Name: El estudio de dependientes de la edad de Inestabilidad Genómica con el S. cerevisiae Cronológica Modelo Longevidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprende a estudiar la inestabilidad genómica dependiente de la edad en Saccharomyces cerevisiae combinando análisis de vida cronológica con ensayos de mutación de ADN. Este método permite investigar genes y vías implicados en la inestabilidad del genoma durante el envejecimiento celular.

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Damos las gracias a S. Robertson Jinks y Heidenreich E. para proporcionar plásmidos y cepas de levadura, P. Pham y Goodman MF ayuda conel ensayo TLS. Este trabajo fue apoyado, en parte, por la Federación Americana para la Investigación del Envejecimiento de subvención y por el NIH AG20642, AG025135.

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No hay conflictos de interés declarado.

Líquido culturas envejecimiento en algún momento presentan el nuevo crecimiento / fenotipo jadeando 13, lo que complica el análisis CLS. Nuevo crecimiento se produce normalmente cuando más de 90-99% de la población ha perdido su viabilidad. Este fenotipo se asocia a menudo con aumento del estrés oxidativo y / o disminución de la protección de la célula. Por ejemplo, la frecuencia de este fenotipo es más del doble en las células que carecen de la superóxido dismutasa citosólica y reduce en gran medida en el de larga duración mutantes (por ejemplo, Sch9 Δ Δ o RAS2) o mutantes que sobreexpresan superóxido dismutasas 22. En la práctica, se define el nuevo crecimiento como un aumento de la viabilidad o la estabilización de la viabilidad de tres muestreos consecutivos en la fase de alta mortalidad durante el envejecimiento cronológico. Dependiente de la edad la frecuencia de las mutaciones del ADN varían mucho dependiendo de la cepa de antecedentes, la manipulación genética, las condiciones de cultivo, así como la regeneración jadeando / y la supervivencia muy baja. Pre-experimentos deben llevarse a cabo en momentos tales como la supervivencia media y la máxima densidad de la galvanización de varios ensayos de mutación para determinar el rango de frecuencia de mutación antes de su análisis a gran escala performingthe vida. La cepa de tipo salvaje siempre se debe incluir en un período de vida o estudio de la frecuencia de mutación en paralelo a cualquier tratamiento o mutantes genéticos, de tal manera que entre experimentar variaciones pueden ser explicadas. Múltiples réplicas biológicos deben ser incluidos en el estudio, y, tanto líquidos como in situ la viabilidad / mutación de los ensayos deben realizarse para corroborar los resultados. En lugar de centrarse en un tipo específico de mutación del ADN, el perfil de la inestabilidad genómica dependiente de la edad mediante ensayos múltiples en combinación, pueden arrojar luz sobre el daño del ADN específica y daños en el ADN de reparación del sistema (s) que contribuyen a la inestabilidad genómica dependiente de la edad. Por ejemplo, un aumento significativo en bruto reordenamientos cromosómicos (GCR), en comparación con los de otras mutaciones en el ADN, se observa en la levadura de tipo salvaje que sugiere una ruptura elevationof doble cadena y / o deterioro de una de extremos no homólogos de unión (NHEJ) en la levadura envejecimiento cronológico (Tabla 2). El espectro de mutación can1 (secuenciación del gen CAN1) obtenidos en el envejecimiento de la levadura de tipo salvaje sugiere un incremento en el daño oxidativo durante el envejecimiento cronológico y propenso a errores de reparación del ADN, mientras que, en la larga vida Sch9 mutantes Δ, daños en el ADN menos oxidativo y propenso a errores muy reducida síntesis translesión se observaron 20. Los métodos descritos aquí pueden ser aún más gastada de estudio dependiente de la edad inestabilidad genómica. Por ejemplo, las células pasivas, y no en reposo, puede ser aislado de la levadura de la fase estacionaria culturas utilizando el método de gradiente de densidad descrita por Allen et al. 23. Combinado con los ensayos de mutación descrita aquí, nos han informado de que una gran parte de los dependientes de la edad se debe a mutaciones en células en reposo, en lugar de la división, las células dañadas o apoptosis 20,24.

el estudio de dependientes de la edad de inestabilidad genómica con el s. cerevisiae cronológica modelo longevidad

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Los estudios que utilizan el modelo de Saccharomyces cerevisiae envejecimiento han descubierto vías vida útil reguladoras que están parcialmente conservadas en eucariotas superiores 1-2. La simplicidad y el poder del modelo de levadura de envejecimiento también se pueden explorar para estudiar el daño del ADN y el mantenimiento del genoma, así como sus contribuciones a las enfermedades durante el envejecimiento. Aquí se describe un sistema para estudiar la edad que dependen de mutaciones en el ADN, incluyendo la sustitución de la base, las mutaciones de cambio de marco, bruto reordenamientos cromosómicos, y homólogas / recombinación homeologous, así como la actividad de reparación del ADN nuclear mediante la combinación de la levadura de esperanza de vida cronológica con el ADN sencillo daños y los ensayos de mutación. Los métodos descritos aquí deben facilitar la identificación de genes / vías que regulan la inestabilidad genómica y los mecanismos que subyacen dependiente de la edad mutaciones en el ADN y el cáncer en mamíferos.

