Name: El aislamiento de islotes humanos de pacientes parcialmente Pancreatectomized (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprenda a aislar islotes pancreáticos humanos de pacientes sometidos a pancreatectomía parcial. Este protocolo utiliza digestión enzimática y gradientes de densidad para obtener islotes viables para estudios funcionales de diabetes.

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Queremos agradecer a nuestros colegas de muchos de los que siempre ayuda, consejo y aporte fundamental en las distintas etapas del proyecto. La producción de este artículo contó con el apoyo de vídeo, con fondos del Ministerio Alemán de Educación e Investigación (BMBF) para el Centro Alemán de Investigación de la Diabetes (DZD, <a href="http://www.dzd-ev.de">http://www.dzd-ev.de</a> ), IMIDIA ( <a href="http://www.imidia.org">http://www . imidia.org</a> ) y el Hospital Universitario Carl Gustav Carus en la Universidad de Tecnología de Dresde. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del Programa de la Comunidad Europea Séptimo Programa Marco (FP7/2007-2013) para la Iniciativa de Medicamentos Innovadores en el acuerdo de subvención n ° 115005.

1. La colección de tejidos del páncreas en la sala de operaciones <ol><li> El cirujano realiza una resección parcial del páncreas. </li><li> Después de colocar la muestra de páncreas en una caja de hielo, de presentar inmediatamente al patólogo. </li></ol> 2. Selección del tejido para el aislamiento de islotes <ol><li> El patólogo selecciona tejido que parece suave y saludable, manteniendo el tejido dañado con fines de diagnóstico. Tejido fibrótico y las muestras que ofrecen menos de 2 g de tejido útil están excluidos de aislamiento de islotes. </li><li> Sumergir el tejido pancreático en euros solución Collins y entregar en hielo al laboratorio. </li></ol> 3. Aislamiento de islotes humanos <ol><li> Pese el tejido pancreático, a continuación, colóquelo en un plato de 10 cm. </li><li> Ponga 150 ml RPMI medios de comunicación en un frasco de 500 ml. </li><li> En un matraz de 250 ml, prepare la solución de enzimas digestivas mediante la combinación de 130 ml RPMI medios de comunicación con 100 mg / ml y 20 ml DNasa de RI Liberase 5mg/ml. Draw 10 ml de esta solución en una jeringa para inyectar el tejido pancreático. </li><li> Se inyecta la solución de enzimas digestivas en el tejido pancreático, con el objetivo de que se distienden homogénea. Si se trata de prevenir la fibrosis, la digestión es probable que no. A continuación, picar los tejidos en ~ 4 mm 3 piezas en el hielo. </li></ol> 4. Páncreas humano circuito de la digestión <ol><li> Montar el circuito de la digestión, como se muestra en la Figura 1. La dirección del flujo en la cámara de Ricordi se encuentra en la parte inferior y salida en la parte superior de la cámara. </li><li> Añadir la solución de enzimas digestivas restante en el matraz de 500 ml hasta un volumen total de 300 ml e insertar un termómetro. </li><li> Transferir el tejido pancreático en la cámara, inserte la malla (diámetro de poro: 600 m) y tres canicas de nitruro de silicio (diámetro: 15 mm), cerca de la cámara y encienda la bomba con el caudal fijado en 140 ml / min. </li><li> Cuando la temperatura del circuito llega a 37 ° C, iniciar el cronometraje y periódicamente toman muestras para determinar el momento de detener la digestión. Tinción con ditizona (2 mg / ml) permite la visualización microscópica de los islotes dentro del tejido digerido 4. </li><li> Una vez que los islotes están separados del tejido acinar alrededores, rápidamente detener la digestión mediante la colocación de la bobina de calentamiento sobre el hielo y añadir 200 ml de medio de lavado en frío (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) al circuito. </li><li> Recoger la solución de los islotes en 250 ml tubos cónicos como sale del tubo de muestra. Continúe hasta que el circuito está vacío. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. El circuito de la digestión humana páncreas El páncreas circuito de la digestión humana incluye una cámara de Ricordi que contiene la malla (diámetro de poro: 600 m) y tres bolas de nitruro de silicio (diámetro: 15 mm). Salida de la cámara es impulsada en el matraz de recogida de tejidos por la bomba peristáltica (140 ml / min). Las flechas indican la dirección del flujo. Una temperatura óptima para la digestión enzimática se mantiene mediante la inmersión de la bobina de calentamiento en un baño de agua a 37 ° C. 5. Lavado después de la digestión <ol><li> Centrífuga de 250 ml tubos cónicos que contengan la solución de los islotes a 1.000 rpm, 4 º C durante 5 min. </li><li> Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado de los islotes en los medios de comunicación de lavado (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) y distribuirlo en fracciones iguales a tubos de 50 ml cónicos. (Opcional:. Distribuir en tubos cónicos adicionales para mejorar el lavado) Se centrifuga a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min. </li><li> Desechar el sobrenadante y extraiga con cuidado pellets por agitación manual. </li></ol> 6. La purificación en un gradiente de Ficoll <ol><li> Resuspender el precipitado con Ficoll los medios de comunicación a una densidad de 1,125 g / ml, pH 7,4, y poco a poco superposición de alícuotas de 10 ml de Ficoll los medios de comunicación con una densidad de 1,080, 1,060 y 1,037 g / ml. </li><li> Centrifugar los gradientes de Ficoll a 2400 rpm, 4 º C durante 20 min. </li></ol> 7. Colección islote y Cultura <ol><li> Después de la centrifugación, los diferentes componentes del tejido se pueden distinguir por su repartición en el degradado. </li><li> Descartar la capa superior que consta de grasa y tejido conectivo. </li><li> Con cuidado, la cosecha de la primera capa de áridos islote en la 1.037-1.060 g / ml interfase. Esta capa contiene los islotes aislados más puro. Recoger las fracciones por separado para el aislamiento eficiente. </li><li> Recoger la fracción de segundo, menos puro de los agregados de los islotes en el 1.060-1.080 g / ml interfase. </li><li> Diluir el gradiente de Ficoll mediante la adición de medio de lavado (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) a cada tubo cónico hasta un volumen total de 50 ml. Centrifugar a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración. Tenga cuidado de que la pastilla esté suelto debido al gradiente de Ficoll. </li><li> Lave el wi pelletsª lavar los medios de comunicación (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) y se centrifuga a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min. Repita el uso de los medios de comunicación islote cultura </li><li> Resuspender los islotes en los medios de cultivo y colocarlos en la incubadora con 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24-48 horas antes de su posterior procesamiento. </li></ol>

