Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar líneas celulares de producción para productos biológicos con clonalidad y alta productividad. Esto se logra primero transfectando la célula huésped con ADN que codifica el gen de interés. El siguiente paso del procedimiento consiste en aislar clones de alta producción mediante citometría de flujo, seguido de la documentación de la formación de colonias mediante el imagenizador Clone Select.

El paso final consiste en seleccionar y cribar clones altamente productivos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la producción de anticuerpos en cultivos continuos y por lotes alimentados mediante cromatografía líquida de alta eficacia en fase reversa. Vídeo. La demostración de este método es fundamental, ya que los pasos de clasificación y pcan 80 dgl son difíciles de aprender debido a que implican una configuración compleja; a continuación, científicos de un laboratorio demostrarán estos procedimientos para la transfección del efecto en células huésped, la clasificación de Jason Sanders para la documentación de la formación de colonias y Russell Kan para el muestreo en tecan.

Y Eliza Para comenzar este procedimiento, un día antes de la transfección, siembre las células huésped en un matraz de cultivo celular con 15 mililitros de medio de crecimiento. Incube las células en un incubador a 37 grados Celsius con 7,5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, prepare primero los complejos de transfección: diluya ocho microgramos de ADN en 800 microlitros de medio de crecimiento sin suero en un tubo estéril de microcentrífuga y mezcle suavemente. A continuación, diluya 40 microlitros de lip en 800 microlitros de medio de crecimiento sin suero en un tubo de poliestireno.

Agregue el ADN diluido al Lipofectamina diluido. Mezcle suavemente e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente para preparar las células huésped para la transfección. Retire el medio de crecimiento de las células y reemplácelo con 6,4 mililitros de medio de crecimiento sin suero.

Añada 1,6 mililitros de los complejos de transfección al frasco. Mezcle suavemente moviendo el frasco de un lado a otro. Incube las células a 37 grados Celsius en un incubador de dióxido de carbono durante seis horas.

Después de seis horas, agregue ocho mililitros de medio de crecimiento al matraz e incube a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono durante la noche al día siguiente. Retire el medio mediante aspiración y agregue medio de crecimiento fresco al matraz. Incube las células durante la noche nuevamente después de la incubación nocturna.

Sustituya el medio de crecimiento por el medio de selección. Incube las células a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono durante dos o tres semanas. De dos a tres semanas después de la transfección, las células están listas para la clonación mediante citometría de flujo; separe las células adheridas del frasco y centrifugue a 800 RPM durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Re-suspender las células en medio de selección, suplementado con 2% de albúmina de suero bovino. Luego, añadir el anticuerpo anti-IgG humano marcado con fluorescencia. Agregar una dilución de uno a 20, incubar en hielo durante 15 a 30 minutos y luego lavar dos veces con PBS frío; re-suspender las células en un volumen de PBS en un tubo de polipropileno.

Un ejemplo de células teñidas se muestra en esta imagen para la clasificación aséptica en un BD FACS Aria. Prepare una placa de cultivo celular de 96 pocillos que contenga 200 microlitros de medio de selección en cada pocillo. Cargue asépticamente el tubo con células y analice en el BD FACS Aria; registre los resultados para células teñidas y no teñidas, respectivamente.

Configure las compuertas y ajustes para clasificar células individuales con el perfil deseado de tinción fluorescente en la placa de 96 pocillos e incube la placa en un incubador a 37 grados Celsius durante dos semanas. En el día cero, día tres, día siete y día 13 tras la clasificación celular, documente la formación de colonias en la placa de 96 pocillos mediante un equipo Clone Select Imager para asegurar la selección de clones derivados de una sola célula, con el fin de cribar y seleccionar clones altamente productivos. Primero registre la posición de la muestra en la placa de ensayo receptora de 96 pocillos. Luego, utilice un sistema robótico de manipulación de líquidos para transferir alícuotas de 20 microlitros de sobrenadante a cada pocillo de la placa de ensayo de 96 pocillos. La producción de anticuerpos en las muestras se analiza mediante un ensayo tipo sándwich.

ELISA para detección de IgG humana en el sistema de manipulación de líquidos de la siguiente manera. Primero, se cargan las muestras y un estándar en placas de ensayo bio recubiertas y pre-codificadas con anticuerpo anti-IgG humana. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante dos horas, seguido de tres lavados con PBS.

A continuación, se añade inmuno puro de cabra anti-IgG humana. Se agrega HRP a las placas en una dilución de uno a 2000 y se incuban durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, las placas se lavan tres veces con PBS y luego se añade el sustrato A BTS.

Finalmente, las placas se leen en un lector de placas utilizando la absorbancia a 405 nanómetros para la detección. Mediante esta plataforma automatizada, se encontró que el nivel de anticuerpos en la superficie, reflejado por la tinción con anticuerpo anti-IgG humano marcado con fluorescencia, se correlaciona con la productividad de anticuerpos de la célula. Como se muestra aquí para los dos mejores clones generados a partir de la población celular con alta expresión de anticuerpos en la superficie, la productividad específica osciló entre 50 y 70 picogramos por célula por día.

En contraste, la productividad de anticuerpos fue de aproximadamente 20 picogramos por célula al día para los dos mejores clones generados a partir de la población celular con baja expresión de anticuerpos en la superficie. Además, las líneas celulares desarrolladas mediante clasificación FACS son más estables con respecto a la producción de anticuerpos que aquellas clonadas mediante dilución limitante manual. La productividad específica del mejor clon, el clon uno, generado mediante dilución limitante manual, disminuyó de aproximadamente 30 PCD a unos 10 PCD después de cultivarse durante 80 duplicaciones celulares.

Por otro lado, el subclon superior generado mediante clasificación por fax del clon dos fue capaz de mantener la productividad específica alrededor de 20 PCD durante al menos 100 duplicaciones celulares. La identificación del sitio de integración del transgén en el cromosoma celular mediante hibridación in situ fluorescente demostró que el clon uno es una población mixta de fenotipo A y fenotipo B. En contraste, el clon clasificado por citometría de flujo parecía ser una población más homogénea, con el 99,5 % de las células presentando el fenotipo A. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar líneas celulares de producción para la fabricación de proteínas terapéuticas.