Aquí se describe un conjunto de ensayos de mutación del ADN que se pueden combinar con el modelo cronológico levadura vida a estudiar los genes / vías que regulan o contribuir a la inestabilidad del ADN genómico durante el envejecimiento.

El estudio de dependientes de la edad de Inestabilidad Genómica con el S. cerevisiae Cronológica Modelo Longevidad

Los estudios que utilizan el modelo de envejecimiento de Saccharomyces cerevisiae han revelado vías reguladoras de la esperanza de vida que se conservan parcialmente en eucariotas superiores1-2. ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la inestabilidad genómica dependiente de la edad en levaduras combinando la longevidad cronológica con un conjunto de ensayos sencillos de daño y mutación del ADN. Esto se logra primero tomando muestras de cultivos en envejecimiento cronológico cada dos días y verificando la viabilidad mediante la formación de unidades formadoras de colonias o UFC. El siguiente paso del procedimiento consiste en examinar las mutaciones del ADN tomando muestras de cultivos envejecidos y sembrando las células en un medio de selección específico para mutaciones.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren cambios en las mutaciones del ADN durante el envejecimiento cronológico de la levadura mediante la normalización de los resultados del ensayo de mutación respecto a la viabilidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del envejecimiento, como los mecanismos que vinculan el envejecimiento y la inestabilidad genómica en *aria*. Para determinar la longevidad cronológica de la levadura o CLS, primero inocule una colonia individual de levadura en un mililitro de medio glucosa sintético completo, o medio SDC, e incube durante la noche con agitación a 30 grados Celsius. Al día siguiente, diluya el cultivo nocturno en 10 mililitros de medio SDC fresco hasta un OD 600 de 0,05 a 0,1 e incube con agitación a 30 grados Celsius durante tres días.El tercer día, cuando las células se encuentran en fase estacionaria, diluya cada Eloqua 10 000 veces en agua autoclavada, luego retire dos alícuotas de 10 microlitros del matraz y siembre 10 microlitros de cada cultivo diluido en una placa A-Y-E-P-D. Incube la placa a 30 grados Celsius hasta que aparezcan colonias. El número de colonias formadas, o unidades formadoras de colonias, provenientes del cultivo del tercer día se considera un 100 % de supervivencia.Continúe retirando alícuotas del cultivo en envejecimiento durante los días siguientes para su siembra. Ajuste los factores de dilución en consecuencia para asegurar aproximadamente entre 20 y 100 colonias en el ensayo de UFC. Detenga el muestreo cuando la viabilidad del cultivo haya disminuido por debajo del 1 %; típicamente entre los días 11 y 13, la viabilidad celular también puede estudiarse en células envejecidas en placas.Para comenzar este ensayo, inocular una colonia única en un mililitro de medio glucosado sintético completo y incubar durante la noche con agitación a 30 grados Celsius. Cuando el cultivo haya crecido hasta aproximadamente 10 a la octava células por mililitro, diluir el cultivo con agua de autoclave a 100-200 células por 10 microlitros y 1000 células por 10 microlitros. Para cada cepa, preparar un conjunto de ocho a veinte placas SDC con deficiencia de triptófano etiquetadas según la densidad de siembra.Para asegurar que se puedan contar entre 10 y 100 colonias, anticipando la disminución de viabilidad durante el envejecimiento, plaque dos alícuotas de 10 a 30 microlitros de cultivo diluido en cada placa. Incube el conjunto de placas a 30 grados Celsius durante el análisis de longevidad: el día del plaqueo y cada dos días posteriormente, retire una placa y agregue gota a gota 0,5 mililitros de triptofano para permitir que las células viables crezcan. Incube la placa a 30 grados Celsius durante 48 a 72 horas adicionales.Después de 48 a 72 horas, cuente las UFC para evaluar la viabilidad del día de la adición de triptófano, con el fin de analizar el daño al ADN y la frecuencia de mutación durante el envejecimiento cronológico. Se cultivan en paralelo varios cepas con características especiales junto con la cepa silvestre para el ensayo de longevidad cronológica de levaduras.La frecuencia de mutación espontánea puede evaluarse midiendo la frecuencia de resistencia a la canavanina en un cultivo que envejece cronológicamente. Las mutaciones en el gen *can1*, que codifica la permeasa plasmática de arginina, confieren a las células resistencia al análogo de arginina L-canavanina; las células resistentes a canavanina crecerán en placas de medio sintético completo sin