<ol><li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes%3A+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li>
<li>Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+abnormalities+in+the+islets+isolated+from+type+2+diabetic+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.</a> Diabetes. 53, 624-632 (2004).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37, 413-420 (1988).</li>
<li>Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45, 827-830 (1988).</li>
<li>Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., Jäger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+turnover+in+islets+from+type+2+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients.</a> Islets. 2, 30-36 (2010).</li>
<li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pancreatic+diabetes+%28type+3c+diabetes%29+underdiagnosed+and+misdiagnosed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?</a> Diabetes Care. 31, Suppl 2. S165-S169 (2008).</li>
<li>Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders+and+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders and diabetes mellitus.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, Suppl 1. S7-S12 (2008).</li>
<li>Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+type+I+diabetes+in+first-degree+relatives+using+a+combination+of+insulin%2C+GAD%2C+and+ICA512bdc%2FIA-2+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies.</a> Diabetes. 45, 926-933 (1996).</li>
<li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition%2C+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1%3A+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li>
<li>Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+of+Purified+%7Bbeta%7D-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Utilizando el protocolo, los islotes se pueden aislar a partir de tejido pancreático recogidos de una pancreatectomía parcial. El éxito de este protocolo se basa en el cuidado durante un pocos puntos críticos. Para preservar la viabilidad de las células beta, es esencial que la muestra se transporta rápidamente en hielo al laboratorio. Además, la duración de la digestión de los tejidos deben ser optimizados empíricamente de acuerdo con el grado de fibrosis del tejido y la actividad enzimática de los medios de comunicación. Esto también es válido para el grado de fuerza mecánica aplicada manualmente a la cámara de Ricordi. Así, para obtener un rendimiento islote bien, el protocolo se realiza mejor por un científico dedicado o asistente técnico. El fracaso inicial de la norma es menos que el equipo ya tiene experiencia en el aislamiento de los islotes. Hay diferencias fundamentales entre el protocolo de aislamiento de islotes y el método estándar de aislamiento de islotes humanos: 1) A pesar de que el uso de tejido pancreático sometido a varias horas de isquemia durante el procedimiento quirúrgico, éstos son procesados ​​inmediatamente en el sitio. Esto está en contraste con páncreas explantados de donantes con muerte cerebral para el trasplante de páncreas / islote, que siguen siendo isquémica por varias horas durante la asignación y entrega a la instalación de aislamiento de islotes. 2) Se inyecta colagenasa directamente en el tejido pancreático, mientras que el protocolo estándar para infundir en el conducto pancreático. 3) Se separan los islotes mediante un gradiente de Ficoll discontinuo en vez de recoger los islotes a partir de un gradiente de Ficoll continua usando un procesador celular COBE. En los casos en que la pieza quirúrgica es demasiado fibroso o escasos para el aislamiento de un número suficiente de islotes, el tejido todavía pueden ser recuperados por microdisección de captura láser (LCM) 10. Esto permite que los datos de expresión genética para recuperarse de prácticamente todas las muestras, aunque el aislamiento de islotes falla o el rendimiento es muy bajo. Desafortunadamente, la LCM no produce las células vivas para estudios funcionales y su cantidad suele ser insuficiente para el análisis proteómico. Por lo tanto, con LCM en paralelo con nuestro protocolo de digestión con colagenasa para recuperar los islotes puede ser la forma más eficaz de procesar las muestras quirúrgicas. En la recogida de tejidos para el aislamiento de los islotes de pancreatectomías parcial, es importante examinar