El estudio de dependientes de la edad de Inestabilidad Genómica con el S. cerevisiae Cronológica Modelo Longevidad

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la inestabilidad genómica dependiente de la edad en levaduras mediante la combinación de la vida cronológica con un conjunto de ensayos simples de daño y mutación en el ADN. Esto se logra mediante el muestreo de cultivos cronológicos de envejecimiento cada dos días y la verificación de la viabilidad por unidad formadora de colonias o formación de UFC. El siguiente paso del procedimiento es examinar las mutaciones del ADN mediante el muestreo de cultivos envejecidos y la siembra de células en un medio de selección específico de la mutación.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios en las mutaciones del ADN durante el envejecimiento cronológico de la levadura a través de la normalización de los resultados del ensayo de mutación a la viabilidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del envejecimiento, como los mecanismos que relacionan el envejecimiento y la inestabilidad genómica en el envejecimiento. Para analizar la vida cronológica de la levadura o CLS, primero inocule una sola colonia de levadura en un mililitro de glucosa completa sintética, o medio SDC, e incube durante la noche con agitación a 30 grados centígrados al día siguiente. Diluir el cultivo durante la noche en 10 mililitros de medio SDC fresco hasta un OD 600 de 0,05 a 0,1, incubar agitando a 30 grados centígrados durante tres días.

En el tercer día, cuando las células están en fase estacionaria, diluir cada Eloqua 10.000 veces en agua de autoclave, luego retirar dos alícuotas de 10 microlitros del matraz y colocar 10 microlitros de cada cultivo diluido en una placa A-Y-E-P-D. Incubar la placa a 30 grados centígrados hasta que surjan las colonias. El número de colonias que surgen o unidades formadoras de colonias desde el tercer día de cultivo se considera 100% de supervivencia.

Continúe eliminando las alícuotas del cultivo de envejecimiento en los días siguientes para el enchapado. Ajustar los factores de dilución en consecuencia para asegurar alrededor de 20 a 100 colonias en el ensayo de UFC. El muestreo se detiene cuando la viabilidad del cultivo ha disminuido por debajo del 1%, generalmente entre los días 11 y 13, la viabilidad celular también se puede estudiar en células envejecidas en placas.

Para comenzar este ensayo, inocule una sola colonia en un mililitro de medio sintético de glucosa completa e incube durante la noche agitando a 30 grados centígrados. Cuando el cultivo haya crecido a aproximadamente 10 a la octava célula por mililitro, diluya el cultivo con agua de autoclave a 100 a 200 células por 10 microlitros y 1000 células por 10 microlitros. Para cada cepa, prepare un juego de ocho a 20 placas SDC de gota de triptófano etiquetadas de acuerdo con la densidad de la placa.

Para asegurar de 10 a 100 colonias, se pueden contar en previsión de una disminución de la viabilidad durante el envejecimiento en placa, dos alícuotas de 10 a 30 microlitros de cultivo diluido en cada placa. Incubar la placa a 30 grados centígrados durante el análisis de vida útil el día de la siembra y, posteriormente, cada dos días, retirar una placa y añadir gota a gota 0,5 mililitros de triptófano para permitir que crezcan las células viables. Incube la placa a 30 grados centígrados durante 48 a 72 horas adicionales.

Después de 48 a 72 horas. Cuente la UFC para la viabilidad del día de la edición de triptófano para analizar cuatro daños en el ADN y la frecuencia de mutaciones durante el envejecimiento cronológico. Una serie de extraños con características especiales se cultivan en paralelo con la cepa de tipo silvestre para el ensayo CLS de levadura.

La frecuencia de mutaciones espontáneas puede evaluarse midiendo la frecuencia de resistencia a la canna en una cultura cronológicamente envejecida. Las mutaciones en el gen can one que codifica la permeasa de arginina plasmática hacen que las células sean resistentes al análogo de la arginina L Canavan Las células resistentes a Canavan crecerán en el abandono de arginina Placas sintéticas de medio completo suplementadas con sulfato de L Canavan medición de la frecuencia de reversión positiva del disparo en una cepa que contiene una mutación ámbar en el viaje. Una secuencia de recubrimiento permite estimar la tasa de sustitución de bases durante el viaje cronológico de envejecimiento de la levadura.

