Aislamiento de linfocitos de un parche de Peyer de ratón
JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 6:02 min • July 8th, 2025
Los parches de Peyer, PP, agregados de tejidos linfoides organizados en la pared del intestino delgado, contienen células inmunitarias que incluyen linfocitos B, linfocitos T, células dendríticas y macrófagos.
Para aislar linfocitos de PP de ratón, comience con un ratón sacrificado. Hacer una incisión en la pared abdominal, exponiendo la cavidad peritoneal. Localiza el ciego. Diseccione la unión ileocecal para separar el ciego del intestino delgado.
Extirpar el mesenterio e incidir el intestino delgado en el duodeno para extirpar el intestino delgado de la cavidad peritoneal. Coloque el intestino delgado en una placa de varios pocillos que contenga medio frío y enjuague para eliminar los residuos.
Coloque el intestino delgado con el lado mesentérico hacia abajo y humedezca con medio para mantener la hidratación de los tejidos. Identifique los PP: agregados blancos multilobulados en el lado antimesentérico de la pared intestinal.
Extirpe cuidadosamente los PP, excluyendo el tejido intestinal circundante. Transfiera a un tubo que contenga medio. Incubar bajo agitación constante. Este paso de agitación separa la mucosidad, los restos celulares y cualquier materia fecal de los PP, mejorando así la recuperación de los linfocitos PP.
A continuación, transfiera el tejido a un colador celular con un tamaño de malla adecuado. Altere suavemente los PP y libere las células. Enjuague con medio a través del colador para obtener una suspensión de linfocitos unicelulares. Centrifugar la suspensión a baja temperatura para mantener la estabilidad celular.
Vuelva a suspender los linfocitos en medio y utilícelos para análisis posteriores.
Comience colocando un ratón en posición supina y esterilizando el abdomen con etanol al 70%. Hacer una incisión abdominal en la línea media a través de la piel y el peritoneo desde el pubis hasta la caja torácica para abrir la cavidad peritoneal y localizar el ciego y la unión ileocecal.
Haga un corte lo más distal posible, en la unión para separar el intestino delgado del ciego, y corte el mesenterio con unas tijeras para eliminar cuidadosamente todo el intestino delgado hasta el esfínter pilórico.
Corte la unión entre el píloro y el duodeno para separar completamente el intestino delgado de la cavidad abdominal y coloque el intestino delgado aislado en un pocillo de una placa de seis pocillos que contenga medio RPMI frío, suplementado con suero fetal bovino al 10% o FBS en hielo. Luego, agite suavemente los pañuelos manualmente hasta que todos los segmentos estén sumergidos en el medio frío.
Cuando se hayan extraído todos los intestinos, use fórceps para agarrar la grasa mesentérica de un borde del intestino y coloque la muestra, con el lado mesentérico hacia abajo, sobre una toalla de papel. Humedezca todo el segmento intestinal con RPMI más 10% FBS para evitar la deshidratación y pegajosidad de los tejidos, y localice los parches de Peyer, que aparecen como agregados multilobulados blancos con forma de coliflor en el lado antimesentérico de la pared intestinal.
Para recolectar los parches de Peyer, use tijeras quirúrgicas curvas con la curva hacia arriba para extirpar suavemente cada parche de sus bordes distal y proximal, teniendo cuidado de excluir el tejido intestinal circundante, y coloque los parches de Peyer en pocillos individuales de una placa de 12 pocillos que contenga RPMI helado más 10% de FBS, en hielo, a medida que se recolectan.
Cuando se hayan adquirido todos los parches, use tijeras para cortar la punta de una punta de micropipeta de 1 mililitro para que el diámetro sea lo suficientemente grande como para aspirar parches de Peyer individuales, y transfiera los parches de Peyer a un tubo cónico de 150 mililitros por ratón, que contenga 25 mililitros de 37 grados Celsius RPMI más 10% de FBS.
Luego, coloque los tubos en un agitador orbital a 37 grados Celsius con agitación continua de 125 a 150 RPM durante 10 minutos. Al final de la agitación, transfiera los parches de Peyer a un colador celular de 140 micrómetros por ratón y use el extremo de goma del émbolo de la jeringa de 110 mililitros por animal para interrumpir suavemente los parches de Peyer a través de la malla en tubos cónicos individuales de 50 mililitros.
Enjuague los filtros con 15 a 20 mililitros de RPMI frío más 10% de FBS y recoja las células por centrifugación. Después de desechar cuidadosamente el sobrenadante, vuelva a suspender las células a aproximadamente 1 x 107 células por mililitro de RPMI más una concentración de FBS del 10% para el recuento. Luego, transfiera de 2 a 2.5 x 106 celdas por 200 microlitros de medio, a cada pocillo de una placa inferior redonda de 96 pocillos, y granular las celdas por centrifugación.