cuidadosamente la historia clínica del paciente y su estado metabólico. Un paciente parcialmente pancreatectomized podrían verse afectados por diabetes tipo 3c, es decir, diabetes secundarias a la enfermedad del páncreas que conduce a la cirugía 6. De los 43 pacientes participantes que se sometieron a esta cirugía en nuestro departamento en el 2010, 32 eran no diabéticos, 5 fueron afectados por diabetes tipo 2 y 6 tenían diabetes tipo 3c. Estos datos concuerdan con estudios anteriores que señalaban que el metabolismo de la glucosa y diabetes en una fracción considerable de pacientes que sufren de cáncer de páncreas o pancreatitis crónica 6. Hemos considerado la diabetes de origen primario, si se le diagnosticó al menos un año antes de la aparición de los síntomas que conducen a la cirugía pancreática 7. Los niveles de anticuerpos contra los islotes autoantígenos también debe medirse para evaluar la posibilidad de un origen autoinmune de la diabetes 8. Debido a que un paciente sometido a pancreatectomía podría sufrir de diabetes no diagnosticada o ser intolerantes a la glucosa, los pacientes no diabéticos, se debe dar una prueba de sobrecarga oral de glucosa antes de la pancreatectomía 9.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><th> Equipo </th><th></th><th></th></tr><tr><td> 1 ml serológicas pipeta (CellStar) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 604181 </td></tr><tr><td> 10 ml serológicas pipeta (CellStar) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 607180 </td></tr><tr><td> 25 ml serológicas pipeta (CellStar) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 760180 </td></tr><tr><td> 10 ml jeringa </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300912 </td></tr><tr><td> 50 ml jeringa </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> 5 ml jeringa </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 309050 </td></tr><tr><td> 18 G 1,1 / 2 Aguja Microlance 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 304622 </td></tr><tr><td> 27 GX1 / 2 agujas </td><td> Braun </td><td> 4658300 </td></tr><tr><td> 27 GX3 / 4 agujas Microlance 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 302200 </td></tr><tr><td> 3 cm de células cultura plato de 2x2 mm rejilla </td><td> Nunc </td><td> 174926 </td></tr><tr><td> 20 cm de tejido cultura plato </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 6 cm de agarre fácil una caja de petri </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 351016 </td></tr><tr><td> 150 ml botella de almacenamiento </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431175 </td></tr><tr><td> 250 ml Erlenmeyer </td><td> Schott Duran </td><td> 21 217 36 </td></tr><tr><td> 500 ml Erlenmeyer </td><td> Schott Duran </td><td> 21 217 44 </td></tr><tr><td> 250 ml de tornillo tapa inferior del tubo cónico de centrífuga </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Falcon de 50 ml cónica del tubo </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> 260 ml Easyflask no tratados </td><td> Nunc </td><td> 156800 </td></tr><tr><td> Millex GV filtro Unidad Duropore (0,22 m) </td><td> Millipore </td><td> SLGV033RB </td></tr><tr><td> Para botellas de vacío del filtro (PES 70 mm de diámetro Membranas, 0,22 m de tamaño de los poros, 45 mm de tamaño del cuello, 500 ml de volumen) </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431118 </td></tr><tr><td> Densitómetro (Densito 30PX) LWE37463 </td><td> Mettler Toledo </td><td> 51324450 </td></tr><tr><td> Unidad de filtro rápido PES 0,2 micras </td><td> Nalgene </td><td> 569-0020 </td></tr><tr><td> Calentamiento de la bobina </td><td> Biorep Technologies Inc </td><td> HC-02 </td></tr><tr><td> Multifuge 4 KS-R </td><td> Heraeus </td><td> 75015680 </td></tr><tr><td> Tipo de bomba PD5206 </td><td> Heidolph </td><td> 523-52060-00-2 </td></tr><tr><td> Ricordi cámara (malla de metal con un diámetro de 600 micras de poro) </td><td> Biorep Technologies Inc. </td><td> Modelo 50-U-01, serie 0503-001 </td></tr><tr><td> Preparación de soporte </td><td> Biorep Technologies Inc. </td><td> 50-PS-01 </td></tr><tr><td> O-Rings </td><td> Biorep Technologies Inc. </td><td> O-50-U-01 </td></tr><tr><td> Nitruro de silicio Mármoles (15 mm conjunto de 9) </td><td> Biorep Technologies Inc. </td><td> SN-01 </td></tr><tr><td> Tubos de silicona </td><td> Tygon </td><td> R 3603 8,0 X4, 0 mm </td></tr><tr><td> Fórceps quirúrgicos </td><td> Braun </td><td> BD168R </td></tr><tr><td> Tijeras quirúrgicas (Aesculap) </td><td> Braun </td><td> BC273R </td></tr><tr><td> Baño de agua MCO 200 </td><td> Conceder </td><td> MCO 200 </td></tr><tr><th> Reactivos </th><th></th><th></th></tr><tr><td> Colagenasa -&gt; Liberase RI (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 11815032001 </td></tr><tr><td> D (+)-glucosa </td><td> Merck </td><td> 1.08337.1000 </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido (DMSO) </td><td> Merck </td><td> 1.16743.1000 </td></tr><tr><td> Diphenylthiocarbazone (DTZ) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5130 </td></tr><tr><td> DNasa I (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Dulbeccos 1XPBS </td><td> PAA Laboratories </td><td> H15-002 </td></tr><tr><td> Electrolytsolution E154 </td><td> Serumwerk </td><td> 00509 </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino (FBS) </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> Ficoll 400 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F9378 </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td></tr><tr><td> 2 - (4 - (2-hidroxietil) - 1-piperazinil)-ethansulfons ‰ Ure (HEPES) </td><td> Roth </td><td> 9105.3 </td></tr><tr><td> NaOH, 5 M </td><td> farmacia clínica, hospital </td><td> - </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina (100 veces) </td><td> PAA Laboratories </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> Pipettaid (EXPRESS) </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 357591 </td></tr><tr><td> Potassiumchlorid </td><td> Fluka </td><td> 60132 </td></tr><tr><td> Potassiumdihydrogenphospate anhidro </td><td> JT Baker </td><td> 0241 </td></tr><tr><td> Potassiummonohydrogenphosphate </td><td> JT Baker </td><td> 3246-01 </td></tr><tr><td> Medio RPMI 1640 [-] D-glucosa [+] L-Glutamina </td><td> Gibco </td><td> 11879-020 </td></tr><tr><td> Medio RPMI 1640 [+] L-Glutamina </td><td> PAA Laboratories </td><td> E15-840 </td></tr><tr><td> Sodiumhydrogencarbonat </td><td> Merck </td><td> 1.06329.0500 </td></tr></tbody></table> Los medios de comunicación y soluciones Solución de ditizona <ul><li> Disolver 100 mg de DTZ en 10 ml de DMSO y se diluye en 40 ml de PBS </li><li> Filtro estéril de la solución (0,22 m) </li></ul> Solución de enzima <ul><li> Se disuelven 100 mg de RI Liberase en 20 ml de medio RPMI 1640 (sin extras) </li><li> Disolver 100 mg en 1 ml de DNasa medio RPMI 1640 (sin extras) </li><li> Filtro estéril de la solución (0,22 m) y mantener la enzima en el hielo </li></ul> Lavar los medios de comunicación (1000ml/5.5mM glucosa) <ul><li> Disolver 100 ml de FBS (inactivado por calor) </li><li> Añadir 450 ml de RPMI 1640 (no glucosa) </li><li> Añadir 450 ml de RPMI 1640 (11 mM de glucosa) </li><li> Filtro estéril de la solución (0,22 m) </li></ul> Islote medios de cultivo (500 ml / 5,5 mM glucosa) <ul><li> Disolver 10 ml de HEPES 1M (pH 7,4) </li><li> Añadir 50 ml de FBS </li><li> Añadir 5 ml de penicilina / estreptomicina (100 veces) </li><li> Añadir 2,75 ml de una solución de glucosa M </li><li> Añadir 432.25 ml RPMI 1640 (no glucosa) </li><li> Filtro estéril de la solución (0,22 m) </li></ul> Euro Collins Solución <ul><li> 4.083 g hidrogenofosfato de potasio </li><li> 70,0 g de glucosa </li><li> 2.237 g de cloruro de potasio </li><li> 14,80 g de potasio monohydrogenphosphate </li><li> 1.680 g de bicarbonato de sodio </li><li> 40 ml solución electrolítica (E 154) </li><li> pH 7,4 </li><li> Añadir agua destilada hasta 2000 ml </li><li> Filtro estéril de la solución (0,22 m) </li></ul> Ficoll solución de archivo <ul><li> Añadir 1,000 ml de solución de Euro Collins a 500 g Ficoll </li><li> Añadir 8,94 g HEPES </li><li> Agitación durante una noche hasta que se resuelve Ficoll </li><li> pH 7,4 </li><li> Medir la densidad </li></ul> Gradientes de Ficoll <ul><li> Calcular la cantidad de FBS, la solución Euro Collins y la solución de Ficoll de archivo de acuerdo a la densidad </li><li> Combine las 3 soluciones y medir la densidad con un densímetro </li><li> Añadir Euro Collins solución o la solución de Ficoll de archivo hasta que la densidad se ajusta </li><li> Filtro estéril de la solución (0,22 m) y se almacenan a 4 ° C </li></ul>

