Name: Aislamiento de células inmunes funcionales cardíacos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprende a aislar células inmunes cardíacas funcionales mediante lavado pericárdico con HBSS en ratas, evitando la activación enzimática. Este método preserva la respuesta celular para análisis de citometría de flujo y ensayos funcionales.

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Este trabajo fue apoyado por un UNCF-Merck Postgrado de Investigación en Ciencias de Becas Tesis (JLM), Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de subvenciones del Instituto SR1-HL-62228 (JSJ) y RO1 HL-073.990-(JSJ).

1. Preparación de la solución de Hanks balance de sal (HBSS) <ol><li> Autoclave un vaso de vidrio L, 1000 ml cilindro graduado, y una barra de agitación. </li><li> Reconstituir la solución en polvo HBSS en el autoclave un vaso de vidrio L hasta la marca de 900 ml con agua destilada. </li><li> Mezcle la solución HBSS con 3,4 g de sal de Na + Hepes y ajustar el pH a un valor entre 7.35 a 7.41 utilizando HCl concentrado o NaOH. </li><li> Una vez que el pH deseado se ha alcanzado y se mantiene estable, añadir 5 g de albúmina de suero bovino para la solución a temperatura ambiente hasta que la albúmina se disuelva por completo. </li><li> Añadir 10 ml de agua destilada con antibióticos, antimyotic, a la solución y hasta que doble el volumen total es de 1000 ml de la marca. </li><li> Mezcle bien la solución. </li><li> Filtrar la solución HBSS y separarla en 50 ml tubos Falcon para su uso posterior. Tubos adicionales se pueden congelar y usar en una fecha posterior. </li></ol> 2. Animal PREPARACIÓn - La inserción del tubo traqueal <ol><li> Preparar una bandeja con los instrumentos necesarios y material para la inserción de un tubo traqueal (es decir, pinzas, tijeras, tubos traqueales, 3-0 negro sutura trenzada, ventilador de pequeños animales, etc.) </li><li> Una vez que la rata está completamente anestesiado con un cóctel de ketamina / xilazina en la proporción de 2 a 1 la ketamina xilazina, afeitarse el abdomen, el pecho y la garganta de la rata. Para asegurarse de que un profundo estado anestésico que se ha logrado, una pizca pie de la rata y la verificación de la retirada del pedal de la extremidad. Asegúrese de que la rata está profundamente anestesiado antes de hacer las incisiones. </li><li> Lugar a la rata con la cabeza erguida sobre una tabla de cortar que se inclina en un ángulo de 30 ° </li><li> Haga una incisión en la piel de la mitad del abdomen por debajo de la mandíbula inferior. Diseccionar los músculos del triángulo anterior del cuello para exponer la tráquea. </li><li> Coloque un 3-0 sutura trenzada negro en la tráquea. </li><li> Hacer una incisión en la tráquea entre los anillos cartilaginosos und insertar el tubo traqueal. Ate la sutura firmemente para asegurar el tubo traqueal en la tráquea. </li><li> Conecte el tubo traqueal a un ventilador de pequeños animales. </li></ol> 3. Instrumento de preparación para el aislamiento de células inmunes <ol><li> Preparar una bandeja con los instrumentos para el procedimiento de celda de aislamiento inmunológico (es decir, pinzas, tijeras, HBSS, recortado blandas teflón calibre 24 Baxter intravascular sobre la aguja rápida-cath) </li><li> Preparar dos jeringas de 10cc, llenar una jeringa con HBSS para introducir el tampón en el saco pericárdico y reservar el otro para aspirar las células HBSS que contiene. 3.2.1. Reducir la punta de teflón del calibre 24 Baxter intravascular sobre la aguja rápido cateterismo (1,6 cm) por 1 / 2 a 3 / 4 de su longitud original para el procedimiento de aislamiento. </li><li> Coloque todas las jeringas, tampones, y un vacío de 15 ml tubo Falcon (para mantener el líquido extraído una vez haya finalizado el procedimiento) en el hielo. </li></ol> &lt;P CLASS = "jove_title"&gt; 4. Aislamiento de células inmunes <ol><li> Haga una incisión en la pared abdominal (a lo largo de la línea alba) hasta llegar a la apófisis xifoides. </li><li> A partir ligeramente lateral a la apófisis xifoides, hacer incisiones bilaterales a través de la caja torácica continua en un ángulo hacia la axila. Tenga cuidado de no perforar los pulmones, el corazón o pericardio. </li><li> Una vez que las incisiones a ambos lados del esternón se completa, diseccionar el diafragma de las costillas inferiores, de corte lateral a medial. Nota: Tenga siempre consciente de que el pericardio se conecta con el esternón y el diafragma para evitar daños. Utilice el ligamento falciforme como un hito tener en cuenta que el pericardio se adjunta en el lado opuesto del diafragma. Además, si el pericardio se corta, la capacidad de aislar las células se pierde. </li><li> Con cuidado, levante un lado de la caja torácica para exponer la cavidad torácica y el corazón (encapsuladas por el pericardio).