Name: Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda a desarrollar líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas mediante transfección, citometría de flujo e imagen automatizada. Este método mejora la clonalidad, productividad y estabilidad de los clones seleccionados.

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1. Anfitrión de la transfección de células <ol><li> Semillas de 2 x 10 6 células CHO-DXB11 en T75 frasco de cultivo celular Corning en 15 ml de medio de cultivo (MEMA con nucleótidos y nucleósidos (Gibco, número de catálogo 12.571), complementado con un 10% γ-irradiados caracteriza suero fetal bovino (CFB) (HyClone, número de catálogo SH30071.03) y 10 ml / L de solución de glucosa al 45% (Sigma, número de catálogo G8769)) un día antes de la transfección. </li><li> En el momento de la transfección, preparar complejos de transfección de la siguiente manera: <ol class="lalpha"><li> Diluir 8 ug de ADN en 800 l de medio de cultivo sin suero en un tubo estéril de microcentrífuga. Mezclar suavemente. </li><li> Diluir 40 l Lipofectamine ™ (Invitrogen 18.324.012) en 800 l de medio de cultivo sin suero en un tubo de poliestireno. </li><li> Añadir el ADN diluido a la Lipofectamine ™ diluido. Mezclar suavemente e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Retire el medio de crecimiento de las células en T75 y reemplazar con 6,4 ml de medio de cultivo sin suero. Añadir 1,6 ml de la de los complejos de transfección en el matraz. Mezclar suavemente por balanceo de la placa. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 6 horas. </li><li> Añadir 8 ml de medio de cultivo en el matraz y se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante la noche. </li><li> Quitar medio por aspiración y se añade medio de cultivo fresco en el matraz. Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante la noche. </li><li> Vuelva a colocar el medio de cultivo con medio de selección (MEMA medio sin nucleótidos o nucleósidos (Gibco, número de catálogo 12561), complementado con un 10% γ-irradiados dializado de suero fetal bovino (DFB) (HyClone, número de catálogo SH30079.03) y 10 45 mL / L % de solución de glucosa (Sigma, número de catálogo G8769)). </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 2-3 semanas. </li></ol> 2. La clonación por citometría de flujo clasificación de células activadas <ol><li> Separar las células del frasco y se centrifuga a 800 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en un medio de selección de bovinos suplementados con 2% de albúmina sérica y la etiqueta fluorescente anti-IgG humana a las 1:20 de la dilución. </li><li> Incubar en hielo durante 15-30 minutos y luego lavar dos veces con PBS frío. Resuspender las células en 1x PBS en un tubo de polipropileno. </li><li> Prepararse para la clase aséptica en un BD ™ FACSAria. Prepare 96 y placa de cultivo celular que contiene 200 l medio de selección en cada pozo. </li><li> Asépticamente cargar el tubo con las células y analizar en BD FACSAria ™, registrar los resultados de las células teñidas y sin teñir, respectivamente. </li><li> Establecer las puertas y los ajustes para ordenar las células individuales del perfil de fluorescencia de tinción deseado en placa de 96 pocillos (s). <ol class="lalpha"><li> Las células transfectadas se analizó en primer lugar sobre la base de dispersión frontal versus dispersión lateral. Una puerta de las células vivas se hace sobre la base de dispersión hacia adelante, que mide el tamaño de una célula, y la dispersión lateral, que mide la complejidad de una célula o una granularidad. </li><li> Las células que se encuentran dentro de esta puerta son examinados para la tinción de PE. Puerta PE negativa está listo para teñir las células transfectadas o células teñidas de acogida. Como las células teñidas transfectadas son examinados por FACS, el "High PE" la puerta es entonces delineada para abarcar el 5% de todas las células que son positivas para la tinción de PE. </li></ol></li><li> Las placas se incuban en la incubadora a 37 ° C durante dos semanas. </li></ol> 3. La documentación de la formación de colonias por CloneSelect ™ Imager Documento de la formación de