La aplicación de la Permanente Ligadura arteria cerebral media en el ratón
25 de julio de 2011
La arteria cerebral media (MCA) ligadura es una técnica para estudiar la isquemia cerebral focal en modelos animales. En este método, la arteria cerebral media se expone mediante craneotomía y se liga con cauterización. Este método da volumen del infarto altamente reproducible y el aumento de post-operatorio las tasas de supervivencia en comparación con otros métodos disponibles.
El objetivo general de este procedimiento es estudiar la isquemia cerebral focal en modelos animales. Esto se logra realizando primero una pequeña incisión en la piel entre el ojo izquierdo y la base de la oreja. A continuación, se realiza una craneotomía en la unión del arco cigomático y el hueso escamoso para exponer la arteria cerebral media, la cual se liga posteriormente utilizando un cauterizador para vasos pequeños.
Finalmente, se sutura la piel para cerrar la herida. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un infarto localizado en el hemisferio izquierdo del cerebro del ratón. El cerebro puede teñirse con TTC o escanearse mediante resonancia magnética (RM) para la visualización de un accidente cerebrovascular.
El cerebro afectado por accidente cerebrovascular también puede utilizarse para la determinación de la expresión de proteínas o de ARNm. Hola, soy Garza Chola. Soy estudiante de posgrado en el laboratorio de Gale Johnson en la Universidad de Rochester.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del accidente cerebrovascular, como ilustrar los mecanismos que conducen a la muerte celular en el cerebro isquémico. Para prepararse para la cirugía, esterilice todos los instrumentos quirúrgicos, esponjas de gasa y aplicadores cognitivos mediante autoclave. Mantenga las herramientas quirúrgicas en etanol al 70 % durante la cirugía y déjelas secar al aire sobre gasa estéril justo antes de usarlas.
Rocíe el área de trabajo con etanol al 70 % dos horas antes de la cirugía. Inyecte al ratón 0,05 miligramos por kilogramo de buprenorfina. El fármaco se administrará nuevamente inmediatamente después de la cirugía y luego cada tres a cinco horas durante las primeras 24 horas del período postoperatorio.
Utilice un vaporizador de anestésicos para anestesiar al ratón con una mezcla de gas de 3% de ISO y 20% de oxígeno. Ajuste la cantidad de oxígeno con un medidor de flujo. Compruebe el nivel de anestesia mediante la compresión del dedo del pie o de la cola.
Mantenga el nivel de anestesia con fluoruro de isoflurano al 2%. Aplique lágrimas artificiales a los ojos del ratón y tenga cuidado para evitar dañar el ojo durante el procedimiento quirúrgico.
Coloque al ratón en posición lateral sobre su costado derecho utilizando las tijeras para animales. Afeite la zona del lado izquierdo, entre el ojo izquierdo y la base de la oreja izquierda. Limpie la zona alternando una solución de Betadine y etanol al 70 %, utilizando aplicadores de algodón y frotando suavemente la zona.
Es necesario repetir el procedimiento. Coloque el ratón sobre una almohadilla calefactora conectada a una sonda rectal para mantener la temperatura corporal a 37 grados Celsius; inserte la sonda rectal utilizando aceite mineral. Coloque al ratón sobre su lado derecho bajo el microscopio y sujételo con cinta adhesiva.
Corte una ventana en una esponja de gasa y cubra el área quirúrgica con tijeras finas rectas. Realice una incisión vertical entre el ojo izquierdo y la base de la oreja izquierda. Utilice hemostatos curvos para mantener el área quirúrgica abierta si ocurre un secado excesivo del tejido durante la cirugía.
Utilice aplicadores de algodón para aplicar PBS estéril. Use tijeras de resorte para realizar una incisión horizontal en el músculo temporal y tire lentamente con pinzas para separar ligeramente el músculo temporal del cráneo. Sujete el hueso maxilar con pinzas curvas y utilice una aguja de calibre 18 para realizar una pequeña craneotomía subtemporal en la unión del arco cigomático y el hueso escamoso.
Con un trepano óseo, los cirujanos extraen pequeños fragmentos del cráneo para exponer la arteria cerebral media (ACM). Durante este procedimiento, no se deben dañar el arco cigomático ni el contenido orbitario. Utilizando un cauterizador para vasos pequeños, ligue la porción distal de la ACM, coloque el músculo temporal de nuevo en su posición original y use suturas de nylon número cero.