</li><li> Tome la jeringa llena de HBSS y encontrar un punto en el saco pericárdico aproximadamente a medio camino entre el esternón y el corazón (de preferencia más rostral del caudal) e inserte la punta de teflón de la acorta rápido cateterismo a través de las dos capas del pericardio. </li><li> Una vez que el catéter está en su lugar, proceder con cuidado llenar el espacio pericárdico con 2 a 3 ml de solución tampón HBBS. Usted sabrá de inmediato si el catéter está bien colocado cuando se observa el espacio pericárdico en expansión. Si no es testigo de relleno, retirar y volver a colocar el quick-cath. </li><li> Cuando el saco pericárdico se llena, tome la jeringa de 10 cc demás y coloque la punta de nuevo en el pericardio y comenzar a aspirar el buffer. El orificio de entrada puede utilizar el mismo u otro puede ser creado. Asegúrese de que la punta no se acercan demasiado a las paredes del saco pericárdico, mientras que proporciona la succión, especialmente en la parte inferior del corazón. Esto podría conducir a la perforación del saco pericárdico y la pérdida de células que contienen célulass. </li><li> Mientras se aspira el tampón, la punta del catéter se puede mover en el interior del saco pericárdico con el fin de recoger de amortiguación tanto como sea posible. </li></ol> Nota: En caso de hacerlo, un poco romper el pericardio y haga un hoyo en la parte superior del corazón más grande que el agujero original, no se preocupe. Siempre y cuando el pericardio rodea todavía lo suficiente del corazón aún puede realizar otro lavado sobre el corazón, aunque con una menor cantidad de buffer. Para la recolección de una cantidad óptima de las células, de tres a cuatro lavados se necesitan. <ol start="9"><li> Coloque el buffer se extrae en los tubos Falcon que se colocaron en hielo. </li><li> Quitar el corazón, los pulmones y / o cualquier otro tejido, si es necesario para estudios posteriores. Después de la recolección de células del sistema inmune y otros tejidos, la rata debe ser rápido y la eutanasia humanitaria. </li><li> Centrifugar las muestras recogidas inmune celular durante 10 minutos a 200 gramos a 4 ° C. Siempre mantener los tubos en hielocuando no esté en uso. </li><li> Eliminar el sobrenadante y reconstituir el precipitado en 1 ml de tampón de Hyclone o HBSS. </li></ol> Nota: Es importante tener en cuenta el número de células del sistema inmune obtenidas de cada corazón después del procedimiento celda de aislamiento inmunológico. 5. Los resultados representativos: Un ejemplo de los mastocitos aislados cardíaca obtenidos con esta técnica y se tiñeron con azul de toluidina y safranina O / azul alcián se presentan en las figuras 2A y 2B, respectivamente. Como se puede observar en la Figura 3, el mástil cardiaco, mantiene su capacidad de liberación de histamina después del tratamiento con activadores conocidos como compuesto 48/80 y la sustancia P como se describe en Morgan et al. 9 diagramas de dispersión Representante de la citometría de flujo de células CD4 + y las células CD8 + se presentan en las figuras 4 y 5, respectivamente. Los linfocitos T son más identificados y fenotipo en una población de células de esta técnica. Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento cardíaco el aislamiento de células inmunes. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig2.jpg"> . Imágenes de la figura 2 histológico representante de los mastocitos cardiaca se tiñen de la siguiente manera: (A) con azul de toluidina y (B) son safranina O / azul Alcian. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig3.jpg"> Figura 3. Estudio funcional de las células cardiacas del mástil aislado de la región epicárdica del miocardio y estimuladas con compuesto 48/80 (10μg/mL) y la sustancia P (10μM). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig4.jpg"> Figura 4. Representante de flujo de citometría de diagramas de dispersión de las células CD4 + aisladas células marcadas con la sustancia P (1:100 dilution). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig5.jpg"> Figura 5. Citometría de flujo Representante de CD8 + aisladas células marcadas con la sustancia P (dilución 1:100).