colonias en placas de 96 pozos en CloneSelect Imager ™ en el día 0, día 3, día 7 y 13 días después de la FACS de clasificación. La documentación de la imagen se asegurará la selección de clones derivados de una sola célula. Un paso crítico en este documento es conseguir que el plano focal ajustada correctamente para el día 0 de medición, ya que sólo hay una célula en cada pozo en ese momento. Es muy importante que las imágenes de las células individuales se encuentran en el enfoque y tratar de ajustar el enfoque en ellos puede ser engañoso en el mejor. El plano focal puede variar significativamente entre las marcas de las placas y, posiblemente, incluso de un lote a otro de la misma marca. Así, un plano focal predeterminada debe ser utilizado. Esto puede ser logrado, centrándose en la prueba de micro-gotas o células de alta densidad depositados en las placas del mismo lote que se utiliza. Por otra parte, las placas completamente crecido del mismo lote puede ser usado para este propósito. Después de FACS clasificación, también es importante para que las células se conforme con un mínimo de 2 horas antes de la imagen, de modo que se "fija" en la posición en la placa. 4. Evaluación y selección de clones de alta productividad <ol><li> Documento de posición de la muestra en las placas de ensayo que reciben de 96 pozos. </li><li> Alícuotas de transferencia de 20 l sobrenadante (diluir si es necesario) en placas de 96 pozos de ensayo por el EVO TECAN Freedom ® sistema de manejo de líquidos. Este robot flexible y capazplataforma de IC ha sido adaptado para este y otros trabajos automatizados de cultivo celular. Programas especiales fueron escritos para utilizar mejor y mejorar las capacidades de la Libertad EVO robótica para el desarrollo de líneas celulares. Un ejemplo de esto es establecer el TECAN para interpretar CloneSelect ™ de datos de imágenes de la toma de muestras de pozos con colonias aisladas. Otros programas están obligados a realizar tareas adicionales de cultivo celular, como para hacer las diluciones adecuadas de las muestras tomadas, de interpretar, el catálogo y las placas de la muestra manualmente marcados, si es necesario, para ampliar los clones de alta producción, etc Muchos de estos programas pueden ser fácilmente aplicada a 384 placas, así como el original formato de 96 también. </li><li> Producción de anticuerpos en las muestras se analizaron por un sándwich de detección ELISA IgG humana (Pierce, Rockford, IL) en el EVO TECAN Freedom ® sistema de manejo de líquidos. <ol><li> Muestras y estándar (IgG1 humana mieloma, kappa) (Sigma, St. Louis, MO) fueron cargados en la pre-recubierto Bio Escudo Anti-Human placas de ensayo IgG (BD Biosciences, San Jose, CA). </li><li> Las placas se incuban a temperatura ambiente durante dos horas, seguida de tres lavados con PBS. </li><li> Cabra ImmunoPure anti-IgG humana (Fc-gamma)-HRP (Pierce, Rockford, IL) se añadió a la placa a una dilución 1:2000 y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. </li><li> Las placas fueron lavadas tres veces con PBS antes de añadir el sustrato ABTS (Pierce, Rockford, IL) y se leyeron en un lector de placas con la absorbencia a 405 nm para la detección. </li></ol></li><li> Seleccionar clones de alta productividad y evaluar la productividad en el cultivo en suspensión. Por lote alimentado la cultura, las células fueron inoculadas en 0.3X106 células / ml en medio libre de proteínas VENTAJAS INMEDIATAS JRH 65578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) suplementado con 5 hidrolizado g / L de soja (DMV International, número de catálogo SE50MAF-UF, mucho número) y se incuba a 37 ° C con 7,5% de CO 2. La cultura continúa y se complementaron con 2 g / L de glucosa (Sigma, número de catálogo G8769, número de lote 098K2329) cuando la glucosa más la concentración de lactato en la cultura llegó a menos de 2 g / L, y se les dieron 2 mM de glutamina (Gibco, número de catálogo 25030, número de lote 568177), cuando llegó a los niveles de glutamina por debajo de 200 mg / L (metabolitos medidos por YSI Bioanalyzer). Fed-batch culturas se concluyó el día 14 y la producción de anticuerpos se midió por HPLC de fase. </li><li> La caracterización genética de clones candidatos por hibridación in situ fluorescente (FISH) 5. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Un ejemplo de anticuerpos en desarrollo que producen clones con el método de alto rendimiento se muestra en la Figura 1 y Figura 2. Reserva de las células transfectadas se tiñó con la etiqueta fluorescente anti-IgG humana (fig. 1A), analizados y ordenados en la BD FACSAria ™ (fig. 1B). La formación de colonias en placas de 96 y fue fotografiada en CloneSelect Imager ™ (fig. 1C). Sobrenadante de cultivo celular se tomaron muestras de los pozos que contienen una sola colonia y ensayados por ELISA en el sistema de TECAN Freedom EVO ® de manejo de líquido (Figura 1D). Clones de alta productividad se encontraron a partir de células que mostraron mayor nivel de anticuerpos de superficie reflejada por la tinción fluorescente con anticuerpos anti-IgG humana. Al comparar los clones generados a partir de dos poblaciones de la reserva de las células transfectadas inicial, una gran diferencia en la productividad en fed-batch cultura se observó (Figura 2). Para los dos primeros clones generados por la población de células con alta expresión de anticuerpos de superficie (PE de alta), la productividad específica varió desde 50 hasta 70 pg / célula / día. Mientras que la productividad de anticuerpos fue de ~ 20 pg / célula / día durante los dos primeros clones generados por la población de células con baja expresión de anticuerpos de superficie (PE de baja). Además, las líneas celulares desarrolladas por FACS clasificación son más estables con respecto a la producción de anticuerpos que los que fueron clonados por dilución encalado manual (Figura 3). La productividad específica del clon de la parte superior, cayó "Clon 1", generados por la dilución encalado manual de ~ 30 ~ 10 pcd de pcd después de un cultivo de 80 duplicaciones celulares. Por otro lado, la parte superior subclon generado por FACS clasificación, "Clone 2", fue capaz de mantener la productividad específica en torno al 20 pcd por lo menos 100 duplicaciones celulares. Por hibridación in situ fluorescente (FISH), hemos demostrado un clon mostró como una población mixta de fenotipo A (85%) y el fenotipo B (15%). Por el contrario, FACS ordenados clon (clon 2) demostró ser una población más homogénea, con un 99,5% de las células resultó ser un fenotipo. (Figura 3B) <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Desarrollo de las líneas de fabricación de células para la producción de anticuerpos monoclonales a partir de células CHO. A) tinción de la superficie del grupo inicial de células transfectadas con la etiqueta fluorescente anti-IgG humana. B) Clasificación de la población de células con una alta intensidad de fluorescencia (PE de alta) y la intensidad de fluorescencia baja (PE de baja) en placa de 96 pocillos. C) Documentación de la coloniaformación desde el día 0 al día 13 después de la siembra en CloneSelect Imager ™. D) clones de detección por ELISA. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Superficiales asociadas nivel de anticuerpos se correlaciona con la productividad de anticuerpos de la célula. Los clones con tinción fluorescente de alta y baja fueron desarrollados en las líneas celulares y evaluados en fed-batch cultura. Volumétrica título y la productividad específica fueron comparados entre los 2 primeros clones de cada población. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Clones generados a partir de la clasificación FACS muestran una mayor homogeneidad genética y la estabilidad de clon. A) estabilidad de la producción de anticuerpos en la cultura de lotes para ~ 80 duplicaciones celulares del tiempo de cultivo transcurrir. Δ, el clon se generó mediante dilución límite, donde las células se sembraron a 2000 células / pocillo, 1000 células / pocillo y 500 células /. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="Triángulo Negro" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Triángulo negro"> , El clon se ha generado a través de la FACS en una celda / bien. B) Lugar integración del transgén en el cromosoma de células CHO se identifica por hibridación fluorescente in situ.

