Aislamiento de monocitos de sangre total por selección inmunomagnética negativa
JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 4:27 min • July 8th, 2025
Para aislar monocitos, un tipo de glóbulo blanco, de sangre total mediante selección inmunomagnética negativa, obtenga sangre humana tratada con anticoagulante en un tubo. Agregue una solución de cóctel de anticuerpos que contenga anticuerpos bloqueadores del receptor Fc y complejos de anticuerpos tetraméricos biespecíficos.
Cada complejo de anticuerpos comprende dos anticuerpos monoclonales, con un anticuerpo específico para los antígenos de la superficie celular en las células no monocitarias, incluidos los glóbulos blancos y rojos, y el otro anticuerpo específico para el dextrano.
Agregue una solución de perlas magnéticas recubierta de dextrano. Incubar. El anticuerpo bloqueador del receptor Fc se une al receptor Fc de los monocitos, evitando la unión inespecífica de anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales en los complejos de anticuerpos reconocen y se unen a antígenos específicos de la superficie celular en las células no monocitarias, dejando los monocitos sin marcar. Las perlas magnéticas recubiertas de dextrano se unen al anticuerpo anti-dextrano de los complejos de anticuerpos, reticulando las células no monocíticas a las perlas.
Coloque el tubo en un soporte magnético. Bajo la influencia de un campo magnético de alto gradiente, las células reticuladas con perlas magnéticas se unen a las paredes del tubo, dejando los monocitos en el centro del tubo.
Pipetee la solución que contiene monocitos; transfiérala a un tubo nuevo. Agregue perlas magnéticas, reticulando las células restantes no deseadas. Colóquelo bajo la influencia de un campo magnético, enriqueciendo la población de monocitos.
Transfiera la suspensión de monocitos a un tubo nuevo. Centrifugar la suspensión. Vuelva a suspender los monocitos en un tampón para su posterior análisis.
Después de recolectar 40 mililitros de sangre entera humana fresca en cuatro tubos de vacío de EDTA de 10 mililitros, use una técnica estéril para transferir toda la sangre a un solo tubo cónico de propileno de 50 mililitros en un gabinete de bioseguridad. Siguiendo las instrucciones del fabricante de un kit de aislamiento de monocitos humanos seleccionado, agregue 2 mililitros de cóctel de aislamiento de monocitos del kit al tubo de sangre y agite las perlas magnéticas del kit durante 30 segundos.
Agregue 2 milímetros de perlas a la sangre y use una pipeta serológica de 25 mililitros para mezclar cuidadosamente las perlas con la sangre. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, divida la sangre en partes iguales entre cuatro tubos de 50 mililitros y agregue 30 mililitros de PBS estéril suplementado con 1 milimolar de EDTA a cada tubo. Mezclar nuevamente con una pipeta serológica de plástico de 25 mililitros y colocar los tubos en soportes magnéticos.
Después de 10 minutos, use una pipeta para extraer el contenido del centro de cada tubo, teniendo cuidado de no aspirar más de 1 mililitro de glóbulos rojos, y dispense el contenido del tubo en uno de los cuatro nuevos tubos de 50 mililitros. Agregue 500 microlitros adicionales de las perlas magnéticas en vórtice a cada tubo y mezcle suavemente la solución celular. Vuelva a colocar los tubos en los soportes magnéticos durante cinco minutos, antes de transferir cuidadosamente el contenido del centro de cada tubo a uno de los cuatro nuevos tubos de 50 milímetros.
Cuando se hayan transferido todas las suspensiones celulares, coloque cada nuevo tubo de 50 mililitros en los soportes magnéticos durante cinco minutos antes de transferir cuidadosamente el contenido del tubo a un tercer juego de cuatro nuevos tubos de 50 mililitros. Luego, recolecte las células por centrifugación y vuelva a suspender los cuatro gránulos celulares en un total de 10 mililitros de PBS estéril para su recuento.
Descripción general
Este artículo describe un método para aislar monocitos a partir de sangre total humana utilizando selección negativa inmunomagnética. El proceso implica el uso de cócteles de anticuerpos y perlas magnéticas para enriquecer la población de monocitos destinada a análisis posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Inmunología
- Hematología
Antecedentes
- Los monocitos son un tipo de glóbulo blanco importante para la respuesta inmunitaria.
- El aislamiento de monocitos es fundamental para estudiar su función y comportamiento.