el aislamiento de islotes humanos de pacientes parcialmente pancreatectomized

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Las investigaciones sobre la patogénesis de la diabetes tipo 2 y los islotes de Langerhans un mal funcionamiento se han visto obstaculizadas por la limitada disponibilidad de islotes con diabetes tipo 2 de 2 donantes de órganos. Aquí compartimos nuestro protocolo para el aislamiento de islotes de tejido pancreático humano obtenido de diabetes tipo 2 y pacientes no diabéticos que han sido sometidos a pancreatectomía parcial debido a diferentes enfermedades pancreáticas (tumores benignos o malignos de páncreas, pancreatitis crónica, y el conducto biliar común o tumores duodenales) . Todos los pacientes involucrados dieron su consentimiento para este estudio, que también había sido aprobado por el comité de ética local. Los especímenes quirúrgicos fueron entregados inmediatamente al patólogo que seleccionaron suave y saludable del tejido pancreático que aparecen para el aislamiento de los islotes, conservando el tejido dañado con fines de diagnóstico. Hemos encontrado que aislar más de 1.000 islotes, que teníamos que empezar con al menos 2 g de tejido pancreático. También es esencial para nuestro protocolo fue visible para distender los tejidos cuando se inyectan los medios de comunicación que contienen enzimas y, posteriormente, pelos para facilitar la digestión, aumentando la superficie. Para ampliar la aplicabilidad de nuestro protocolo para incluir los casos ocasionales en los que una gran cantidad (&gt; 15 g) de tejido pancreático humano está disponible, se utilizó una cámara de Ricordi (50 ml) a digerir el tejido. Durante la digestión, que sacudió de forma manual de la cámara de Ricordi 3 con una intensidad que varía por el modelo de acuerdo a su nivel de fibrosis de los tejidos. Un gradiente de Ficoll discontinuo se utilizó para separar los islotes del tejido acinar. Hemos tomado nota de que el precipitado de tejido debe ser lo suficientemente pequeño como para ser homogénea resuspendieron en medio Ficoll con una densidad de 1,125 g / ml. Tras el aislamiento, que cultivan los islotes en condiciones de estrés (sin agitación o rotación) con 5% de CO 2 a 37 ° C durante al menos 48 h con el fin de facilitar su recuperación funcional. La aplicación generalizada de nuestro protocolo y sus mejoras en el futuro podría permitir la recolección oportuna de grandes cantidades de islotes humanos de la diabetes y la clínica con sujetos no diabéticos, en gran medida el avance de investigación de tipo 2 diabetes.