<ol><li>Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+and+effect+relationship+between+myocardial+mast+cell+number+and+matrix+metalloproteinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).</li>
<li>Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+inhibition+of+mast+cell+degranulation+prevents+left+ventricular+remodeling+induced+by+chronic+volume+overload+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Failure%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats.</a> Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).</li>
<li>Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mast+cell-mediated+activation+of+gelatinase+and+alteration+of+ventricular+diastolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).</li>
<li>Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+adverse+myocardial+remodeling+secondary+to+chronic+volume+overload+in+mast+cell+deficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).</li>
<li>Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Mast+Cells+Mediate+Left+Ventricular+Fibrosis+in+the+Hypertensive+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat.</a> Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).</li>
<li>Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+pro-inflammatory+cytokine+production+and+peritoneal+macrophage+function+in+rats+with+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure.</a> Cytokine. 34, 284-290 (2006).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+Cells%3A+Versatile+regulator+of+inflammation%2C+tissue+remodeling%2C+host+defense+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis.</a> Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).</li>
<li>Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression+of+inflammatory+cytokines+and+activation+markers+in+T-cells+from+patients+with+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).</li>
<li>Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologically+Relevant+Concentrations+of+Tumor+Necrosis+Factor-%C9%91+Promote+Progressive+Left+Ventricular+Dysfunction+and+Remodeling+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats.</a> Circulation. 97, 1382-1391 (1998).</li>
<li>Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+Cardiac+Mast+Cells+Degranulate+and+Release+Preformed+TNF-%C9%91%2C+Initiating+the+Cytokine+Cascade+in+Experimental+Canine+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion.</a> Circulation. 98, 699-710 (1998).</li>
<li>Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+inhibition+attenuates+adverse+myocardial+remodeling+in+a+rat+model+of+volume+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).</li>
<li>Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+histamine+secretion+during+isolation+of+rat+cardiac+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells.</a> Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).</li>
<li>Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+nervous+system+modulation+of+inflammation+and+remodeling+in+the+hypertensive+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart.</a> Hypertension. 55, 270-276 (2010).</li>
<li>Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+isolating+functional+mast+cells+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">A novel technique for isolating functional mast cells from the heart.</a> Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Este método de aislamiento de las células inmunes cardíaco permite el análisis de su función, el fenotipo, y su vencimiento sin que la activación no deseada que se produce normalmente durante la tradicional técnica enzimática aislamiento digestión. La media del número total de células que se obtienen con esta técnica es de alrededor de 400.000 por el corazón de rata, y tinción diferencial y el análisis de citometría de flujo de estas células indica población mixta de linfocitos T (~ 70%), los macrófagos (~ 12%) y las cé...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de los reactivos y equipos </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Salina equilibrada de Hanks </td><td> Sigma </td><td> H4891 </td><td> Una botella hace un balance de la sal L Hanks Solución. Sal reconstituir Hanks &#39;Balance Solución como parte del procedimiento. </td></tr><tr><td> Antibióticos Antimyotic </td><td> Gibco </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3784 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> 250 ml Nalogene filtro de botella </td><td> Thermoscientific </td><td> 157-0020 </td><td></td></tr><tr><td> 12 N HCL </td><td> Fisher Scientific </td><td> CAS 7647-01-0 </td><td> De 6 N, agregar volúmenes iguales de HCL a desionizadael agua. </td></tr><tr><td> 10 N NaOH </td><td> Fisher Scientific </td><td> SC267 </td><td> De 5 N, agregar volúmenes iguales de NaOH al agua desionizada. </td></tr><tr><td> El agua destilada </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla de Equipos: <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de los reactivos y equipos </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 3-O sutura de seda trenzada </td><td> Ethicon Productos </td><td> SA64H </td><td></td></tr><tr><td> Ventilador de Pequeños Animales </td><td> CWE Incorporated </td><td> SAR-830 </td><td> Ajuste la frecuencia respiratoria a 40,5 respiraciones por minuto. </td></tr><tr><td> Bisel calibre 18 agujas </td><td> BD Biosciences </td><td> 305199 </td><td> Trim aguja de 1 / 2 a 3 / 4 de su longitud original para su uso como un tubo traqueal. </td></tr><tr><td> Consejo de teflón (con aguja retirado) de calibre 24, Baxter rápido cateterismo catéter </td><td> Baxter </td><td> 2N111 </td><td> Reducir la longitud de la punta de teflón de 1 / 2 a 3 / 4. </td></tr><tr><td> Jeringa de 10 cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 a 823-16B </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos Falcon </td><td> BD Biosciences </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RT6000B centrífuga refrigerada </td><td> Fisher Scientific </td><td> 75-004-377 </td><td> Recuerde que antes de enfriar y mantener a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Hyclone </td><td> Thermoscientific </td><td> S300030.02 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> Hausser Científico </td><td> HS-LB-1483 </td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células inmunes funcionales cardíacos

