El aislamiento de islotes humanos de pacientes parcialmente Pancreatectomized

Hola, soy Florian Al, del Departamento de Cirugía de la Universidad Técnica de Triton. Hola, soy Gregor Cher, también del Departamento de Cirugía del Hospital Universitario. En Grayston.

La investigación sobre la biología y la función de los párpados se necesita desesperadamente para avanzar en nuestra comprensión de la fisiología de los párpados y la patogénesis de la diabetes. Desafortunadamente, los párpados humanos de pacientes no diabéticos y diabéticos tipo dos son muy difíciles de obtener. La siguiente secuencia de video le mostrará un protocolo sobre cómo aislar párpados humanos de pacientes con optimización pancreática parcial.

Los ojales así adquiridos pueden funcionar como un sistema in vitro para el análisis funcional. La resección quirúrgica del tejido pancreático humano es la condición previa para el aislamiento de los ojales humanos. Contamos con pacientes sometidos a una resección parcial del páncreas por patologías pancreáticas específicas.

Como fuente de tejido pancreático humano, el cirujano corta el páncreas y realiza la resección parcial. Después, los pescadores pancreáticos se colocan en hielo y se llevan al Departamento de Patología. El patólogo determina la cantidad de tejido pancreático blando y de apariencia saludable que se debe obtener.

Para el aislamiento de los párpados, se requieren al menos dos gramos de tejido pancreático para el aislamiento. El tejido se coloca en una solución de ucon y se transporta en hielo al laboratorio. El primer paso en el aislamiento de párpados es medir el peso del tejido pancreático.

A continuación, la muestra se coloca en un plato de 10 centímetros. Ya hemos preparado un matraz de 500 mililitros con 150 mililitros de medios RPMI y 1 matraz de 250 mililitros con 130 mililitros de medios RPMI. A continuación, añadimos la solución de enzimas de digestión que contiene un mililitro de ADN y 20 mililitros de colagenasa al matraz de 250 mililitros y lo introducimos en una jeringa de 10 mililitros.

A continuación, el tejido pancreático limpio se distiende mediante la inyección del medio que contiene la enzima y se pica en trozos pequeños para aumentar la superficie y facilitar el proceso de digestión. Este paso de picado es crucial porque la distensión por inyección sola no permite una distribución adecuada de la enzima dentro del tejido. Paralelamente, montamos el circuito de digestión.

Como se muestra en esta figura, la dirección del flujo en la cámara registrada es hacia adentro en la parte inferior y hacia afuera en la parte superior de la cámara. A continuación, estamos en el medio que contiene la enzima restante en el matraz de 500 mililitros hasta un volumen de 300 mililitros, y luego insertamos el termómetro. La cámara registrada contiene una malla metálica con un diámetro pobre de 600 micrómetros y canicas de nitruro de silicona libre con un diámetro de 15 milímetros cada una.

Transferimos el tejido pancreático a la cámara, insertamos la malla, cerramos la cámara y ponemos en marcha la bomba a una velocidad de 140 mililitros por minuto. Una vez que la temperatura del circuito alcanza los 37 grados centígrados, comenzamos a medir el tiempo de digestión. La cámara grabada se agita a mano de acuerdo con la composición del tejido.

Para determinar el momento óptimo para detener la digestión, tomamos muestras periódicas, tinciones de tisona, los ojales separados de color rojo bajo el microscopio. Una vez que los ojales parecen estar separados del tejido aino, detuvimos rápidamente la digestión colocando el serpentín de calentamiento en hielo y agregando 200 mililitros de medios de lavado en frío al circuito. A continuación, recogemos la solución palpebral introduciendo el tubo de muestra en halcones de 250 mililitros hasta que el circuito quede vacío.

El siguiente procedimiento de lavado comienza con el paso de centrifugación de 1000 RPM a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. En el siguiente paso, descartamos la solución de párpados en medios de lavado y la distribuimos en fracciones iguales a los halcones de 50 mililitros. El lavado continúa con otro paso de centrifugación de 1000 RPM a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Como paso opcional, distribuimos la paleta en halcones adicionales más allá de los cuatro originales, dependiendo del tamaño de la paleta. Con el fin de mejorar el lavado, nuevamente, desechamos el supper natante y aflojamos suavemente el paladar para separar el párpado del tejido anaico. Las diferentes densidades de tejido de las dos partes permiten la aplicación de un gradiente fecal.

En primer lugar, resuspendemos el pellet en heces de densidad media 1,1 de 25 gramos por mililitro. El pellet debe ser lo suficientemente pequeño como para permitir una resuspensión homogénea. A continuación, superponemos lentamente esto con las densidades de medios fecales 1.0 81.0 60 y 1.0 37 con un volumen de 10 mililitros cada una.

A continuación, centrifugamos los gradientes a 2.400 rpm durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Ahora puedes distinguir los diferentes componentes separados por sus densidades en las fracciones. En primer lugar, descartamos la capa superior formada por la grasa y el tejido conectivo.

La fracción que ahora recogemos es la primera capa de agregado palpebral a 1,037 y 1,06, que contiene principalmente los ojales aislados. Para un aislamiento eficiente, es importante recolectar las fracciones por separado. A continuación, recogemos la fracción del segundo agregado palpebral en la interfaz de 1,0 60 y 1,0 80, que contiene ojales menos puros que la primera capa.

A continuación, añadimos el medio de lavado a un volumen total de 50 mililitros para diluir el gradiente fecal y lo enviamos a FUT a 1000 RPM durante cinco minutos. A cuatro grados centígrados, desechamos el agente SUP por succión porque el paladar podría estar muy suelto debido a la mancha de frío. Así, tenemos que repetir el paso de lavado con medios de cultivo de párpados a 1000 RPM durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

En el último paso, resuspendemos los ojales humanos y la cultura, los medios y la cultura. Los ojales recolectados en la incubadora a 37 grados centígrados durante 24 a 48 horas. Después de este paso de cultivo, los párpados están listos para su posterior procesamiento.

Este protocolo debería permitirle aislar los párpados humanos del tejido pancreático después de una pancreatectomía parcial. El transporte rápido y fresco de los pescadores pancreáticos a la instalación de aislamiento de párpados es importante para preservar la mejor viabilidad celular. El equipo de aislamiento debe tener en cuenta que el proceso de digestión es un procedimiento muy dinámico.

La duración del proceso de digestión depende en gran medida de la composición del tejido. Por ejemplo, el grado de fibrosis y la capacidad de inyección de enzimas suficientes en el tejido pancreático. El ajuste individual de la fuerza mecánica dentro de la cámara registrada y la duración del proceso de digestión es crucial para un buen rendimiento de los párpados.