Nuestro protocolo se obtuvo un promedio de ~ 500 islotes por gramo de tejido pancreático, aunque este muy variado entre los preparados debido en gran parte a diferencias en la fibrosis y la actividad de la colagenasa. Hemos conseguido&gt; 90% de pureza islote mediante tinción primero con ditizona durante el procesamiento de tejidos, y luego eligiendo a dedo 24 horas después de su aislamiento. Para determinar la calidad de los islotes purificados, la prueba de 25 mM de glucosa estimulada por la secreción de insulina en condiciones estáticas durante 2 horas. Hemos encontrado la secreción de insulina comparable a la de islotes obtenidos de ECIT aislamiento de islotes y los centros de trasplante. Como islotes aislados de páncreas parcialmente pancreatectomized no son para el trasplante de islotes, la evaluación del IEQ total no se considera un factor crítico. Es importante destacar que nuestro método nos ha permitido aislar los islotes de los estudios funcionales de 25 pacientes parcial pancreatectomized entre 2005 y 2008 5. Estos islotes fueron analizados para la glucosa estimulada por la secreción de insulina y la expresión de proteínas por Western Blot e inmunohistoquímica. Islotes aislados de parte pancreatecomized páncreas también podría ser utilizado para comparar los genes y los perfiles de expresión de proteínas, el aspecto ultraestructural y las respuestas funcionales de los islotes no diabéticos y diabéticos. Debido a que hay mayor número de pacientes sometidos a pancreatectomía parcial que existen donantes de órganos, el protocolo podría permitir suficientes muestras y datos que se recojan para el análisis estadístico robusto.

La oferta de la diabetes tipo 2 isletas para la investigación es insuficiente. Aquí compartimos nuestro protocolo para el aislamiento de islotes de pacientes sometidos a pancreatectomía parcial. Este enfoque representa un lugar único para la obtención de islotes de diabetes tipo 2 y clínicamente emparejado sujetos no diabéticos en un número suficiente de estudios básicos y clínicos.

El aislamiento de islotes humanos de pacientes parcialmente Pancreatectomized

Las investigaciones sobre la patogenia de la diabetes tipo 2 y el mal funcionamiento de los islotes de Langerhans 1 se han visto obstaculizadas por la disponibilidad limitada de tipo 2 ...

