Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar líneas celulares de fabricación para productos biológicos con clonalidad y alta productividad. Esto se logra mediante un primer transecto de la célula huésped con ADN, que codifica el gen de interés. El siguiente paso del procedimiento es aislar los clones de alta producción por hechos, seguido de la documentación de la formación de colonias por el generador de imágenes de selección de clones.

El paso final es cribar y seleccionar clones altamente productivos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la producción de anticuerpos en cultivos continuos y alimentados por lotes a través de HPLC de fase inversa. Vídeo. La demostración de este método es crítica ya que la clasificación de hechos y los pasos de pcan 80 dgl son difíciles de aprender porque una configuración compleja está involucrada en estos procedimientos, los siguientes científicos de un laboratorio demostrarán estos procedimientos para la transfección del efecto de la célula huésped, clasificando Jason Sanders para la documentación de la formación de colonias y Russell Kan para el muestreo de tecanos.

Y Eliza: Para comenzar este procedimiento, un día antes de la transfección, siembre las células huésped en un matraz de cultivo celular en 15 mililitros de crecimiento. Medio. Incubar las células en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados al 7,5% al día siguiente, preparar primero los complejos de transfección diluir ocho microgramos, ADN en 800 microlitros de medio de crecimiento sin suero en un tubo de microcentrífuga estéril mezclado suavemente. A continuación, diluya 40 microlitros de labio en 800 microlitros de medio de crecimiento sin suero en un tubo de poliestireno.

Agregue el ADN diluido a la lipofectamina diluida. Mezclar suavemente e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente para preparar las células huésped para la transfección. Retire el medio de crecimiento de las células y reemplácelo con 6,4 mililitros de medio de crecimiento sin suero.

Añadir 1,6 mililitros de los complejos de transfección al matraz. Mezcle suavemente meciendo el matraz. Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante seis horas.

Después de seis horas, agregue ocho mililitros de medio de crecimiento al matraz e incube a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante la noche del día siguiente. Retire el medio por aspiración y agregue el medio de crecimiento fresco al matraz. Incube las células durante la noche nuevamente después de la incubación nocturna.

Reemplace el medio de crecimiento con selección. Medio. Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante dos o tres semanas. Dos o tres semanas después de ser transfectadas, las células están listas para la clonación mediante citometría de flujo, clasificación celular activada, clasificación de células desalojadas del matraz y centrífuga a 800 RPM durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Resuspender las células en medio de selección, suplementado con albúmina sérica bovina al 2%. A continuación, añada el anticuerpo IgG humano marcado con fluorescencia. Agregue una dilución de uno a 20, incube en hielo durante 15 a 30 minutos y luego lave dos veces con PBS frío, resuspenda las células en un XPBS en un tubo de polipropileno.

En esta imagen se muestra un ejemplo de células teñidas para la clasificación aséptica en un fax BD para preparar una placa de cultivo celular de 96 pocillos que contiene 200 microlitros de medio de selección en cada pocillo. Cargue asépticamente el tubo con células y analice los hechos de BD. Aria, registra los resultados de las células teñidas y no teñidas respectivamente.

Configure las puertas y la configuración para clasificar las células individuales del perfil de tinción fluorescente deseado en la placa de 96 pocillos incubar la placa en una incubadora de 37 grados Celsius durante dos semanas en el día cero, el día tres, el día siete y el día 13 después de la clasificación de la formación de colonias de documentos en la placa de 96 pocillos en un generador de imágenes de selección de clones para garantizar la selección de clones derivados de una sola célula para cribar y seleccionar para una alta productividad clones. Primer documento de la posición de la muestra en la placa de ensayo receptora de 96 pocillos. A continuación, utilice un sistema robótico de manipulación de líquidos para transferir alícuotas de 20 microlitros de sobrenadante a cada pocillo de la placa de ensayo de 96 pocillos, la producción de anticuerpos en las muestras se analiza mediante un sándwich.

IgG humana que detecta ELI SA en el sistema de manejo de líquidos de la siguiente manera. En primer lugar, las muestras y un patrón se cargan en placas de ensayo anti-IgG humanas bio-coat precodificadas. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante dos horas, seguidas de tres lavados con PBS.

Siguiente inmuno cabra pura anti-humana IgG. HRP se añade a las placas en una dilución de uno a 2000 y las placas se incuban durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, las placas se lavan tres veces con PBS y luego se agrega el sustrato A BTS.

Finalmente, las placas son rojas en un lector de placas que utiliza absorbancia a 405 nanómetros para su detección. Utilizando esta plataforma automatizada, se descubrió que el nivel de anticuerpos de superficie reflejado por la tinción con IgG antihumana marcada con fluorescente se correlaciona con la productividad de anticuerpos de la célula. Como se muestra aquí para los dos clones principales generados a partir de la población celular con alta expresión de anticuerpos de superficie, la productividad específica osciló entre 50 y 70 picogramos por célula por día.

Por el contrario, la productividad de anticuerpos fue de aproximadamente 20 picogramos por célula por día para los dos clones principales generados a partir de la población celular con baja expresión de anticuerpos de superficie. Además, las líneas celulares desarrolladas por clasificación de hechos son más estables con respecto a la producción de anticuerpos que las que se clonaron mediante dilución limitante manual. La productividad específica del clon superior del clon generado por dilución de limitación manual disminuyó de aproximadamente 30 PCD a aproximadamente 10 PCD después del cultivo para 80 duplicaciones de celdas.

Por otro lado, el subclon superior generado por el clon dos de clasificación por fax fue capaz de mantener la productividad específica en torno a 20 PCD durante al menos 100 duplicaciones de celdas. La identificación del sitio de integración del transgén en el cromosoma celular mediante hibridación fluorescente in situ demostró que el clon uno es una población mixta de fenotipo A y fenotipo B.In contraste, el hecho de que el clon ordenado parecía ser una población más homogénea con el 99,5% de las células del fenotipo A. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar líneas celulares de fabricación para la protección de proteínas terapéuticas.