embarazada para la cirugía. Exponer el útero, inyectar ADN y electrolizar el embrión.

No olvide que trabajar con flúor puede ser peligroso, y se deben tomar precauciones como un sistema de barrido al realizar este procedimiento.