Análisis de expresión de proteínas basado en matrices de proteínas de fase inversa: un procedimiento para la cuantificación simultánea de la expresión de múltiples proteínas a partir de lisado celular

Una muestra tumoral contiene una población heterogénea de proteínas. Usando lisado tumoral, se pueden analizar varias proteínas de este tipo en paralelo para identificar la proteína de interés. Esta técnica de alto rendimiento se denomina matrices de proteínas de fase inversa o RPPA.

Para realizar RPPA, comience tomando un portaobjetos de vidrio de inmunoensayo recubierto con nitrocelulosa. Detecte una variedad de proteínas lisadas de tumores en el portaobjetos. Incubar para permitir la captura de proteínas en nitrocelulosa. Posteriormente, trate el portaobjetos con un tampón de bloqueo que bloquee los sitios de unión de anticuerpos no específicos en las proteínas.

Retire el exceso de solución de bloqueo. Ahora, monte el portaobjetos recubierto de proteína en un soporte y séllelo herméticamente. Esto crea pozos temporales sobre la superficie del portaobjetos. A continuación, cargue los pocillos con una solución de anticuerpos primarios. Estos anticuerpos reconocen los epítopos presentes en el objetivo correspondiente de una mezcla de proteínas en la matriz.

Finalmente, agregue anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia. Estos anticuerpos se unen a los anticuerpos primarios preunidos formando un complejo. Lave el portaobjetos para eliminar cualquier anticuerpo secundario no unido. Desabrocha la corredera del soporte y deja que se seque al aire.

Escanee el portaobjetos con un escáner fluorescente. Las proteínas diana marcadas con anticuerpos emiten fluorescencia en una longitud de onda específica y aparecen como manchas de colores en la superficie del portaobjetos.

Antes de la impresión RPPA, se realiza una serie de cinco diluciones dobles a partir de cada muestra. Uno de los aspectos que más tiempo consume de este procedimiento es hacer cientos de diluciones. Se puede asegurar un resultado exitoso verificando dos veces antes de imprimir portaobjetos.

Luego se utiliza un observador robótico MicroGrid II para detectar lisados de proteínas en portaobjetos de vidrio recubiertos de nitrocelulosa. Cada muestra se detecta por triplicado, lo que da como resultado un total de 15 manchas por muestra. Los portaobjetos utilizados en este experimento contienen dos almohadillas en las que se detectan las muestras. Cada almohadilla fue detectada con muestras idénticas, en este caso, 100 muestras. Otros formatos disponibles incluyen diapositivas de 1, 8 y 16 almohadillas. Cuanto mayor sea el número de almohadillas, menor será el número de muestras que se pueden detectar en cada una.

Para comenzar el procedimiento de detección de proteínas, humedezca los portaobjetos en exceso de tampón de bloqueo e incube a temperatura ambiente durante 1 hora en una plataforma oscilante. Prepare 800 microlitros de anticuerpos primarios en tampón de bloqueo a las concentraciones deseadas y manténgalos en hielo. Después de la incubación de una hora en el tampón de bloqueo, monte los portaobjetos en el clip de viruta de un solo bastidor o en el soporte de portaobjetos de cuatro bahías FastFrame para que se forme un sello hermético entre el portaobjetos y la cámara de incubación.

Retire el tampón residual de los pocillos y agregue 600 microlitros de anticuerpo primario a los pocillos respectivos. Coloque los portaobjetos y la cámara en una caja húmeda sellada e incube en una plataforma oscilante durante la noche a 4 grados centígrados. A la mañana siguiente, retire los portaobjetos de la cámara frigorífica. Retire con cuidado los anticuerpos primarios de cada pocillo. Agregue 600 microlitros de PBS-Tween20 o PBS-T al 0,1% y lave los portaobjetos en una plataforma oscilante a temperatura ambiente durante 5 minutos.

Reemplace el PBS-T con PBS-T nuevo. De esta manera, el lavado se desliza un total de tres veces. Retire el tampón de los pocillos y agregue 600 microlitros de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia en la dilución adecuada a los pocillos respectivos. Incubar con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 45 minutos agitando suavemente. Es importante proteger la membrana de la luz hasta el momento en que se escanea. Después de 45 minutos, retire los anticuerpos secundarios de los pocillos y lávelos brevemente tres veces en 600 microlitros de PBS-T a temperatura ambiente.

Retire los portaobjetos del portador, transfiéralos a un recipiente adecuado y lávelos con exceso de PBS-T durante 15 minutos, manteniendo la membrana en la oscuridad. Retire el PBS-T y lave la membrana con PBS a temperatura ambiente durante 15 minutos para eliminar el Tween20 residual, manteniendo nuevamente la membrana en la oscuridad. Seque los Fastslides en un horno a 50 grados centígrados durante 10 minutos. Finalmente, escanee los portaobjetos a 680 nanómetros y / o 800 nanómetros, según los anticuerpos secundarios utilizados.