<ol><li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells%3A+improvement+through+gene+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li>
<li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li>
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</ol>

Los autores de este artículo son empleados de Merck &amp; Co., Inc., que usan este método para la producción a gran escala de proteínas terapéuticas a partir de líneas celulares de mamíferos.

Hemos presentado una célula de fabricación automatizados línea plataforma de desarrollo que permite el aislamiento de clones de alta productividad, y en la media, mientras que asegura la estabilidad y la clonalidad clon. El compromiso de la tinción de la superficie del anticuerpo seguida de una selección de células FACSAria ™ es la clave para la obtención de clones individuales de productividad altos de anticuerpos. Nuestros resultados y otros informes 4.2 sugieren que el nivel de anticuerpos de forma transitoria que aparece en la superficie celular una buena correlación con la productividad de la célula. Por lo tanto, un anticuerpo conjugado con fluoresceína se puede utilizar para reconocer el producto asociado a la membrana y ayuda al aislamiento de los productores de alta. Por otra parte, co-expresión de genes reporteros y la tecnología de microgotas de gel se han utilizado para facilitar la selección de clones de alta producción por FACS 6-8. Además de aislar clones de alta producción a través de la FACS, otras tecnologías se han desarrollado para lograr el mismo objetivo. Estos incluyen la tecnología de enrejado CellSpot Bioscience que utiliza microspere sistemas de detección de anticuerpos y la tecnología de detección láser para identificar los clones de alta productividad y eliminar las células no deseadas, Genetix ClonePix FL y StemCell tecnologías de plataforma ClonaCell EasyPick que realizan cribado de alto rendimiento de las líneas celulares de producción mediante un sistema de detección de anticuerpos fluorescentes . Optamos por implementar el método de clonación FACS basado en el nivel de anticuerpos de superficie asociados, ya que combina la facilidad de operación, la selectividad en la productividad y clonalidad. El empleo de sistema de TECAN Freedom EVO ® de manejo de líquido aumentó significativamente el rendimiento de detección, que proporcionan la oportunidad de seleccionar clones de alto rendimiento de un grupo de células mucho más grandes. Otros instrumentos para el ensayo como HTRF, Bioforte Octeto, HPLC, etc, son todos los medios posibles de la selección de los productores de alta y descartar a los productores de baja. Mediante el seguimiento de la formación de clonar con CloneSelect Imager ™, que genera la documentación necesaria para probar la clonalidad de historia digitalizada línea celular. Clonalidad se ve confirmado por caracterizar genéticamente solo sitio la integración del transgen en el cromosoma. Un paso subclonación, que suele ser adoptadas para garantizar la clonalidad, por lo tanto puede ser eliminado. Esto le ahorrará de 4-8 semanas de tiempo para el desarrollo de líneas celulares. En resumen, las líneas celulares de calidad generados por la plataforma automatizada de alto rendimiento mostraron una alta productividad, la estabilidad de la producción y la historia documentada de la línea celular que debe satisfacer la demanda de producción a gran escala y los requisitos normativos vigentes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td></tr><tr><td> BD FACS Aria ™ clasificador de células </td><td> BD Bioscience </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ Imager </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> TECAN Freedom EVO ® sistema de manejo de líquidos </td><td> Tecan Group </td></tr></tbody></table>

una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

La industria biofarmacéutica de rápido crecimiento exige un rápido desarrollo de los sistemas de producción altamente eficiente y confiable para satisfacer la creciente necesidad de suministros de medicamentos. La generación de líneas celulares de producción tradicionalmente ha involucrado el manual de operaciones que requieren mucha mano de obra, de bajo rendimiento y vulnerable a errores humanos. Presentamos aquí una plataforma integrada de alto rendimiento y automatizado para el desarrollo de líneas celulares de fabricación para la producción de proteínas terapéuticas. La combinación de BD FACS Aria ™ clasificador de células, CloneSelect ™ Imager y TECAN Freedom EVO ® sistema de manejo de líquidos se ha habilitado una línea de alto rendimiento y más eficiente proceso de desarrollo celular. En esta operación, las células la producción de acogida son los primeros transfectadas con un vector de expresión que lleva el gen de interés 1, seguido por el tratamiento con un agente de selección. Las células establemente transfectadas se tiñen con fluorescencia marcado anti-IgG humana, y, posteriormente, sometido a un análisis de citometría de flujo 2.4. Células altamente productivo son seleccionados en base a la intensidad de fluorescencia y se encuentran aisladas por una sola célula de clasificación en una BD ™ FACSAria. La formación de colonias de una sola célula etapa se detectó al microscopio y una serie de vueltas del tiempo las imágenes digitales son tomadas por CloneSelect ™ Imager para la documentación de la historia de la línea celular. Después de clones individuales se han formado, estos clones fueron seleccionados para la productividad por medio de ELISA realizada en un EVO TECAN Freedom ® sistema de manejo de líquidos. Aproximadamente 2.000 - 10.000 clones pueden ser examinados por cada ciclo de funcionamiento con la configuración actual del sistema. Este enfoque integrado ha sido utilizado para generar alta producción de ovario de hámster chino (CHO) líneas celulares para la producción de anticuerpos terapéuticos monoclonales (mAb), así como sus proteínas de fusión. Con la ayuda de diferentes tipos de sondas de detección, el método puede ser utilizado para el desarrollo de otros productos terapéuticos de proteínas o ser aplicados a otros sistemas de producción de acogida. En comparación con el procedimiento manual tradicional, esta plataforma automatizada han demostrado las ventajas de la capacidad aumentó significativamente, clonalidad asegurado, la trazabilidad en la historia de la línea celular con la documentación electrónica y la oportunidad mucho más reducida en los errores del operador.

