¿Por qué es importante la prueba de hipótesis nula para la validación de la diferenciación de podocitos?

La prueba de hipótesis nula es esencial para determinar si los cambios observados en las características de los podocitos se deben al protocolo de diferenciación o a variaciones aleatorias, lo que apoya una validación robusta de objetivos en la investigación renal.

¿Cómo encaja el aislamiento de la variable independiente en los protocolos de iPSC a podocitos?

Aislar variables como la composición del medio o el tiempo de incubación permite a los equipos atribuir los resultados de diferenciación específicamente a modificaciones del protocolo, mejorando la optimización y la reproducibilidad en la etapa de descubrimiento.

¿Qué permiten las mediciones cuantitativas de podocitos en los ensayos de nefrotoxicidad?

La evaluación cuantitativa de la morfología y viabilidad de los podocitos permite una comparación objetiva de los efectos de los compuestos, apoyando decisiones basadas en datos en la selección de nefrotoxicidad y el desarrollo de ensayos.

¿Por qué son fundamentales los requisitos de replicación para los estudios transversales de podocitos?

La replicación garantiza que la diferenciación de podocitos y los resultados de los ensayos sean consistentes entre diferentes equipos y experimentos, facilitando el intercambio confiable de datos y los esfuerzos colaborativos de investigación y desarrollo.

¿Qué capacidades de análisis estadístico son necesarias antes de la implementación del ensayo de podocitos?

Se requieren herramientas estadísticas robustas para analizar la eficiencia de diferenciación, la reproducibilidad de los ensayos y los efectos del tratamiento, asegurando que los datos obtenidos a partir de podocitos cumplan con los estándares empresariales de I+D para la toma de decisiones.

Derivación de podocitos renales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas: un procedimiento para la diferenciación dirigida de podocitos renales maduros a partir de células madre

JoVE Encyclopedia of Experiments

Investigación sobre el cáncer

0 vistas • 4:19 min • April 30th, 2023

Las células maduras se pueden reprogramar para recuperar su estado proliferativo e indiferenciado similar al de las células madre. Estas células reprogramadas se denominan células madre pluripotentes inducidas o IPSC. Para diferenciar las células pluripotentes en células especializadas en podocitos involucradas en la filtración de desechos de los riñones, comience tomando una suspensión de IPSC humanas en un medio de inducción de mesodermo.

Transfiera esta suspensión a una placa de cultivo recubierta de matriz basal e incube. La matriz basal facilita la adhesión de las IPSC en la base. Posteriormente, los factores específicos presentes en el medio inducen la diferenciación de las IPSC en las células del mesodermo, las células precursoras de los podocitos. Aspirar los medios gastados.

Complemente la placa con el volumen deseado de un medio de inducción de mesodermo intermedio e incube durante un período prolongado. Este paso conduce a la diferenciación de las células mesodérmicas en podocitos inmaduros. Reemplace los medios de inducción de mesodermo intermedios con una solución de tripsina para disociar las células adherentes de la placa.

A continuación, centrifugar para peletizar las células. Deseche el sobrenadante que contiene la solución de tripsina y los fragmentos de matriz. Vuelva a suspender el gránulo en un medio de inducción de podocitos. Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo recubierta fresca. Incubar para permitir el desarrollo de varias proyecciones en forma de pie a partir de células intermedias, lo que resulta en la formación de podocitos maduros.

Después del recuento, vuelva a suspender las células a 1 por 10 a las quintas células por mililitro de concentración del medio de inducción de mesodermo y aspire la solución de matriz extracelular de las placas recubiertas de matriz de membrana basal 2. Enjuague las placas dos veces con medio tibio y mezcle la suspensión de células madre pluripotentes inducida por humanos con un pipeteo suave.

Agregue 1 mililitro de células a cada pocillo de las placas de 12 pocillos recubiertas de 2 pocillos de la matriz de la membrana basal y agite suavemente las placas para distribuir las células de manera más uniforme. Luego, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular. En los días 2 a 15 de la diferenciación, reemplace el medio de inducción de mesodermo con 1 mililitro de medio de inducción de mesodermo intermedio por pocillo.

Si se observa un crecimiento celular sustancial y un rápido agotamiento de los nutrientes, como lo indica el amarilleo del medio, el volumen del medio de diferenciación del mesodermo intermedio se puede aumentar a 1,3 mililitros por pocillo. El día 16 de cultivo, enjuague las células intermedias del mesodermo con medio tibio e incube las células con 500 microlitros de tripsina-EDTA al 0,05% por pocillo durante 3 minutos a 37 grados centígrados.

Cuando las células comiencen a disociarse, raspe las células con un elevador de células y mezcle suavemente las células mediante pipeteo. Detenga la reacción con aproximadamente 2 mililitros de solución neutralizante de tripsina por pocillo y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros. Lleve el volumen a 50 mililitros con medio y recoja las células por centrifugación.

Vuelva a suspender el medio de inducción de gránulos y podocitos a 1 veces 10 a las quintas células por mililitro de concentración de medio y agregue las células a las placas recubiertas de matriz de membrana basal 2. Luego, agite suavemente la placa para ayudar a distribuir las células de manera más uniforme y colóquelas en la incubadora hasta por 5 días.