arginina suplementadas con sulfato de L-canavanina. La medición de la frecuencia de reversión a trip+ en una cepa que contiene una mutación *amber* en el gen *trp1* permite estimar la tasa de sustitución de bases durante el envejecimiento cronológico de la levadura.Las células con reversiones positivas crecerán en placas de selección sin triptófano. La cepa lisogénica negativa EH uno 50 posee un corrimiento de lectura de más cuatro en el marco de lectura abierto, lo que provoca auxotrofia para lisina, y esto puede revertirse mediante pequeñas inserciones o deleciones. Los revertidos serán seleccionados en placas de selección sin lisina para detectar reordenamientos cromosómicos groseros o gcr.Se utiliza una cepa mutante en la que HX T 13, ubicado a 7,5 kilobases telomérico respecto a can uno en el cromosoma cinco, está interrumpido por un casete U tres. Las mutaciones en ambos genes, can uno y U tres, hacen que las células sean resistentes a L-canavanina y ácido 5-fluoroorótico, respectivamente. Dado que la frecuencia de mutaciones puntuales que ocurren en ambos genes es baja, el análisis de la frecuencia de resistencia tanto a L-canavanina como al ácido 5-fluoroorótico proporciona una estimación de GCR. Para monitorear el nivel de recombinación homóloga y no homóloga, durante el envejecimiento cronológico se generan mutantes que portan repeticiones invertidas homólogas al 100 % o al 91 % homólogas.La recombinación entre los IRS en el locus his tres permite la expresión de la proteína his tres funcional. Por lo tanto, las células en las que ha ocurrido la recombinación crecerán en placas sin histidina suplementadas con galactosa. En el día tres, cuando las células se encuentren en fase estacionaria, se retirará una cantidad adecuada de células de cada cultivo envejecido.Dado que se utiliza el mismo procedimiento para todos los ensayos, solo se procesará una muestra. A efectos de este video, centrifugue las células en una centrífuga de banco para formar el pellet. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en un mililitro de agua esterilizada en autoclave.Nuevamente, elimine el sobrenadante y resuspenda el botón celular en 100 microlitros de agua. Plaque las células en las placas adecuadas para seleccionar los revertidos deseados. Incube las placas a 30 grados Celsius y, tras tres o cuatro días, cuente las UFC; la frecuencia de mutación se normaliza respecto al número de células viables. Este gráfico muestra resultados representativos de un ensayo típico de longevidad cronológica cuando se compara la supervivencia cronológica de células silvestres con la de los mutantes S CH nueve delta TOR uno delta y RAs dos delta.En cultivos líquidos, los mutantes que carecen de TOR uno s, CH nueve o RAs dos muestran una longevidad cronológica prolongada. Además, las deficiencias en s CH nueve y RAs dos muestran un efecto aditivo en la promoción de la supervivencia cronológica en presencia de diversas fuentes de carbono. Mediante el ensayo de viabilidad NC dos se muestra en este siguiente gráfico.El día uno, los cultivos silvestres de SDC se diluyeron y sembraron en placas SC de triple ausencia sin fuente de carbono. Las placas SC de triple ausencia suplementadas con glucosa, etanol o glicerol se incubaron a 30 grados Celsius, revisándose cada dos días. Se recuperó una placa de cada conjunto y se agregaron los nutrientes apropiados para permitir el crecimiento y la formación de colonias.La frecuencia de mutación dependiente de la edad varía considerablemente según la cepa, el fondo genético, la manipulación genética, el cultivo, las condiciones y la edad. Esta tabla muestra los resultados típicos obtenidos en una cepa silvestre. Los resultados representativos de la síntesis translesión se muestran en la siguiente imagen.El aumento de la frecuencia de mutaciones dependiente de la edad puede implicar cambios en la reparación errónea del ADN utilizando extractos nucleares y diversas plantillas de ADN. Podemos evaluar la síntesis de translesión o TLS en células envejecidas cronológicamente. Se analizaron extractos nucleares de células de fase estacionaria de tres días de edad, de tipo silvestre y del mutante SCH nueve delta.Los productos de TLS con plantilla no dañada se indican mediante líneas continuas y los productos de TLS con plantilla dañada se indican mediante líneas punteadas. No se observó síntesis translesión en extractos nucleares del mutante de larga duración s CH nueve delta; los cebadores libres se indican mediante la flecha abierta. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el análisis de longevidad cronológica y de mutación del ADN en levaduras.