Un alto rendimiento, la plataforma automatizada de desarrollo de la fabricación línea celular para la producción de proteínas terapéuticas se describe. Implementación de BD clasificador de células FACS Aria, CloneSelect Imager y Libertad TECAN EVO sistema de manejo de líquidos se ha demostrado la capacidad de procesamiento aumentó significativamente en el desarrollo de líneas celulares con mejor calidad de línea celular y una alta reproducibilidad.

Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

La industria biofarmacéutica, en rápido crecimiento, exige el desarrollo acelerado de sistemas de producción altamente eficientes y fiables para satisfacer la creciente ...

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar líneas celulares de producción para productos biológicos con clonalidad y alta productividad. Esto se logra primero transfectando la célula huésped con ADN que codifica el gen de interés. El siguiente paso del procedimiento consiste en aislar clones de alta producción mediante FACS, seguido de la documentación de la formación de colonias mediante el equipo Clone Select Imager.El paso final consiste en seleccionar y cribar clones altamente productivos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la producción de anticuerpos en cultivos continuos y por lotes alimentados mediante cromatografía líquida de fase reversa HPLC. El video. La demostración de este método es fundamental, ya que los pasos de clasificación y pcan 80 dgl son difíciles de aprender debido a que estas procedimientos implican una configuración compleja; a continuación, científicos de un laboratorio demostrarán estos procedimientos para la transfección del efecto en células huésped, la clasificación de Jason Sanders para la documentación de la formación de colonias y Russell Kan para el muestreo en tecan.Y Eliza Para comenzar este procedimiento, un día antes de la transfección, siembre las células huésped en un matraz de cultivo celular con 15 mililitros de medio de crecimiento. Incube las células en un incubador a 37 grados Celsius con 7,5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, prepare primero los complejos de transfección: diluya ocho microgramos de ADN en 800 microlitros de medio de crecimiento sin suero en un tubo estéril de microcentrífuga y mezcle suavemente. A continuación, diluya 40 microlitros de lip en 800 microlitros de medio de crecimiento sin suero en un tubo de poliestireno.Agregue el ADN diluido al Lipofectamina diluido. Mezcle suavemente e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente para preparar las células huésped para la transfección. Retire el medio de crecimiento de las células y sustitúyalo por 6,4 mililitros de medio de crecimiento sin suero.Añada 1,6 mililitros de los complejos de transfección al frasco. Mezcle suavemente moviendo el frasco de un lado a otro. Incube las células a 37 grados Celsius en un incubador de dióxido de carbono durante seis horas.Después de seis horas, agregue ocho mililitros de medio de crecimiento al matraz e incube a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono durante la noche, al día siguiente. Retire el medio mediante aspiración y agregue medio de crecimiento fresco al matraz. Incube las células durante la noche nuevamente después de la incubación nocturna.Sustituya el medio de crecimiento por el medio de selección. Incube las células a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono durante dos o tres semanas. De dos a tres semanas después de la transfección, las células están listas para la clonación mediante citometría de flujo; separe las células adheridas del frasco y centrifugue a 800 RPM durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.ReSuspender las células en medio de selección, suplementado con 2 % de albúmina de suero bovino. Luego, añadir el anticuerpo anti-IgG humano marcado con fluorescencia. Añadir una dilución de uno a 20, incubar en hielo durante 15 a 30 minutos y luego lavar dos veces con PBS frío. ReSuspender las células en un volumen de PBS en un tubo de polipropileno.Un ejemplo de células teñidas se muestra en esta