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Para aislar las células epiteliales tubulares renales o TEC, comience tomando un riñón de ratón recién aislado en una placa de Petri. Despegue la cápsula renal, la capa externa delgada que rodea el riñón, y retire la médula o la parte más interna del riñón, dejando la corteza que contiene el túbulo y las células epiteliales tubulares.
Pica las partes restantes del riñón en trozos pequeños e incuba en un tampón de digestión caliente que contenga la enzima colagenasa. La colagenasa descompone la proteína de colágeno que mantiene unidos los tejidos renales, liberando los túbulos renales y las células renales en suspensión.
Filtre la suspensión para eliminar los tejidos renales no digeridos. A continuación, agregue medios de cultivo preenfriados al filtrado. La temperatura más baja neutraliza la colagenasa y detiene la digestión de los tejidos. Centrifugar el filtrado a baja velocidad para permitir que los túbulos más densos y las células tubulares se asienten mientras otros tipos de células e impurezas permanecen suspendidos.
Elimine esta fracción de sobrenadante no deseada y agregue medios de cultivo para volver a suspender el sedimento. Sembrar la suspensión en una placa de cultivo recubierta de colágeno e incubar. Las células tubulares libres se adhieren firmemente al colágeno mientras que los túbulos permanecen suspendidos. Subcultivo para eliminar los túbulos sueltos y obtener el cultivo primario de células epiteliales tubulares.
Para procesar los riñones extraídos, primero, retire las cápsulas renales y la médula. Luego, pique ambos riñones en trozos pequeños e incube en 10 mililitros de un tampón de digestión en un horno a 37 grados centígrados con rotación suave durante 5 minutos.
Después de la digestión, elimine los tejidos no digeridos pasando el tampón a través de un filtro de 70 micras. Después de recolectar el tejido digerido, agregue 10 mililitros de medios de cultivo para detener la digestión. A continuación, centrifugar la suspensión de tejido filtrado a 50 x g durante 5 minutos para granular las células tubulares. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo, agregue 5 mililitros de medio de cultivo y repita la centrifugación para recolectar las células tubulares restantes.
Ahora, vuelva a suspender el primer gránulo en 20 mililitros de medio de cultivo y centrifugue a 50 x g durante 5 minutos para purificar aún más las células recolectadas. Deseche el sobrenadante. Luego, vuelva a suspender ambos gránulos en 10 mililitros de medio de cultivo. A continuación, cuente las células vivas mediante tinción con azul de tripano. Luego, siembre hasta 10 millones de células en un plato recubierto de colágeno de 60 milímetros y deje que las células tubulares se adhieran durante la noche.