Aspiración de líquido de glomérulos de ratón: un método para aspirar líquido glomerular de ratón mediante micropunción mediada por dos fotones

En el riñón, el glomérulo, un haz de pequeños vasos sanguíneos encerrados en la cápsula de Bowman, inicia la filtración de sangre y expulsa el líquido de desecho al espacio circundante de Bowman. La investigación del contenido del líquido glomerular ayuda a comprender la fisiología renal.

Para aspirar el líquido glomerular, prepare un ratón anestesiado con su riñón exteriorizado quirúrgicamente. Ahora, inyecte un tinte fluorescente de dextrano en los vasos sanguíneos detrás de la órbita del ojo del ratón. Las moléculas fluorescentes de dextrano se mueven a través del torrente sanguíneo y llegan al riñón.

Debido al alto peso molecular del dextrano, el tinte fluorescente se retiene dentro del glomérulo, dándole un color verde. Bajo un microscopio de dos fotones, que permite la visualización de estructuras profundamente asentadas, localice un glomérulo adecuado para obtener un acceso adecuado al líquido glomerular.

A continuación, alinee una punta de micropipeta recubierta de nanopartículas fluorescentes rojas con el eje lateral del riñón. Con un micromanipulador, avance la punta de la pipeta para penetrar en el riñón. A medida que la punta alcanza el glomérulo objetivo, establezca la tasa de aspiración deseada para aspirar el líquido glomerular del espacio de Bowman.

La ausencia de fluorescencia verde dentro de la punta roja de la pipeta indica la falta de sangrado y confirma la aspiración exitosa de líquido glomerular. Posteriormente, retraiga la pipeta y almacene el líquido en un tampón adecuado para su posterior análisis.

Después de confirmar una falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, aplique ungüento en los ojos y use cinta adhesiva para inmovilizar las extremidades de un ratón adulto de 20 a 25 gramos. Use una crema depilatoria para eliminar todo el vello del lado izquierdo del animal y use el bazo para ubicar el riñón izquierdo a través de la piel en el lado dorsal y caudal del bazo.

Haga una incisión de 0,5 centímetros en la piel, seguida de una incisión más pequeña en el peritoneo, lo suficientemente grande como para empujar el riñón. Extruya el riñón con una presión suave y coloque una forma estabilizadora renal de polisiloxano alrededor del tejido. Alinee el riñón con el espaciador de modo que la superficie más lateral del riñón se extienda más allá del estabilizador en aproximadamente 1 milímetro y fije el riñón a la forma con adhesivo de cianoacrilato. Pegue una placa de cabeza a la forma del estabilizador y monte la placa de cabeza en las barras de montaje de la placa base.

A continuación, llene el pocillo en el soporte de polisiloxano con una solución de agarosa al 1% y sostenga un cubreobjetos de 10 milímetros en la parte superior del molde hasta que la agarosa esté firme. Selle el cubreobjetos a la placa de la cabeza con pegamento y cree un anillo alrededor del cubreobjetos con cemento dental. Luego, inyecte de 100 a 150 microlitros de FITC-dextrano retroorbitalmente y mueva rápidamente el mouse y la placa de fijación a la platina del microscopio de dos fotones.

Después de enfocar manualmente la superficie del riñón, cambie al modo de dos fotones sin escaneo y explore la ventana de imágenes para localizar un glomérulo objetivo que esté a más de 30 micrómetros por debajo del cubreobjetos y a menos de 400 micrómetros de la cápsula renal lateral. Registre la distancia lateral y vertical al glomérulo objetivo. Luego, registre las coordenadas de la etapa x, y y z para el glomérulo y, por último, eleve el punto focal del objetivo aproximadamente 1 milímetro en la columna de agua sin cambiar las coordenadas de la etapa x e y.

Introduzca la punta de la pipeta en la columna de agua y encienda la excitación DAPI. Mueva la pipeta en las dimensiones X e Y hasta el punto de máxima fluorescencia de la punta. Este será el centro del objetivo. Cambie la configuración de excitación a proteína fluorescente roja y visualice la pipeta con el ocular para permitir un centrado preciso en la vista ocular.

Vuelva a cambiar a dos fotones para encontrar la pipeta debajo de la vista de dos fotones en vivo y coloque la punta con precisión en el centro de la imagen. Esta es la posición de registro. A continuación, guarde una imagen de la pipeta y registre la platina y las coordenadas del controlador de micropipetas. Retire la pipeta de la columna de agua en el eje x sin mover los ejes y y z, y mueva la pipeta Z a la coordenada Z del glomérulo objetivo y al borde del riñón.

Anote la etapa X y calcule la pipeta del borde del riñón X utilizando el desplazamiento de la etapa de registro, X. Aumente la etapa X para mover la platina hacia la pipeta hasta que el borde del riñón esté muy a la izquierda de la pantalla mientras permanece visible. Avance rápidamente la pipeta a unos 100 micrómetros de distancia de la pipeta X del borde del riñón como se acaba de calcular. Aumente la ganancia roja y comience a avanzar la punta de la pipeta lentamente hasta el borde del riñón bajo imágenes de dos fotones en vivo mientras monitorea el histograma de píxeles rojos.

Conduzca la pipeta en el eje x lentamente hasta la pipeta diana X del glomérulo, vigilando la etapa X. Al llegar al glomérulo, documente la posición con una pila Z. Con la pipeta en posición, configure la microbomba para inyectar 100 nanolitros de perfluorodecalina durante 2 minutos para garantizar la permeabilidad de la pipeta y reducir la confusión por el taponamiento de la pipeta durante la entrada. Después de 4 a 6 minutos de filtración, configure la microbomba para aspirar hasta 300 nanolitros a una velocidad de hasta 50 nanolitros por minuto.