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiaco las células inmunes están ganando interés por el papel que desempeñan en el remodelado patológico de muchas enfermedades cardíacas 1-5 Estas células inmunes, que incluyen los mastocitos, las células T y los macrófagos,. Almacenar y liberar una variedad de mediadores biológicamente activos, incluyendo citoquinas y proteasas como la triptasa. 6-8 Estos mediadores han demostrado ser jugadores clave en el metabolismo de la matriz extracelular mediante la activación de metaloproteinasas de la matriz o causar la acumulación de colágeno mediante la modulación de la función de los fibroblastos cardíacos. 9-11 Sin embargo, las técnicas disponibles para el aislamiento de las células inmunes tienen cardiaca sido problemático debido a que utilizan la colagenasa bacteriana para digerir el tejido miocárdico. Esta técnica provoca la activación de las células del sistema inmune y por lo tanto una pérdida de la función. Por ejemplo, los mastocitos se cardiaca significativamente menos sensibles a los compuestos que causan la degranulación. 12 Por tanto, hemos desarrollado una técnica que permite taislamiento de las células cardiacas funcionales inmune que daría lugar a una mejor comprensión del papel de estas células en la enfermedad cardíaca que. 13, 14 Este método requiere una familiaridad con la localización anatómica de xifoides de la rata proceso, la axila y el ligamento falciforme, y el pericardio del corazón. Estas señales son importantes para aumentar el éxito del procedimiento y para asegurar un mayor rendimiento cardíaco de células inmunes. Estas células inmunes aisladas cardíaco puede ser utilizado para la caracterización de la funcionalidad, el fenotipo, la madurez y la cultura co-experimentos con otras células cardíacas para obtener una mejor comprensión de sus interacciones.