- La selección negativa inmunomagnética es una técnica utilizada para enriquecer poblaciones celulares específicas.
- Este método minimiza la contaminación por otros tipos celulares.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para el aislamiento de monocitos a partir de sangre total.
- Mejorar la pureza de los monocitos aislados para aplicaciones posteriores.
- Facilitar la investigación sobre la biología de los monocitos y las enfermedades relacionadas.
Métodos Utilizados
- Recolección de sangre humana tratada con anticoagulante.
- Uso de cócteles de anticuerpos para dirigirse a células no monocíticas.
- Aplicación de microesferas magnéticas recubiertas con dextrano para la separación celular.
- Centrifugación y resuspensión de monocitos aislados en tampón.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de monocitos con contaminación mínima.
- Alto rendimiento de monocitos viables para análisis posteriores.
- Reproducibilidad del protocolo demostrada en múltiples ensayos.
Conclusiones
- El método descrito es eficaz para aislar monocitos de sangre humana.
- Esta técnica puede aplicarse en diversos entornos de investigación.
- Estudios futuros pueden aprovechar los monocitos aislados para la investigación inmunológica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de monocitos humanos primarios permite la investigación mecanicista de la función de las células inmunitarias en modelos de enfermedades inflamatorias e infecciosas. Este método apoya la validación de dianas al proporcionar un sistema celular purificado para evaluar los efectos de compuestos sobre vías mediadas por monocitos. Preparaciones de monocitos de alta pureza mejoran la confianza predictiva en estrategias preclínicas de reducción de riesgos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación funcional de objetivos específicos de monocitos en un contexto celular humano fisiológicamente relevante.
- Valor operativo: Reduce las señales engañosas provenientes de tipos celulares contaminantes durante estudios de interacción con el objetivo.
- Valor predictivo: Apoya la selección basada en hipótesis de compuestos inmunomoduladores con una mayor relevancia traslacional.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera un sustrato de monocitos consistente para el desarrollo estandarizado de ensayos en cascadas de cribado enfocadas en inmunología.
- Valor operativo: Proporciona un aislamiento celular reproducible que produce un material inicial uniforme para ensayos de respuesta a la dosis y cinéticos.
- Escalabilidad: Compatible con el procesamiento paralelo de múltiples muestras de donantes para la evaluación de la variabilidad poblacional.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Proporciona un sistema relevante para el ser humano para modelar mecanismos de enfermedades impulsados por monocitos antes de la validación in vivo.
- Valor operativo: Facilita los flujos de trabajo para el descubrimiento de biomarcadores al permitir ensayos de fosfo-flujo, secreción de citoquinas y fagocitosis.
- Reducción de riesgos: Mejora la confianza en el blanco al confirmar el mecanismo de acción en un tipo celular humano relevante para la enfermedad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta el desarrollo de ensayos y estudios mecanicistas preclínicos, permitiendo ciclos iterativos de diseño, síntesis y prueba.
- Biología del Descubrimiento: Apoya el aislamiento de monocitos para la investigación de vías y la reducción de riesgos de dianas en proyectos de inmunología.
- Cribado: Produce monocitos purificados adecuados para ensayos de cribado de alto contenido y lecturas funcionales.
- Analítica: Permite la medición cuantitativa de la activación de monocitos, la producción de citoquinas y la expresión de marcadores de superficie.
- Investigación Traslacional: Conecta los hallazgos in vitro con modelos de enfermedades humanas mediante fenotipos celulares consistentes.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo estandarizado de aislamiento aplicable en múltiples programas de inmunología e inflamación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco al reducir el ruido biológico proveniente de células no monocíticas.
- Valor operativo: Proporciona preparaciones estandarizadas y reproducibles de monocitos, minimizando la variabilidad entre experimentos.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción al ofrecer datos mecanicistas más limpios en las primeras etapas del proceso de descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en respuestas de monocitos humanos validadas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en manipulación aséptica de células y técnicas de separación magnética.
- Depende del acceso a kits de separación inmunomagnética y soportes magnéticos para tubos.
- Necesita la estandarización del momento de extracción de sangre y del uso de anticoagulantes en todos los centros.
- La adaptación a muestras de donantes criopreservadas o con enfermedades puede requerir optimización del protocolo.
- Limitación práctica: el rendimiento y la pureza de los monocitos pueden variar según el estado de salud del donante y los retrasos en el procesamiento de la muestra.
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Última actualización: 22 agosto 2026