Resumen
Este artículo describe el aislamiento de linfocitos de las placas de Peyer (PP) en el intestino delgado de ratones. El procedimiento implica una disección y manipulación cuidadosas de los tejidos intestinales para obtener una suspensión celular viable destinada a análisis posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología Celular
- Neurociencia
Antecedentes
- Las placas de Peyer son tejidos linfoides organizados cruciales para la respuesta inmunitaria.
- Contienen diversas células inmunitarias, incluyendo linfocitos B y T.
- El aislamiento de estas células es esencial para estudiar las funciones inmunitarias.
- La metodología requiere técnicas quirúrgicas precisas para evitar contaminación.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para aislar linfocitos de las placas de Peyer de ratón.
- Mejorar el rendimiento de linfocitos viables con fines de investigación.
- Facilitar estudios posteriores sobre las respuestas inmunitarias en el intestino.
Métodos Utilizados
- Sacrificar al ratón y realizar una incisión abdominal media.
- Disecar el intestino delgado e identificar las placas de Peyer.
- Utilizar agitación para separar las células de las placas.
- Filtrar y centrifugar para obtener una suspensión de células individuales.
Resultados Principales
- Aislamiento exitoso de linfocitos de las placas de Peyer.
- Mejora en las tasas de recuperación de células viables mediante técnicas optimizadas.
- Establecimiento de un protocolo reproducible para estudios futuros.
Conclusiones
- El método descrito es efectivo para aislar linfocitos de las PP.
- Este protocolo puede ayudar a comprender la inmunidad intestinal.
- Las aplicaciones futuras pueden incluir estudios sobre respuestas inmunitarias y terapias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de linfocitos de las placas de Peyer de ratón permite reducir los riesgos mecanicistas de dianas en el tejido linfático asociado al intestino (GALT) en inmunología y en el desarrollo de vacunas mucosales. Este protocolo facilita la validación de dianas al proporcionar una fuente reproducible de linfocitos B y T primarios para ensayos funcionales, reduciendo la ambigüedad biológica en las fases iniciales del descubrimiento. El método mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al garantizar suspensiones celulares viables y libres de contaminación para análisis posteriores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en inmunidad intestinal mediante el aislamiento de linfocitos a partir de tejido linfático organizado.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo estandarizado de disociación de tejidos que mejora el recupero y la viabilidad de los linfocitos.
- Valor estratégico: Facilita la reducción del riesgo de dianas terapéuticas mediante la validación funcional de las respuestas de células inmunitarias en un sistema relevante para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera suspensiones de linfocitos de una sola célula adecuadas para citometría de flujo, perfilado de citoquinas y ensayos de cribado funcional.
- Valor operativo: Emplea filtración y centrifugación a baja temperatura para mantener la estabilidad celular y garantizar la reproducibilidad de los ensayos.
- Valor estratégico: Permite la preparación escalable de células inmunitarias primarias para cribado de alto contenido y alineación de biomarcadores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización de respuestas inmunitarias en mucosas relevantes para enfermedades al proporcionar linfocitos primarios de las placas de Peyer.
- Valor operativo: Establece un flujo de trabajo continuo desde la obtención del tejido hasta la suspensión celular, para su uso en estudios de validación preclínicos.
- Valor estratégico: Facilita la toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo al permitir lecturas mecanicistas en inmunomodulación dirigida al intestino.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El protocolo de aislamiento de linfocitos se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la identificación del blanco hasta la validación preclínica, apoyando las líneas de desarrollo de fármacos centradas en el sistema inmunitario.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en el tejido linfático asociado al intestino al proporcionar células inmunitarias primarias.
- Selección: Proporciona suspensiones de linfocitos listas para ensayos con rendimientos cuantificados para la evaluación reproducible de compuestos o estímulos.
- Análisis: Permite mediciones cuantitativas de variables dependientes, como el recuento celular, la viabilidad y la distribución de subpoblaciones, para análisis comparativos.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica mediante el uso de linfocitos primarios en ensayos inmunitarios funcionales.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de disociación de tejidos aplicable a proyectos de inmunología y terapias mucosas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de dianas mediante el uso de linfocitos primarios procedentes de un tejido linfático fisiológicamente relevante.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante pasos definidos de disección, agitación, filtración y centrifugación.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción de proyectos al reducir la ambigüedad mecanicista en programas inmunológicos tempranos.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de inmunomoduladores dirigidos al intestino basada en la función de linfocitos validada.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en anatomía murina y disección estéril de tejidos para aislar las placas de Peyer sin contaminación.
- Depende de un agitador orbital, filtros para células y equipo de centrifugación mantenidos a temperaturas controladas.
- Necesita estandarización entre los equipos en los protocolos de manipulación de tejidos, duración de la agitación y resuspensión celular.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la selección del tamaño de malla y la composición del medio para diferentes cepas de ratones o condiciones de los tejidos.
- Las limitaciones prácticas incluyen la variabilidad en el rendimiento del tejido y la necesidad de procesarlo inmediatamente para mantener la viabilidad de los linfocitos.
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Última actualización: 22 agosto 2026