Hola, soy Florian Al del Departamento de Cirugía de la Universidad Técnica de Triton. Hola, soy Gregor Cher, también del Departamento de Cirugía del Hospital Universitario en Grayston.Se necesita urgentemente investigación sobre la biología y la función del párpado para avanzar en nuestra comprensión de la fisiología palpebral y la patogénesis de la diabetes. Desafortunadamente, es muy difícil obtener párpados humanos de pacientes no diabéticos y de pacientes con diabetes tipo dos. La siguiente secuencia de video le mostrará un protocolo para aislar párpados humanos de pacientes con optimización pancreática parcial.Los islotes obtenidos de esta manera pueden funcionar como un sistema in vitro para el análisis funcional. La resección quirúrgica del tejido pancreático humano es la condición previa para el aislamiento de islotes humanos. Dependemos de pacientes que se someten a una resección parcial del páncreas por patologías pancreáticas específicas.Como fuente de tejido pancreático humano, el cirujano realiza un corte en el páncreas y lleva a cabo la resección parcial. Posteriormente, el fragmento pancreático se coloca sobre hielo y se transporta al Departamento de Patología. El patólogo determina la cantidad de tejido pancreático blando y de apariencia sana que debe obtenerse.Para el aislamiento de islotes, se requieren al menos dos gramos de tejido pancreático para el aislamiento. El tejido se coloca en solución UCON y se transporta sobre hielo al laboratorio. El primer paso en la instalación de aislamiento de islotes es medir el peso del tejido pancreático.La muestra se coloca luego en un plato de 10 centímetros. Ya preparamos un matraz de 500 mililitros con 150 mililitros de medio RPMI y un matraz de 250 mililitros con 130 mililitros de medio RPMI. A continuación, agregamos la solución enzimática de digestión que contiene un mililitro de DNAs y 20 mililitros de colagenasa al matraz de 250 mililitros y la aspiramos en una jeringa de 10 mililitros.El tejido pancreático limpio se distiende luego mediante la inyección de un medio que contiene enzimas y se pica en trozos pequeños para aumentar el área de superficie y facilitar el proceso de digestión. Este paso de picado es crucial porque la distensión por inyección sola no permite una distribución adecuada de la enzima dentro del tejido. En paralelo, montamos el circuito de digestión.Como se muestra en esta figura, la dirección del flujo en la cámara registrada es hacia adentro por la parte inferior y hacia afuera por la parte superior de la cámara. Posteriormente, agregamos el medio que contiene la enzima restante al matraz de 500 mililitros hasta un volumen de 300 mililitros, y luego insertamos el termómetro. La cámara registrada contiene una malla metálica con un diámetro de poro de 600 micrómetros y canicas de nitruro de silicio libre con un diámetro de 15 milímetros cada una.Transferimos el tejido pancreático a la cámara, insertamos la malla, cerramos la cámara e iniciamos la bomba con una velocidad de 140 mililitros por minuto. Una vez que la temperatura del circuito alcanza 37 grados Celsius, comenzamos a medir el tiempo de digestión. La cámara registrada se agita manualmente según la composición del tejido.Para determinar el punto óptimo de tiempo para detener la digestión, tomamos muestras periódicas, tiñemos con tisón, y observamos los orificios separados teñidos de rojo bajo el microscopio. Una vez que los orificios parecen estar separados del tejido aino, detenemos rápidamente la digestión colocando la bobina de calentamiento sobre hielo y agregando 200 mililitros de medio de lavado frío al circuito. Posteriormente, recolectamos la solución de los párpados insertando el tubo de muestra en tubos Falcon de 250 mililitros hasta que el circuito quede vacío.El siguiente procedimiento de lavado comienza con el paso de centrifugación a 1000 RPM a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. En el siguiente paso, descartamos el sobrenadante, resuspendemos la solución del párpado en medio de lavado y distribuimos esta suspensión en fracciones iguales en tubos cónicos de 50 mililitros. El lavado continúa con otro paso de centrifugación a 1000 RPM a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.Como paso opcional, distribuimos la paleta en tubos cónicos adicionales además de los cuatro originales, dependiendo del tamaño de la paleta. Con el fin de mejorar el lavado, nuevamente descartamos el sobrenadante y aflojamos suavemente la paleta para separar el párpado del tejido aine. Las diferentes densidades tisulares de las dos partes permiten la aplicación de un gradiente fecal.Primero, resuspendemos el sedimento en medio fecal de densidad 1,125 gramos por mililitro. El sedimento debe ser lo suficientemente pequeño como para permitir una resuspensión homogénea. A continuación, superponemos lentamente este con las densidades del medio fecal 1,08, 1,060 y 1,037, con un volumen de 10 mililitros cada una.A continuación, centrifugamos los gradientes a 2.400 RPM durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Ahora es posible distinguir los diferentes componentes separados por sus densidades en las fracciones. Primero, descartamos la capa superior compuesta por grasa y tejido conectivo.La fracción que ahora recolectamos es la primera capa del agregado del párpado en 1.037 y 1.06, que contiene principalmente los ocelos aislados. Para un aislamiento eficiente, es importante recolectar las fracciones por separado. Luego, recolectamos la fracción del segundo agregado del párpado en la interfase de 1.060 y 1.080, que contiene ocelos menos puros que la primera capa.A continuación, agregamos el medio de lavado hasta un volumen total de 50 mililitros para diluir el gradiente fecal y enviamos a FUT a 1000 RPM durante cinco minutos. A cuatro grados Celsius, descartamos el agente SUP por succión, ya que el poso podría estar muy suelto debido a la tinción en frío. Por lo tanto, debemos repetir el paso de lavado con medio de cultivo para párpado a 1000 RPM durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.En el último paso, resuspendemos los botones oculares humanos y el cultivo de botones oculares, así como el medio y el cultivo. Los botones oculares recolectados se incuban a 37 grados Celsius durante 24 a 48 horas. Tras este paso de cultivo, los párpados están listos para un procesamiento adicional.Este protocolo debería permitirle aislar párpados humanos a partir de tejido pancreático tras una pancreatectomía parcial. El transporte rápido y frío del tejido pancreático hasta la instalación de aislamiento de párpados es fundamental para preservar la mejor viabilidad celular. El equipo de aislamiento debe tener en cuenta que el proceso de digestión es un procedimiento altamente dinámico.La duración del proceso de digestión depende en gran medida de la composición del tejido. Por ejemplo, del grado de fibrosis y de la capacidad de inyectar suficiente enzima en el tejido pancreático. El ajuste individual de la fuerza mecánica dentro de la cámara registrada y la duración del proceso de digestión son cruciales para obtener un buen rendimiento de islotes.