Este método para aislar células del sistema inmune funcional del corazón es una alternativa a los métodos convencionales de digestión de colagenasa, que provoca la activación de células inmunes no deseadas, lo que resulta en una disminución de la respuesta de estas células. Nuestro método de aislamiento de los rendimientos de las células inmunes funcional cardiaca, evitando los problemas asociados con la digestión enzimática.

Aislamiento de células inmunes funcionales cardíacos

Las células inmunitarias cardíacas están cobrando interés por las funciones que desempeñan en la remodelación patológica de numerosas enfermedades cardíacas.1-5 Estas células inmunitarias, que...

El objetivo general de este procedimiento es aislar células inmunitarias cardíacas funcionales. Esto se logra primero ventilando la rata y exponiendo el saco pericárdico que rodea al corazón. A continuación, se inyecta solución salina equilibrada de Hank o HBSS en el espacio pericárdico.Luego se aspira el HBSS, que ahora contiene células inmunitarias del espacio pericárdico. Finalmente, se contabiliza el número de células inmunitarias obtenidas a partir del procedimiento de aislamiento. En última instancia, se pueden realizar experimentos de desgranulación química o de co-cultivo, citometría de flujo, análisis de inmunofluorescencia o tratamiento farmacológico de las células para evaluar la funcionalidad y la actividad biológica de las células inmunitarias cardíacas.Habrá tres personas de mi laboratorio que demostrarán este procedimiento: Jennifer McLarty, una estudiante de posgrado; Giselle Melendez, una becaria posdoctoral; y mi técnico jefe, Spencer. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes de aislamiento de células inmunitarias, por ejemplo, la digestión con colagenasa, es que evita la activación y el daño no deseados de las células inmunitarias, y preserva la capacidad de respuesta de estas células a los tratamientos experimentales. Antes de comenzar, incline una tabla para cortar a un ángulo de 30 grados.Luego, utilice una herramienta eléctrica Dremmel para recortar la mitad hasta tres cuartas partes del extremo de una aguja biselada de calibre 18. Esto crea una punta más corta para su uso como tubo endotraqueal una vez que se haya monitoreado a la rata. Para asegurar una anestesia adecuada, afeite el abdomen, el tórax y la garganta del animal, y luego realice una incisión cutánea desde el abdomen medio hasta debajo del mentón.A continuación, diseque los músculos del triángulo anterior del cuello para exponer la tráquea; una vez expuesta, coloque un hilo negro trenzado de calibre tres ceros debajo de ella. Ahora realice una incisión en la tráquea entre los anillos cartilaginosos e inserte el tubo traqueal. Amarre firmemente el hilo de calibre tres ceros alrededor de la tráquea para asegurar el tubo traqueal.A continuación, conecte el tubo endotraqueal a un ventilador para animales pequeños e induzca la respiración. Para asegurar una oxigenación adecuada del corazón y los pulmones, confirme una expansión y retracción torácica simétrica en la rata durante la inspiración y la espiración del ventilador, respectivamente. Antes de comenzar el aislamiento de células inmunitarias, llene una jeringa de 10 cc con HBSS.Luego, corte la mitad hasta tres cuartas partes del extremo de la punta blanda de teflón de una aguja intravascular Baxter de calibre 24 sobre la aguja. Acorte rápidamente la punta para obtener una punta más corta para el procedimiento de aislamiento. Coloque la aguja intravascular Baxter de calibre 24 sobre la aguja.Ponga rápidamente la punta del catéter en la jeringa que contiene el HBSS. Luego coloque la jeringa llena de HBSS, todos los tampones y un tubo cónico de 50 mililitros vacío sobre hielo. Ahora realice una incisión media en la pared abdominal desde la línea alba hasta el proceso xifoides.Luego, comenzando justo lateral al proceso xifoides, realice incisiones bilaterales a través de la caja torácica. Continúe en un ángulo hacia la axila, teniendo cuidado de no lacerar los pulmones, el corazón ni el pericardio. A continuación, separe el diafragma de las costillas inferiores, cortando