Para cerrar el sitio de incisión, suspenda la anestesia y retire la sonda rectal. Inyecte al ratón una segunda dosis de buprenorfina por vía subcutánea. Devuelva al ratón a la jaula, que se mantuvo a 37 grados Celsius.
Con un panel calefactor. Observe atentamente al ratón durante las próximas 24 horas en busca de cualquier malestar, incluyendo disminución del apetito o consumo de agua, postura encorvada, aumento de la frecuencia respiratoria o pelo erizado. Proporcione al ratón gel de recuperación inmediatamente después de la cirugía.
Espere de dos a tres horas después de la cirugía. Luego, inyecte al ratón buprenorfina por vía subcutánea cada tres a cinco horas hasta 24 horas. Veinticuatro horas después de la cirugía, anestesie profundamente al ratón y realice la perfusión del ratón con TTC al 4 %.
Retire el cerebro y colóquelo en una solución de paraformaldehído al 4 % durante la noche. Al día siguiente, coloque el cerebro en el bloque de corte. Utilice cuchillas de afeitar para seccionar el cerebro en rebanadas de un milímetro de grosor.
Coloque las secciones al lado de una regla métrica milimétrica. Utilizando una cámara digital conectada a un microscopio estereoscópico, fotografíe las secciones en el software Image J.
Haga clic en el menú de archivo y abra la foto deseada. Haga clic en la pestaña de línea recta en el programa. Dibuje una línea recta entre los dos márgenes de la regla.
Haga clic en el menú analizar y seleccione establecer escala. Establezca la distancia conocida como uno y la unidad de longitud como milímetro. Haga clic en la pestaña de círculo a mano alzada.
Dibuje un círculo para delinear el hemisferio contralateral. Haga clic en el menú analizar y seleccione medir. Aparecerá una ventana de cálculo que mostrará el área del círculo dibujado.
Dibuje otro círculo alrededor del hemisferio ipsilateral, excluyendo el área con trazo blanco. Mida el área como se mostró anteriormente. El nuevo valor se agregará a la ventana de cálculo.
La diferencia entre el primer y el segundo valor representa el área del infarto. Calcule el área del accidente cerebrovascular en cada corte repitiendo los pasos anteriores para espesores de corte de un milímetro. Calcule el volumen del accidente cerebrovascular sumando el área del accidente cerebrovascular calculada en cada corte.
Esta figura muestra el cerebro teñido con TTC 24 horas después de la ligadura permanente de la ACM en un ratón C57BL/6 de tipo silvestre. El sitio del accidente cerebrovascular tiene apariencia blanca y se puede observar con diferentes aumentos y ángulos. Aquí se muestran cortes de un milímetro de grosor del cerebro con infarto teñido con TTC, desde el infarto anterior hasta el posterior.
El volumen se calculó 24 horas después de la cirugía. El volumen del infarto es de aproximadamente 23 milímetros cúbicos Una vez mostaza. Esta técnica puede realizarse en 30 minutos si se lleva a cabo correctamente.
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Descripción general
La técnica de ligadura de la arteria cerebral media (MCA) se utiliza para estudiar la isquemia cerebral focal en modelos animales. Este método consiste en exponer y ligar la arteria cerebral media, lo que produce volúmenes de infarto reproducibles y mejora las tasas de supervivencia postoperatoria.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Investigación sobre accidente cerebrovascular
- Modelos animales
Antecedentes
- La isquemia cerebral focal es un área crítica de estudio para comprender el accidente cerebrovascular.
- El método de ligadura de la ACM permite realizar experimentos controlados.
- Los modelos animales proporcionan información sobre los mecanismos del accidente cerebrovascular humano.
- El aumento en las tasas de supervivencia mejora la fiabilidad de los resultados.
Objetivo del estudio
- Para investigar los efectos de la isquemia cerebral focal.
- Para evaluar los volúmenes de infarto en un entorno controlado.
- Para mejorar la comprensión de la patología del accidente cerebrovascular.
Métodos Utilizados
- Incisión realizada entre el ojo izquierdo y la base de la oreja.
- Se realizó craneotomía en el arco cigomático y el hueso escamoso.
- La arteria cerebral media fue ligada utilizando un cauterizador para vasos pequeños.