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Envejecimiento cronológico en la levadura se refiere a la pérdida de la viabilidad celular asociado con el tiempo en la fase estacionaria. Aquí se describe un método de alto rendimiento para determinar cuantitativamente la levadura abarcan la vida cronológica.

Cuantificar cronológico levadura Duración de la vida por consecuencia de células envejecidas

En este artículo presentamos un protocolo general para la medición de la duración de la vida replicativa de las células madre de la levadura.

Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes

Se describe aquí la operación de un dispositivo de microfluidos que permite imágenes microscópicas continua y de alta resolución de las células de levadura en ciernes individuales durante su completa replicativa y / o cronológico vida útil.

Continua observación microscópica de alta resolución de replicativa envejecimiento en la levadura en ciernes

Las tasas de mutación en células de Saccharomyces cerevisiae jóvenes medidos a través de pruebas de fluctuación se utilizan para predecir las frecuencias de mutación de células madre de diferentes edades replicativa. Clasificación magnética y citometría de flujo sirven entonces para medir las frecuencias de mutación real y la edad de las células madre para identificar cualquier desviación de las frecuencias de mutación predichos.

Combinando clasificación magnética de las células madre y las pruebas de fluctuación para analizar la inestabilidad del genoma Durante mitótico Aging Cell en Saccharomyces cerevisiae

Este artículo presenta un protocolo optimizado para la producción de chips de microfluidos y la configuración de los experimentos de microfluidos para medir la vida útil y los fenotipos celulares de células de levadura individuales.

El uso de dispositivos de microfluidos para Medir Lifespan y Celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes

Aquí describimos el método Replica Set, un enfoque cuantitativo medida vida útil/supervivencia de C. elegans y healthspan en forma robusta y de alto rendimiento, permitiendo la proyección de muchas condiciones sin sacrificar la calidad de los datos. Este protocolo detalla la estrategia y proporciona una herramienta de software para análisis de datos de conjunto de réplica.

El método de conjunto de réplica: Un enfoque de alto rendimiento para cuantitativamente medida Caenorhabditis elegans vida útil

Aquí hay un protocolo para identificar interacciones genéticas a través de una mayor pantalla supresora de número de copia en Saccharomyces cerevisiae. Este método permite a los investigadores identificar, clonar y probar supresores en mutantes de levadura de corta duración. Probamos el efecto del aumento del número de copia de SIR2 en la vida útil en un mutante nulo de autofagia.

Una pantalla supresora para la caracterización de los vínculos genéticos que regulan la vida cronológica en Saccharomyces cerevisiae

La plataforma de imágenes "The Lifespan Machine" automatiza la observación de por vida de grandes poblaciones. Mostramos los pasos necesarios para realizar ensayos de esperanza de vida, resistencia al estrés, patogénesis y envejecimiento conductual. La calidad y el alcance de los datos permiten a los investigadores estudiar las intervenciones en el envejecimiento a pesar de la presencia de variaciones biológicas y ambientales.

Ensayos de envejecimiento conductual y vida útil de alto rendimiento con la máquina Lifespan

Se describe un ensayo cualitativo para la adhesión de la levadura y la invasión de agar como una medida de la diferenciación y la invasión pseudohyphal. Este ensayo simple se puede utilizar para evaluar el fenotipo invasivo de distintos mutantes, así como las señales de los efectos ambientales y las vías de señalización en la diferenciación de la levadura.

Ensayo de adhesión y la invasión de agar en S. cerevisiae

De fusión GFP-proteínas son ampliamente utilizados para visualizar los orgánulos por microscopía confocal. Sin embargo, la detección de mutaciones que afectan a la morfología de los orgánulos por lo general requiere de mutagénesis individual y requiere mucho tiempo. En este caso, se demuestra un método para incorporar al mismo tiempo orgánulo-GFP marcadores en casi 5.000 genes no esenciales en la levadura.

Un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en S. cerevisiae

Aprende a estudiar la inestabilidad genómica dependiente de la edad en Saccharomyces cerevisiae combinando análisis de vida cronológica con ensayos de mutación de ADN. Este método permite investigar genes y vías implicados en la inestabilidad del genoma durante el envejecimiento celular.

El estudio de dependientes de la edad de Inestabilidad Genómica con el S. cerevisiae Cronológica Modelo Longevidad

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