Aislamiento de células de músculo liso detrusor: un procedimiento de digestión enzimática para obtener células DSM a partir de muestras de vejiga urinaria humana

Las células del músculo liso detrusor, o DSM, presentes dentro de la pared de la vejiga urinaria constituyen la unidad funcional primaria de la vejiga. Estas células se relajan para facilitar el almacenamiento de orina en la vejiga y se contraen para liberar la orina.

Para aislar las células del DSM, comience tomando una muestra de vejiga urinaria humana recolectada. Lave la muestra para eliminar cualquier rastro de sangre y escombros. Posteriormente, asegure el tejido con su superficie mucosa hacia arriba. Extirpe la grasa, los vasos sanguíneos y la capa mucosa para exponer la capa muscular detrusor subyacente. Luego, corte el tejido libre de mucosa en pequeños fragmentos.

Trate los fragmentos de tejido con un cóctel de digestión que contenga papaína e incube. La papaína, una enzima proteolítica, promueve la digestión de proteínas en la matriz extracelular que mantienen unidas las células e inicia el aflojamiento de las células en la matriz. Ahora, retire el sobrenadante que contiene papaína.

Agregue la suspensión de la enzima colagenasa a los fragmentos de tejido e incube a temperatura fisiológica. La colagenasa descompone la matriz extracelular y facilita la disociación de las células DSM. La incubación a temperatura fisiológica ayuda a preservar la integridad celular de DSM. Deseche el sobrenadante que contiene colagenasa.

Lave los fragmentos de tejido con un tampón helado para eliminar cualquier enzima residual. A continuación, vuelva a suspenderlos en el búfer. Triture suavemente los fragmentos de tejido tratados con enzimas para asegurar la disociación completa de las células no liberadas y obtenga una suspensión unicelular de células DSM. Almacene las celdas DSM a bajas temperaturas hasta su uso posterior.

Comience examinando la muestra de vejiga urinaria de espesor completo. Fije la muestra, con la mucosa hacia arriba y la serosa hacia abajo, en un plato redondo de 150 milímetros recubierto de enantiómero de silicona lleno de DS helado, y retire con cuidado toda la mucosa mediante una disección aguda.

Corta varias piezas de músculo liso detrusor sin mucosa o DSM. Coloque de 3 a 6 piezas de DSM en un tubo con 1 a 2 mililitros de DS precalentado que contenga papaína y ditiotreitol o DS-P. Incube a 37 grados centígrados durante 30 a 45 minutos, asegurándose de agitar el tubo cada 10 a 15 minutos.

Después de la incubación, retire el DS-P del tubo y lave brevemente las piezas de DSM con DS helado. Transfiera el DS con piezas DSM a un tubo nuevo y retire el DS, dejando las piezas DSM en la parte inferior del tubo. Agregue de 1 a 2 mililitros de DS que contenga colagenasa tipo II o DS-C al tubo e incube a 37 grados Celsius con agitación ocasional.

Deseche el DS-C y lave las piezas de DSM tratadas con enzimas de 5 a 10 veces con DS helada. Después del último lavado, deje el DS dentro del tubo y triture suavemente las piezas con una pipeta Pasteur pulida al fuego para liberar células DSM individuales.