- La piel fue suturada para cerrar la herida tras el procedimiento.
Resultados principales
- Infarto ubicado en el hemisferio izquierdo del cerebro del ratón.
- Visualización del accidente cerebrovascular mediante tinción con TTC o resonancia magnética (MRI).
- Los resultados demuestran la eficacia de la técnica de ligadura de la arteria cerebral media (MCA).
- Se observó una alta reproducibilidad de los volúmenes de infarto.
Conclusiones
- La ligadura de la MCA es un método confiable para estudiar la isquemia cerebral focal.
- Las tasas de supervivencia mejoradas contribuyen a la validez de los hallazgos.
- Esta técnica puede utilizarse para avanzar en la investigación de terapias contra el accidente cerebrovascular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El modelo de ligadura permanente de la arteria cerebral media proporciona un sistema reproducible para estudiar la isquemia cerebral focal, permitiendo la reducción mecanicista de riesgos de compuestos neuroprotectores en investigaciones preclínicas de accidente cerebrovascular. Al generar volúmenes de infarto consistentes en ratones, este método apoya la validación de dianas terapéuticas y el desarrollo de ensayos para candidatos terapéuticos dirigidos a necesidades no cubiertas en el accidente cerebrovascular isquémico. Su relevancia respecto a la patología humana—donde aproximadamente el 80 % de los accidentes cerebrovasculares ocurren en el territorio de la ACM—mejora la confianza traslacional y la selección de carteras en las fases iniciales del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en vías isquémicas mediante la inducción controlada de isquemia focal.
- Valor científico: Apoya la reducción de riesgos biológicos al aclarar la participación del blanco en la formación del núcleo de infarto y la penumbra.
- Valor operativo: Proporciona una cuantificación reproducible del infarto mediante tinción con TTC, facilitando una evaluación consistente del compromiso del blanco.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para la selección de compuestos mediante el establecimiento de un modelo de isquemia relevante para la enfermedad.
- Valor operativo: Estandariza la medición del infarto mediante volumetría basada en TTC, lo que permite un análisis cuantitativo de la respuesta dosis-respuesta.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad del ensayo con tasas de supervivencia de aproximadamente el 80 %, reduciendo la variabilidad en los resultados farmacológicos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Modela la patología humana del accidente cerebrovascular con una relevancia anatómica y fisiopatológica elevada para las infartos en la territorio de la arteria cerebral media.
- Valor científico: Permite la evaluación de los mecanismos de respuesta intracelular a la hipoxia in vivo, favoreciendo el descubrimiento de biomarcadores.
- Valor operativo: Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante protocolos quirúrgicos y de tinción estandarizados.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y la evaluación de la eficacia preclínica, proporcionando una plataforma para la reducción de riesgos mecanicistas de terapias para el accidente cerebrovascular.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre dianas neuroprotectoras al permitir un insulto isquémico controlado y la cuantificación del infarto.
- Tamizaje: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante tinción estandarizada con TTC, generando salidas cuantitativas del volumen de infarto para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Genera mediciones volumétricas (por ejemplo, un infarto de ~23 mm³ a las 24 h) que permiten comparaciones entre condiciones y la determinación del tamaño del efecto.
- Investigación Translacional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la localización del infarto que imita los patrones de accidente cerebrovascular humano, facilitando el avance ajustado al riesgo.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para evaluar múltiples compuestos en diversos proyectos debido a su reproductibilidad y puntos finales estandarizados.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías isquémicas.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante procedimientos estandarizados de craneotomía, ligadura y tinción con TTC.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos fiables de infarto, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas en programas de accidente cerebrovascular.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos neuroprotectores basándose en señales consistentes de eficacia preclínica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía de roedores e identificación neuroanatómica de la arteria cerebral media (MCA).
- Depende de instrumentos microquirúrgicos, incluyendo cauterizadores vasculares, mantas térmicas y herramientas de sutura de precisión.
- Necesita una estandarización entre equipos de los protocolos de anestesia, analgesia y monitoreo postoperatorio.
- Implica consideraciones de adaptación al trasladar las técnicas de modelos ratas a modelos ratones, incluyendo el tamaño de la sutura y la precisión de la oclusión.
- Limitado por la necesidad de puntos finales terminales para realizar la cuantificación del infarto mediante tinción con TTC o resonancia magnética (MRI).
