JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 4:15 min • April 30th, 2023
Los organoides tumorales derivados del paciente son tumores en miniatura que se desarrollan a partir del órgano original. En el trasplante a un modelo animal, estos organoides conservan la mayoría de las características fenotípicas y genéticas del tumor original, lo que permite una terapia personalizada contra el cáncer. Por ejemplo, los organoides del cáncer de vejiga se tiñen positivamente para muchos marcadores celulares como su tumor parental correspondiente.
Para desarrollar un modelo de organoide tumoral, comience con un cultivo de organoides tumorales de vejiga. Agregue la suspensión de la enzima colagenasa al cultivo de organoides e incube. La colagenasa descompone los componentes de la matriz. Ahora, agregue un medio de cultivo precalentado para liberar los organoides libres en suspensión. Centrifugar a baja temperatura para neutralizar cualquier actividad residual de colagenasa y obtener el pellet organoide.
Deseche el sobrenadante que contiene enzimas neutralizadas y componentes de matriz degradados y vuelva a suspender el gránulo en medios nuevos. Transfiera la suspensión de organoides a un medio de crecimiento que contenga la matriz de la membrana basal. Posteriormente, extraiga el organoide y la suspensión del medio en una jeringa e inyéctelo en la pared anterior de una vejiga de ratón desnuda anestesiada y expuesta quirúrgicamente.
La compleja red de matriz de membrana basal ayuda a atrapar los organoides y facilita su integración con la pared de la vejiga. La pared de la vejiga imita el microambiente tumoral parental, lo que permite que los organoides se conviertan en un tumor que refleja la morfología y patogénesis del cáncer original.
Para preparar los organoides tumorales de vejiga para el trasplante ortotópico, agregue 500 microlitros de colagenasa/dispasa al medio organoide en una placa de 24 pocillos. Pipetear la matriz de la membrana basal y el medio hacia arriba y hacia abajo. Luego, incube la placa durante 20 minutos a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, recoja las células en un tubo de 15 mililitros y agregue 5 mililitros de DMEM precalentado. Luego, centrifugar el tubo a 400 x g durante 3 minutos a 4 grados centígrados y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo con 1 mililitro de DMEM y transfiera la solución a una placa de Petri de 90 milímetros.
Bajo un microscopio, recoja de 10 a 100 organoides tumorales con una pipeta P200 y recójalos en un microtubo sobre hielo. Centrifugar el microtubo y retirar con cuidado el sobrenadante. Luego, mantenga el gránulo en hielo hasta que los ratones estén listos para la cirugía. Antes del trasplante de la pared de la vejiga submucosa, mantenga las jeringas, las puntas de las pipetas y la matriz de la membrana basal en hielo hasta que estén listas para usar.
Después de anestesiar al ratón, colóquelo en posición supina y mantenga la anestesia mediante la inhalación de una máscara de isoflurano vaporizado al 2%. Aplique povidona yodada con una gasa estéril y límpiela con etanol al 70%. Realice una pequeña incisión transversal en la piel y la pared muscular de la línea media inferior del abdomen con unas tijeras quirúrgicas estériles. Exponga la vejiga de la cavidad abdominal y apóyela con un hisopo de algodón empapado en solución salina.
Vuelva a suspender los gránulos de organoides en 80 microlitros de medio organoide que contenga un 50% de matriz de membrana basal de alta concentración e inyecte la suspensión en la cara anterior de la cúpula de la vejiga con la jeringa de insulina. Cierre la incisión con una sutura de nailon 4-0 y desinfecte el sitio quirúrgico con povidona yodada y etanol al 70%. Deje que el mouse se recupere bajo un irradiador infrarrojo durante 10 a 15 minutos. Luego, monitoree el mouse nuevamente hasta que recupere la conciencia.