de lateral a medial.A continuación, utilice el ligamento falciforme como punto de referencia para indicar dónde el pericardio está adherido en el lado opuesto del diafragma. Levante suavemente un lado de la caja torácica para exponer la cavidad torácica y el corazón durante la realización. La punción pericárdica aspira el HBSS y las células y vuelve a insertar.Las jeringas son las partes más complicadas del procedimiento. Si desgarra ligeramente el pericardio, no se preocupe. Mientras el pericardio rodee suficiente parte del corazón como para formar una cavidad alrededor de él, aún puede realizar lavados sobre el corazón.Seleccione un punto en el pericardio aproximadamente a mitad de camino entre el esternón y el corazón, preferiblemente más rostral que caudal, e introduzca la punta de teflón del catéter rápido a través de ambas capas del pericardio. Una vez que la punta esté en su lugar, llene suavemente el espacio pericárdico con dos o tres mililitros de HBSS. Cuando la bolsa esté llena, cambie la punta a la jeringa vacía de 10 cc y coloque nuevamente la punta dentro del espacio pericárdico.Utilizando el mismo orificio de entrada, aspire la mayor cantidad posible del tampón, asegurándose de que la punta no se acerque demasiado a las paredes del saco pericárdico durante la succión, especialmente en la cara inferior del corazón. A continuación, transfiera el tampón al tubo de 15 mililitros tras la extracción del líquido. Manteniendo el tubo a cuatro grados Celsius, llene y vacíe el saco pericárdico con dos a tres mililitros más de HBSS.Aproximadamente tres o cuatro veces más, transfiera el HBSS recuperado al tubo de 15 mililitros. Después de cada lavado, retire entonces el corazón, los pulmones y/o cualquier otro tejido necesario para otros estudios. Mantenga los tubos sobre hielo.Cuando no se utilicen, centrifugar las muestras de células inmunitarias recolectadas durante 10 minutos a 200 veces la gravedad. A cuatro grados SIUs, eliminar el sobrenadante y luego reconstituir el sedimento en un mililitro de HBSS indicado.A continuación se presentan ejemplos de estudios histológicos para determinar la morfología celular y madurez tras el aislamiento de células inmunitarias cardíacas. Las células cebadas cardíacas teñidas con azul de toína y con azul AUM y con orceína O se muestran a la izquierda y a la derecha, respectivamente. Aquí se muestran los resultados de un estudio funcional en el que células cebadas cardíacas aisladas de la región epicárdica del corazón fueron estimuladas con activadores conocidos.Los mastocitos cardíacos aislados mantienen la capacidad de liberar histamina tras el tratamiento con 10 microgramos por mililitro del compuesto 48/80 o con 10 micromoles de sustancia P. En las dos siguientes figuras, se muestran gráficos de dispersión representativos de un análisis citométrico de flujo de células inmunitarias cardíacas aisladas. En el primer gráfico de dispersión se han identificado linfocitos T positivos para CD4 en el aislado pericárdico. En el segundo gráfico de dispersión se detectan linfocitos T positivos para CD8. Al realizar este procedimiento, es importante recordar proteger la integridad del pericardio al inyectar la solución tampón y al aspirar la solución tampón que contiene las células inmunitarias, ya que esto aumentará el rendimiento de células obtenidas.

isolation-of-functional-cardiac-immune-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se pueden aislar del corazón cardiomiocitos individuales de ratones de tipo salvaje y mutantes para estudiar su contractilidad y transitorios de calcio. Esto permite caracterizar la contribución de la disfunción celular a la disfunción cardíaca por cualquier causa.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Los conocimientos actuales sobre las bases celulares de las enfermedades cardiacas se basa principalmente en estudios sobre modelos animales. Aquí describimos y validar un nuevo método para obtener cardiomiocitos viables individuales de pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. Miocitos ventriculares humanos pueden ser utilizados para estudios electrofisiológicos y las pruebas de drogas.

Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

tejido cardíaco humano alberga poblaciones de células precursoras multipotentes perivasculares que pueden ser adecuados para la regeneración miocárdica. La técnica descrita aquí permite el aislamiento simultáneo y purificación de dos poblaciones de células estromales multipotentes asociados con vasos nativos sangre, es decir CD146 + CD34 - pericitos y CD34 + CD146 - células adventicias, desde el miocardio humano.

Aislamiento de Perivasculares Multipotentes poblaciones de células precursoras de Cardíaca Tejido humano

Este protocolo presenta un método sencillo y eficaz para aislar, identificar y cuantificar las células inmunes que reside en el miocardio de ratones durante el estado estacionario o inflamación. El protocolo combina la digestión enzimática y mecánica para la generación de una suspensión unicelular que puede ser más analizada por citometría de flujo.

Aislamiento e identificación de las células inmunes Extravascular del corazón

El objetivo general de este artículo es estandarizar el protocolo para el aislamiento, caracterización y diferenciación de células madre cardiacas (CSCs) desde el corazón de ratón adulto. Aquí, describimos un método de centrifugación del gradiente de densidad para aislar las CMC murinas y métodos elaborados por la cultura, la proliferación y la diferenciación en cardiomiocitos de CSC.

Aislamiento, caracterización y diferenciación de células cardiacas desde el corazón de ratón adulto

Hemos optimizado un protocolo para aislar y purificar los pericitas cardíacos murinos para la investigación básica y la investigación de su biología y potencial terapéutico.

Aislamiento y Purificación de Pericitas Cardíacos Murinos

Aquí se presenta un protocolo para aislar varios subconjuntos de macrófagos y otras células no inmunes del miocardio humano y de ratón mediante la preparación de una suspensión de una sola célula a través de la digestión enzimática. También se presentan esquemas de gating para la identificación basada en citometría de flujo y la caracterización de macrófagos aislados.

Aislamiento de subconjuntos de macrófagos y células estromas de especímenes miocárgonos humanos y de ratón

El objetivo de este trabajo es desarrollar un método para aislar reproduciblemente los cardiomiocitos del corazón adulto y medir el contenido de ADN y la nucleación.

Aislamiento de cardiomiocitos de corazones fijos para inmunocitoquímica y análisis de ploide

Se describe un método para el aislamiento simultáneo de micocitos y no miocitos tanto de las adriículas como de los ventrículos de un solo corazón de ratón adulto. Este protocolo da como resultado rendimientos consistentes de micocitos cardíacos altamente viables y no miocitos y detalla condiciones óptimas de cultivo específicos de células para fenotipado y análisis in vitro.

Aislamiento simultáneo y cultura de los miocitos atriales, los miocitos ventriculares y los no miocitos de un corazón de ratón adulto

El protocolo presentado aquí proporciona un enfoque paso a paso para el aislamiento de macrófagos residentes cardíacos de la región del nodo sinoauricular (SAN) y el nodo auriculoventricular (AVN) de corazones de ratón.

Aislamiento y cultivo de macrófagos cardíacos residentes del nódulo sinoauricular y auriculoventricular murino

Aquí presentamos un protocolo para la cuantificación y diferenciación de linfocitos B miocárdicos en función de su ubicación en el espacio intravascular o endotelial mediante citometría de flujo.

Cuantificación basada en citometría de flujo y análisis de células B miocárdicas

Aprende a aislar células inmunes cardíacas funcionales mediante lavado pericárdico con HBSS en ratas, evitando la activación enzimática. Este método preserva la respuesta celular para análisis de citometría de flujo y ensayos funcionales.

Aislamiento de células inmunes funcionales cardíacos

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