imagen para la clasificación aséptica en un BD FACS Aria. Prepare una placa de cultivo celular de 96 pocillos que contenga 200 microlitros de medio de selección en cada pocillo. Cargue asépticamente el tubo con células y analice en el BD FACS Aria; registre los resultados para células teñidas y no teñidas, respectivamente.Configure las compuertas y ajustes para clasificar células individuales con el perfil de tinción fluorescente deseado en la placa de 96 pocillos. Incube la placa en un incubador a 37 grados Celsius durante dos semanas. En el día cero, día tres, día siete y día 13, después de la clasificación celular, documente la formación de colonias en la placa de 96 pocillos mediante un equipo Clone Select Imager para asegurar la selección de clones derivados de una sola célula, con el fin de cribar y seleccionar clones altamente productivos. Primero registre la posición de la muestra en la placa de ensayo receptora de 96 pocillos. Luego, utilice un sistema robótico de manipulación de líquidos para transferir alícuotas de 20 microlitros de sobrenadante a cada pocillo de la placa de ensayo de 96 pocillos. La producción de anticuerpos en las muestras se analiza mediante un ensayo tipo sándwich.ELISA para la detección de IgG humana en el sistema de manipulación líquida de la siguiente manera. Primero, las muestras y un patrón se cargan en placas de ensayo Bio-Coat pre-codificadas con anticuerpo anti-IgG humana. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante dos horas, seguido de tres lavados con PBS.A continuación, se añade inmuno puro de cabra anti-IgG humana. Se agrega HRP a las placas en una dilución de uno a 2000 y se incuban durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, las placas se lavan tres veces con PBS y luego se añade el sustrato A BTS.Finalmente, las placas se leen en un lector de placas utilizando la absorbancia a 405 nanómetros para la detección. Mediante esta plataforma automatizada, se encontró que el nivel de anticuerpos en la superficie, reflejado por la tinción con anticuerpo anti-IgG humano marcado con fluorescencia, se correlaciona con la productividad de anticuerpos de la célula. Como se muestra aquí para los dos mejores clones generados a partir de la población celular con alta expresión de anticuerpos en la superficie, la productividad específica osciló entre 50 y 70 picogramos por célula por día.En contraste, la productividad del anticuerpo fue de aproximadamente 20 picogramos por célula al día para los dos mejores clones generados a partir de la población celular con baja expresión de anticuerpo en la superficie. Además, las líneas celulares desarrolladas mediante clasificación FACS son más estables con respecto a la producción de anticuerpos que aquellas clonadas mediante dilución limitante manual. La productividad específica del mejor clon, clon uno, generado mediante dilución limitante manual, disminuyó de aproximadamente 30 PCD a unos 10 PCD después de cultivarlas durante 80 duplicaciones celulares.Por otro lado, el mejor subclon generado mediante clasificación por fax del clon dos fue capaz de mantener la productividad específica alrededor de 20 PCD durante al menos 100 duplicaciones celulares. La identificación del sitio de integración del transgén en el cromosoma celular mediante hibridación in situ fluorescente demostró que el clon uno es una población mixta de fenotipo A y fenotipo B. En contraste, el clon clasificado por fax parecía ser una población más homogénea, con el 99,5 % de las células del fenotipo A. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar líneas celulares de producción para la fabricación de proteínas terapéuticas.

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En la era genómica post-humana, la disponibilidad de proteínas recombinantes en conformaciones nativas es crucial para la investigación estructural, funcional y terapéutico y el desarrollo. Aquí se describe una prueba a gran escala y sistema de expresión de proteínas en células embrionarias humanas de riñón 293T que se pueden utilizar para producir una variedad de proteínas recombinantes.

