Aislamiento de macrófagos del ganglio de la raíz dorsal del ratón mediante disociación mecánica

El ganglio de la raíz dorsal, o DRG, es un grupo de cuerpos celulares neuronales a lo largo de la médula espinal que transportan información sensorial desde el sistema nervioso periférico hasta el central. La lesión de los nervios periféricos provoca la acumulación de macrófagos en el GRD y el desarrollo de dolor neuropático.

Para aislar macrófagos viables utilizando un método libre de enzimas, tome tejido DRG de ratón recién disecado en un homogeneizador lleno de tampón helado para limitar el estrés celular. Usando un mortero, homogeneice mecánicamente el tejido para liberar las células.

Filtre a través de un filtro celular para eliminar los grumos celulares y obtener una suspensión unicelular en el flujo continuo. El homogeneizado de tejido contiene neuronas y células no neuronales, que incluyen macrófagos y mielina flotante, la vaina aislante de las neuronas.

Agregue el homogeneizado filtrado en un tubo que contenga un medio de gradiente de densidad y centrifuge. Bajo la fuerza centrífuga, las células viables con mayor densidad de flotación se depositan en el fondo del tubo para formar un gránulo, mientras que la mielina permanece suspendida. Deseche el sobrenadante.

Vuelva a suspender las células en un tampón que contenga anticuerpos conjugados con fluoróforos contra receptores de superficie celular específicos de macrófagos. Incubar durante el tiempo requerido. El anticuerpo se une a su receptor en las células de los macrófagos, marcando así fluorescentemente la superficie celular. Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.

Analice las células con un citómetro de flujo. Una señal de fluorescencia específica de anticuerpos indica la presencia de macrófagos en la muestra.

Antes de comenzar el experimento, prepare la solución de trabajo del medio de gradiente de densidad mezclando nueve volúmenes del medio con un volumen de HBSS 10X sin calcio y magnesio, y manténgalo en hielo. Confirme que el ratón está completamente anestesiado por la falta de respuesta al pellizco de la pata trasera.

Comience colocando un ratón anestesiado dentro de una campana extractora de gases químicos en posición supina con cuatro patas aseguradas con cinta adhesiva. Use fórceps para levantar la piel debajo de la caja torácica y luego, con unas tijeras quirúrgicas, haga una pequeña incisión para exponer el hígado y el diafragma. Con las mismas tijeras, corte el diafragma y la caja torácica, y luego abra la cavidad pleural para exponer el corazón que late.

A continuación, con unas tijeras de iris, corte rápidamente el apéndice auricular derecho. Una vez que se note el sangrado, inserte una aguja de calibre 30 en el extremo posterior del ventrículo izquierdo e inyecte lentamente 10 mililitros de PBS 1X preenfriado para perfundir al animal.

Para realizar la laminectomía dorsal, coloque al ratón en posición prona. Use un bisturí de tamaño 11 para hacer dos incisiones profundas laterales longitudinales comenzando desde la región torácica hasta la región sacra. Luego, retire la piel exponiendo la capa muscular dorsal. Luego, con Friedman-Pearson Rongeur, retire los tejidos conectivos y los músculos hasta que queden expuestos los procesos de la columna lumbosacra y los procesos transversales bilaterales.

Primero, use un Friedman-Pearson Rongeur para abrir con cuidado la columna vertebral dorsal. Luego, cambie entre una tijera de resorte Friedman-Pearson Rongeur y Noyes para eliminar los huesos vertebrales, exponiendo la médula espinal con los nervios espinales intactos unidos. Diseccionar cuidadosamente el DRG lumbar ipsilateral y contralateral.

Colóquelo en 1 mililitro de HBSS 1X sin calcio y magnesio helado en un homogeneizador de tejidos Dounce. Homogeneice el tejido DRG en el homogeneizador Dounce con un mortero suelto de 20 a 25 veces. Coloque un colador estéril de células de nailon de 70 micrómetros en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Use 800 microlitros de 1X HBSS helado para humedecer el colador celular.

Use una pipeta para recolectar la suspensión de tejido homogeneizado del homogeneizador en el filtro de células húmedas y recójala en el tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague el homogeneizador dos veces con 800 microlitros de 1X HBSS helado, recogiendo el líquido en el mismo tubo cónico de 50 mililitros para aumentar el rendimiento.

Agregue 1,5 mililitros de medio de gradiente de densidad isotónica helado equilibrado en un tubo FACS de poliestireno estéril de 5 mililitros. Transfiera el homogeneizado celular del tubo cónico de 50 mililitros a este tubo FACS y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.

Agregue 500 microlitros adicionales de 1X HBSS para sellar la parte superior. Centrifugar las células a 800 veces g durante 20 minutos a 4 grados centígrados. Aspire con cuidado el sobrenadante que contiene mielina en el medio, sin alterar el sedimento celular en el fondo del tubo.

Agregue 100 microlitros de PBS que contengan un 5% de suero fetal bovino al gránulo y vuelva a suspender las células DRG. Luego, agregue el anticuerpo CX3CR1-APC de ratón alfa a las células e incube en la oscuridad a 4 grados centígrados durante 1 hora.

Lave las células una vez con 5 mililitros de PBS. Centrifugar las células a 360 veces g durante 8 minutos a 4 grados centígrados. Aspire el sobrenadante y luego vuelva a suspender el sedimento celular en 300 microlitros de PBS para el análisis FACS.