Las células de reversión positiva crecerán en placas de abandono de triptófano. La cepa negativa de lisis EH one 50 alberga un cambio más cuatro en el marco de lectura abierto, lo que resulta en atrofia del buey para la lisina, y esto se puede revertir mediante pequeñas mutaciones de inserción o deleción. Los revertidos se seleccionarán en placas de caída de lisina para detectar reordenamientos cromosómicos macroscópicos o gcr.

Se utiliza una cepa mutante en la que HX T 13 localizada 7,5 kilobases teloméricas a can one en el cromosoma cinco es interrumpida por un U tres mutaciones en casete en los genes can one y U tres que hacen que las células sean resistentes al ácido L Canavan y cinco fluorooróticos, respectivamente. Dado que la frecuencia de mutaciones puntuales que ocurren en ambos genes es baja, el análisis de la frecuencia de resistencia tanto a El Canavan como al ácido fluorororótico cinco proporciona una estimación de gcr para monitorear el nivel de recombinación homóloga y homóloga. Durante el envejecimiento cronológico se generan mutantes que llevan repeticiones invertidas 100% homólogas o 91% homólogas.

La recombinación de tres locus entre el IRS permite la expresión de la proteína funcional de sus tres. Por lo tanto, las células en las que se ha producido la recombinación crecerán en placas de abandono de histidina suplementadas con galactosa. En el tercer día, cuando las células están en fase estacionaria y se eliminará la cantidad adecuada de células de cada cultivo envejecido.

Dado que se utiliza el mismo procedimiento para todos los ensayos, solo se procesará una muestra. Para el propósito de este video, granule las células girándolas en una centrífuga de sobremesa. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de pellet de agua de autoclave.

Nuevamente, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en 100 microlitros de celdas de placa de agua en las placas apropiadas para seleccionar las reversiones deseadas. Las placas de incubación a 30 grados centígrados después de tres o cuatro días cuentan las UFC, la frecuencia de mutación se normaliza al número de células viables. Este gráfico muestra resultados representativos de un ensayo de vida cronológica típico cuando se compara la supervivencia cronológica de las células de tipo salvaje con la de los mutantes S, CH, nueve delta, TOR, un delta y RAs, dos delta.

En los mutantes de cultivo líquido que carecen de TOR uno, CH nueve o RAs dos muestran una vida útil cronológica prolongada. Además, las deficiencias en s CH nueve y RAs dos muestran un efecto aditivo en la promoción de la longevidad y la supervivencia cronológica en presencia de diversas fuentes de carbono. El uso del ensayo de viabilidad NC dos se muestra en el siguiente gráfico.

El primer día, los cultivos de tipo silvestre SDC se diluyeron y se colocaron en placas de caída de viaje SC sin fuente de carbono. Las placas de caída SC Tripp suplementadas con glucosa, etanol o placas de oratos de glicerol se incubaron a 30 grados centígrados cada dos días. Se extrajo una placa de cada conjunto y se agregaron los nutrientes apropiados para permitir el crecimiento y la formación de colonias.

La frecuencia de las mutaciones dependientes de la edad varía mucho según la cepa, los antecedentes, la manipulación genética, la cultura, las condiciones y la edad. Esta tabla muestra los resultados típicos obtenidos en una cepa de tipo salvaje. Los resultados representativos de la síntesis de lesiones trans se muestran en la siguiente imagen.

El aumento de la frecuencia de las mutaciones dependientes de la edad puede implicar cambios en la reparación errónea del ADN utilizando extractos nucleares y varias plantillas de ADN. Podemos evaluar la síntesis de traducción o TLS en las células envejecidas cronológicamente. Se analizaron extractos nucleares de células mutantes delta de fase estacionaria de tres días de edad, tipo salvaje y SCH nueve delta.

Los productos TLS con plantilla intacta se indican con líneas continuas y los productos TLS con plantilla dañada se indican con líneas punteadas. No se observó síntesis de lesiones trans en los extractos nucleares de los cebadores libres de mutantes s CH de larga vida y nueve se indican con la flecha abierta. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el análisis cronológico de la vida útil y la mutación del ADN en la levadura.