Aislamiento de exosomas: una técnica de ultracentrifugación basada en la densidad que utiliza un cojín de sacarosa para separar exosomas de medios acondicionados de células cultivadas

Los exosomas, vesículas unidas a la membrana de tamaño nanométrico que transportan biomoléculas funcionales, son secretados activamente por la mayoría de los tipos de células y pueden aislarse de sobrenadantes de cultivo celular in vitro. Para aislar los exosomas, primero, coseche el sobrenadante o el medio condicionado de un cultivo celular de interés. Los medios acondicionados contendrían exosomas, proteínas, desechos celulares y vesículas.

Centrifugar el medio para granular los desechos celulares. Recoja el sobrenadante que contiene exosomas y fíltrelo a través de filtros celulares para eliminar las vesículas más grandes. Transfiera un volumen específico del medio filtrado a un tubo nuevo. A continuación, mezcle las concentraciones adecuadas de sacarosa y óxido de deuterio para preparar un cojín de sacarosa, un gradiente discontinuo de sacarosa.

Agregue un volumen específico de la solución de cojín de sacarosa en el tubo que contiene el medio; la solución forma una capa separada en la parte inferior. Ahora, centrifuga el tubo a alta velocidad. El cojín de sacarosa facilita la migración de exosomas del medio a la solución de sacarosa mientras mantiene la integridad del exosoma. Los contaminantes proteicos de alta densidad ocupan la interfaz entre la solución de sacarosa y el medio.

Transfiera con cuidado la fracción principal de la capa de sacarosa que contiene exosomas a un tubo nuevo con un tampón adecuado. Centrifugar a alta velocidad para obtener un pellet de exosomas purificados. Deseche el sobrenadante que contiene sacarosa junto con cualquier contaminante proteico. Vuelva a suspender el gránulo del exosoma en tampón y guárdelo a bajas temperaturas hasta su uso posterior.

Para limpiar previamente el medio acondicionado recolectado, centrifugarlo a 500 x g durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche el gránulo. Después de repetir este paso de centrifugación con el sobrenadante recuperado, recupere el sobrenadante nuevamente y deseche el sedimento.

Luego, centrifugar el sobrenadante recuperado a 2.000 x g durante 15 minutos y 4 grados centígrados. Guarde el sobrenadante y deseche el gránulo. Filtre el sobrenadante una vez a través de un filtro de 0,22 micrómetros conectado a una jeringa de 20 mililitros en un tubo de centrífuga nuevo.

Mientras tanto, para preparar una solución de sacarosa al 25% en óxido de deuterio, pese con precisión 1,9 gramos de sacarosa en un tubo universal. Luego, agregue óxido de deuterio hasta que el peso alcance los 7,6 gramos. Luego, llene un tubo de ultracentrífuga con 22,5 mililitros de medio acondicionado previamente autorizado.

Coloque una pipeta de vidrio en el tubo. Agregue 3 mililitros de solución de sacarosa a través de la pipeta para que la solución forme una capa separada debajo del medio acondicionado. Coloque con cuidado el tubo que contiene una solución de sacarosa media acondicionada en capas en el balde de un rotor basculante.

Asegure el cucharón en el rotor. Coloque el rotor en la ultracentrífuga y gírelo 100,000 x g a 4 grados Celsius durante 1.5 horas. Recoja 2 mililitros de la capa de sacarosa del tubo, 1 mililitro a la vez, usando una pipeta P1000 con su punta unida a una punta de 10 microlitros y agréguela a una botella de ultracentrífuga que contenga 20 mililitros de PBS filtrado para lavar.

Coloque el tubo en un rotor de ángulo fijo y centríquelo a 100,000 x g a 4 grados Celsius durante 1.5 horas. Utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para eliminar con cuidado el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet con 400 microlitros de PBS filtrado.