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Lograr una alta calidad y la cantidad adecuada de islotes humanos es uno de los requisitos importantes para el trasplante de islotes exitosos. En este video se describe paso a paso los procedimientos para el aislamiento de los islotes pancreáticos humanos (I parte: la digestión y la acumulación de tejido de páncreas), utilizando un método modificado automatizado.

Aislamiento humanos islote pancreático: Parte I: La digestión y la acumulación de tejido pancreático

Lograr una alta calidad y la cantidad adecuada de islotes humanos es uno de los requisitos importantes para el trasplante de islotes exitosos. En este video se describe paso a paso los procedimientos para el aislamiento de los islotes pancreáticos humanos (parte II: el saneamiento y la cultura de los islotes), utilizando un método modificado automatizado.

De páncreas humano de aislamiento Islet: Parte II: Purificación y Cultura de los islotes

Los islotes pancreáticos, también llamados islotes de Langerhans, son un grupo de células endocrinas que producen hormonas para la regulación de la glucosa y otras funciones biológicas importantes. Este protocolo explica un método para aislar los islotes pancreáticos mediante la perfusión de colagenasa a través de la ampolla de Vater para digerir el tejido pancreático exocrino y una centrifugación en gradiente de densidad simplificada para purificar los islotes de ratones.

Aislamiento de islotes pancreáticos mediante perfusión de colagenasa: un método enzimático para aislar células de islotes pancreáticos

Microdisección por láser es una técnica que permite la recuperación de células seleccionados a partir de cantidades mínimas de parénquima. Aquí se describe un protocolo para la obtención islotes pancreáticos humanos a partir de especímenes quirúrgicos para su uso para transcriptomic estudios. Nuestro protocolo mejora la autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas, lo que facilita su recogida.

Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

Se describe un protocolo en el presente documento para el aislamiento de islotes intactos de ratones neonatales. Páncreas se digirieron parcialmente con colagenasa, seguido de lavado y recolección a mano. 20 - 80 grupos de los islotes se pueden obtener por el páncreas de los ratones recién nacidos, que son adecuados para diversos estudios de los islotes.

El aislamiento efectivo de los islotes funcionales de páncreas de ratón neonatales

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Aquí, presentamos un protocolo para generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de células individuales de islotes pancreáticos humanos aislados utilizando una tecnología de secuenciación de ARN microfluídico microfluídico basada en gotas.

Secuenciación y análisis de islotes pancreáticos humanos de una sola célula

Aquí, proporcionamos detalles sobre la realización de la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) a través de la perfusión a través de la vasculatura de los ratones con un páncreas intacto como una técnica adicional para evaluar la función pancreática endocrina con reducción de posibles factores de confusión.

Secreción de insulina estimulada por glucosa a través de la perfusión a través de la vasculatura de ratones con un páncreas intacto

Este estudio desarrolló un método simplificado para extraer eficientemente islotes primarios funcionales y células acinas del páncreas del ratón, ofreciendo una herramienta valiosa para estudiar la comunicación intercelular en la patogénesis de la Diabetes Inducida por Pancreatitis Aguda.

Un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios y células acinares pancreáticas primarias de ratones

Este protocolo describe un método estandarizado para la extracción quirúrgica, la digestión enzimática y la purificación con gradiente de densidad de islotes pancreáticos de rata Lewis, permitiendo preparaciones de alto rendimiento y alta pureza para su uso directo en trasplantes o estudios in vitro .

Aislamiento y purificación de islotes pancreáticos a partir de ratas Lewis mediante digestión enzimática y separación por gradiente de densidad

Aprenda a aislar islotes pancreáticos humanos de pacientes sometidos a pancreatectomía parcial. Este protocolo utiliza digestión enzimática y gradientes de densidad para obtener islotes viables para estudios funcionales de diabetes.

El aislamiento de islotes humanos de pacientes parcialmente Pancreatectomized

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