JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 2:42 min • April 30th, 2023
Los esferoides cancerosos son agregados celulares tridimensionales de células tumorales. Estos esferoides pueden incrustarse en la matriz de colágeno, lo que da como resultado la formación de bloques esferoides. Para congelar rápidamente un bloque esferoide, comience colocando un bloque esferoide de gel de colágeno en el centro de un molde histológico.
Enjuague el bloque con un tampón adecuado y complemente el molde con una solución fijadora. Incubar para permitir que esta solución penetre en los esferoides y reticular las proteínas celulares. Este paso ayuda a mantener la estructura esferoide para el procedimiento posterior. A continuación, aspire la solución fijadora.
Coloque el bloque de gel esferoide en un molde de histología nuevo que contenga una capa delgada de medio de inclusión. Cúbralo con más medio de incrustación para sumergir completamente el bloque esferoide. Finalmente, sumerja el molde en un baño de nitrógeno líquido durante un corto período de tiempo.
La congelación rápida evita la formación de cristales de hielo más grandes dentro de los esferoides. Ayuda a retener la integridad del esferoide sin causar daños mecánicos. Una vez que la capa media de incrustación se solidifique alrededor del bloque esferoide, retire el bloque congelado del molde. Almacene el bloque de esferoides congelado a bajas temperaturas para un análisis histológico posterior.
Primero, use pinzas pequeñas para levantar el bloque de gel de colágeno y esferoides del portaobjetos de la cámara. Luego, coloque el bloque de gel de colágeno en un molde de histología de plástico. Enjuague brevemente el bloque de gel de colágeno con 1X PBS y fíjelo con PFA al 4% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, lave el bloque de gel de colágeno con 1,5 mililitros de 1X PBS en una coctelera durante 15 minutos.
Aplique una capa delgada de compuesto OCT en el fondo de un nuevo molde de histología de plástico. Luego, coloque el bloque de gel de colágeno fijado y lavado encima del compuesto OCT antes de llenar cuidadosamente el resto del molde con compuesto OCT. Mantenga el molde a 4 grados centígrados durante 1 hora. Después de esto, congele rápidamente el molde en una placa de Petri de 100 milímetros que flote sobre nitrógeno líquido y almacene las muestras a menos 80 grados centígrados.