Una expresión adecuada y el general de la Plataforma para la producción de proteínas secretadas por las células humanas

Hemos desarrollado un cultivo de células automatizado y la plataforma de interrogación para experimentos de estimulación de células micro-escala. La plataforma ofrece un control sencillo, versátil y precisa en el cultivo y estimular las pequeñas poblaciones de células, y la recuperación de lisados ​​de análisis moleculares. La plataforma se adapta bien a los estudios que utilizan las células preciosos y / o reactivos.

Una plataforma automatizada versátil para Micro escala experimentos de estimulación celular

Los protocolos descritos permiten a los laboratorios realizar cultivos de células madre adherentes y escalables con un rendimiento mínimo con un costo mínimo de inversión en mano de obra, experiencia y equipo utilizando un robot de manejo de líquidos programable y placas de 96 pocillos.  Las iPSCs transitadas más de 20 veces en este sistema mantuvieron la pluripotencia, los cariotipos normales y se diferenciaron en cardiomiocitos.

Escalable 96 pocillos Placa base IPSC Cultura y Producción Usando un sistema de manipulación robótica Líquido

Se presenta un protocolo detallado para la operación concurrente de culturas de célula paralelo 48 bajo variadas condiciones en un sistema de microbioreactor. Proceso de cultivo celular, la cosecha y el análisis del título de anticuerpos posterior se describen.

Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO

La automatización es clave para aumentar el escalado y la gestión de costos en la fabricación de células. Este manuscrito describe el uso de un dispositivo de procesamiento de células centrífugas de contraflujo para automatizar los pasos de intercambio de búferes y concentración celular para el bioprocesamiento a pequeña escala.

Sistema Centrífugo de Contraflujo Automatizado para Procesamiento celular a pequeña escala

Mostramos la automatización de cultivos de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y diferenciaciones neuronales compatibles con imágenes y análisis automatizados.

Producción automatizada de neuronas corticales y dopaminérgicas derivadas de células madre no inducidas por humanos con monitoreo integrado de células vivas

Aquí, presentamos un protocolo para lograr la fabricación a gran escala de células adherentes a través de un sistema completamente cerrado basado en microportadores solubles de grado GMP. El cultivo de células madre mesenquimales humanas, células HEK293T y células Vero se validó y cumplió tanto con las demandas de cantidad como con los criterios de calidad para la industria de la terapia celular y génica.

Producción celular a gran escala basada en microportadores porosos solubles de grado GMP

En este artículo se detalla el proceso de fabricación de linfocitos T receptores de antígenos quiméricos para uso clínico, concretamente utilizando un procesador celular automatizado capaz de realizar la transducción viral y el cultivo de linfocitos T. Proporcionamos recomendaciones y describimos los escollos que deben tenerse en cuenta durante el desarrollo del proceso y la implementación de un ensayo clínico de fase inicial.

Fabricación de células T con receptor de antígeno quimérico en un procesador celular automatizado

Este protocolo documenta la fabricación y el montaje de SPOT, una plataforma de cultivo basada en andamios de alto rendimiento, en formatos de 96 y 384 pocillos. También detalla el proceso de siembra para SPOT, tanto manual como utilizando un manipulador de líquidos disponible comercialmente.

Fabricación reproducible de SPOT como plataforma de cultivo basada en andamios de alto rendimiento

Este protocolo describe un método escalable para la expansión de productos de Terapias Celulares Adoptivas (ACT), concretamente células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR)-T y células Killer inducidas por citocinas (CIK), utilizando dispositivos de expansión rápida permeable a gas (G-Rex), demostrando un crecimiento eficiente y robusto en un entorno clínicamente relevante.

Generación eficiente y rápida de células asesinas inducidas por CAR-T e citocinas en dispositivos escalables por GMP

Aprenda a desarrollar líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas mediante transfección, citometría de flujo e imagen automatizada. Este método mejora la clonalidad, productividad y estabilidad de los clones seleccionados.

Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

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