Tinción de ADN extracelular: un método para identificar el ADN extracelular en secciones de tejido FFPE

Una célula moribunda libera una fracción de ADN fuera de la célula llamada ADN extracelular. Para teñir el ADN extracelular, comience tomando una sección de tejido fijada en formol e incluida en parafina, o FFPE, en un portaobjetos de vidrio. Caliente el portaobjetos de vidrio durante el tiempo deseado. Esto facilita la adhesión del tejido a la superficie del portaobjetos y suaviza la parafina circundante.

Sumerja el portaobjetos en líquido de desparafinación para disolver completamente la capa de parafina alrededor del tejido. A continuación, sumerja el portaobjetos en concentraciones decrecientes de etanol para rehidratar el tejido desparafinado. Después de la rehidratación, sumerja el portaobjetos en una solución de recuperación de antígenos hirviendo. Este tratamiento desenmascara los epítopos que fueron alterados durante el proceso de fijación.

Superponga el portaobjetos con anticuerpos primarios y permita que se unan a epítopos específicos sin enmascarar presentes en la célula. Luego, agregue anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, que se unen a los anticuerpos primarios. Sumerja el portaobjetos en una solución de Sudan Black para reducir la autofluorescencia de fondo.

Finalmente, coloque una gota de medio de montaje complementado con DAPI sobre la sección de tejido y séllela con un cubreobjetos. Incubar para permitir que las moléculas DAPI tiñan el ADN. Visualice la sección de tejido preparada con un microscopio de fluorescencia. Los epítopos marcados con fluorescencia en la célula ayudan a diferenciar el ADN nuclear presente dentro de la célula del ADN extracelular.

Para la tinción de ADN extracelular, primero, caliente las muestras de interés en la gradilla de portaobjetos a 60 grados Celsius durante 60 minutos antes de sumergir los portaobjetos en dos cambios de disolvente de 40 minutos en una campana extractora. Después de la segunda inmersión, rehidratar las muestras dos veces en etanol al 100% y una vez en etanol al 70% durante 5 minutos por tratamiento.

Después del último tratamiento, use pinzas para colocar los portaobjetos en una solución de recuperación de antígenos hirviendo en una olla a presión a temperatura alta durante 10 minutos. Después de desenmascarar los epítopos de antígenos, transfiera la olla a presión del fuego a un fregadero e inmediatamente deje correr agua fría del grifo sobre la tapa.

Deje que los portaobjetos se equilibren durante 20 minutos en la solución de recuperación de antígenos antes de lavar las muestras dos veces en PBS molar 0,01 en un agitador orbital durante 5 minutos por lavado. Después del segundo lavado, use un bolígrafo hidrofóbico para dibujar círculos alrededor de las muestras de tejido renal y bloquee cualquier tinción inespecífica con 60 microlitros de suero de pollo al 10% en albúmina de suero bovino al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, reemplace cuidadosamente la solución de bloqueo con 60 microlitros del anticuerpo primario de interés en una cámara de humedad durante la noche a 4 grados centígrados. A la mañana siguiente, lave los portaobjetos en un agitador orbital en PBS durante 2 minutos por lavado antes de agregar 60 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado a cada portaobjetos para una incubación de 40 minutos a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, lave los portaobjetos en PBS como se demuestra, seguido de un tratamiento con negro de Sudán al 0,3% en etanol al 70% para apagar cualquier posible autofluorescencia inducida por formalina. Después de 30 minutos, lave los portaobjetos con agua del grifo para eliminar cualquier precipitado y sumerja los portaobjetos en PBS durante 10 minutos para evitar la formación de precipitados de Sudan Black.

Al final de la incubación, monte los portaobjetos en cubreobjetos de vidrio confocales con gotas de 360 microlitros de solución de montaje complementada con DAPI y selle los cubreobjetos con esmalte de uñas. Deje que los portaobjetos se curen durante 24 horas a temperatura ambiente. Guárdelos a 4 grados centígrados protegidos de la luz hasta obtener imágenes mediante microscopía de barrido láser confocal de acuerdo con los protocolos estándar.